Name: 表征在拟南芥胚方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习利用DIC显微镜和共聚焦激光扫描显微镜表征拟南芥胚胎发育过程中的模式形成。该方法结合GFP标记蛋白可视化技术，帮助研究人员在细胞水平上研究基因功能与生长素信号通路。

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感谢Jessica Habashi博士对本文稿的审阅。感谢中国首都师范大学生命科学学院影像中心的Xianyong Sheng博士协助完成DR5-GFP定位实验。本研究得到了北京市政府科学基金会（CIT&amp;#38;TCD20150102）和国家自然科学基金（31600248）的资助。

注意：本方案包含三个部分：1）观察野生型中的模式形成 拟南芥 使用微分干涉相差显微镜观察胚胎；2）表征胚胎的图式形成 通过 使用共聚焦激光扫描显微镜观察标志蛋白的表达；以及 3）确定特定基因在胚胎发生中的作用（使用 naa10 以突变体为例。
1. 胚珠透明化
<ol>
	<li>植物材料准备 
	注意：此处描述的方案是培养健康植物的一个示例；其他能够培养健康植物的方法同样适用。
	<ol>
		<li>将100粒种子加入1.5 mL离心管中，再加入1 mL 1.5%次氯酸钠溶液（将15 mL 10%氯溶液与85 mL水混合），浸泡5分钟以对种子进行表面灭菌。反复倒置离心管数次，确保种子与溶液充分混合，从而彻底灭菌。</li>
		<li>在1,200 × g条件下离心30秒，使种子沉降至管底，弃去上清液，并在实验台上用无菌水清洗种子四次，以去除残留的次氯酸钠。</li>
		<li>将4.4 g Murashige和Skoog（MS）基础盐混合物和10 g蔗糖加入1 L超纯水中，搅拌至盐和蔗糖完全溶解。用1 M KOH调节溶液pH至5.8，加入3 g凝胶剂（如Phytagel），将MS-蔗糖溶液在121 °C下灭菌15分钟，制得MS培养基。</li>
		<li>将30 mL MS培养基倒入12 cm培养皿中，制成MS平板。</li>
		<li>将灭菌后的种子接种于MS平板上，将平板转移至培养室，在种子分层处理（4 °C黑暗条件下处理3天）后，置于长日照条件下培养（光照16小时，22 °C；黑暗8小时，18 °C）。</li>
		<li>培养8天后，将幼苗移栽至育苗盘中的土壤内（营养土与蛭石按1:1比例混合），用白色透明盖子覆盖育苗盘5天以减少水分蒸发，同时留出缝隙以防止植株玻璃化。</li>
		<li>移除盖子，将植株置于步入式培养室中，在长日照条件下继续培养（见步骤1.1.5）。每日6:00开灯，22:00关灯。在培养室中生长约20天后，植株将开花并形成角果。</li>
		<li>在晚上20:00，用细线标记花序中花梗位置的花芽（避免使用第一至第三朵花芽；由这些花芽发育而来的角果通常含有较多败育种子，可能影响正常与异常胚珠的比例）。将胚珠受精的起始时间定义为次日早晨8:00标记的花芽开放开花的时刻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>霍耶氏溶液（Hoyer's solution）的配制
	<ol>
		<li>将24 g水合氯醛加入50 mL离心管中，并用铝箔完全包裹管体（水合氯醛溶液在光照下不稳定）。</li>
		<li>向上述管中加入9 mL超纯水和3 mL甘油，振荡使水合氯醛充分溶解。配制完成后，将管置于室温下静置过夜，以消除溶液中的气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚珠分离与透明处理
	<ol>
		<li>将一段双面胶带贴于显微镜载玻片上。取授粉后特定天数（DAP）的角果，将其置于载玻片上，使假隔膜方向垂直于玻片表面；此方向便于用针分离子房（图1A 和 1B）。</li>
		<li>用注射器针头沿假隔膜两侧切开子房，将两个分离的子房贴附于载玻片上，使角果内的胚珠可在体视显微镜下清晰可见（图1C 和 1D）。</li>
		<li>在载玻片上滴加70 µL霍耶氏溶液，将精细镊子的尖端浸入霍耶氏溶液中润湿。在体视显微镜下，用镊子将胚珠移入玻片上的霍耶氏溶液中以清洗胚胎。轻轻加盖盖玻片，避免产生气泡。</li>
		<li>将制备好的玻片置于暗处盒中，室温下静置2–12小时（胚珠越成熟，所需时间越长）。2/4细胞期胚胎（授粉后1–2天，1–2 DAP）可在2小时后观察；八分体至早期球形胚阶段（3 DAP）的胚胎需静置4小时后观察；更成熟的胚胎（4–8 DAP）则需静置12小时后观察。</li>
		<li>使用显微镜的微分干涉差（DIC）功能观察透明处理后的胚珠。先在低倍镜（10X）下定位胚胎，再转换至高倍镜（100X油镜）观察发育中胚胎的细胞结构。</li>
		<li>观察不同发育阶段的胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过标记蛋白表达的观察表征胚胎模式形成与细胞身份
<ol>
	<li>植物材料的准备
	<ol>
		<li>克隆标记基因或激素响应元件的启动子和编码序列，然后将其与荧光蛋白（如 GFP）融合；接着将构建好的片段插入双元载体（如 pCambia1300）中。此处以生长素响应元件 DR5 为例10。</li>
		<li>通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的转化方法，将构建好的 DR5-GFP 质粒导入野生型植物中11。使用含有潮霉素的MS培养基平板（母液50 mg/mL，按1:1,000稀释）筛选T1代植株。在1.1.5所述条件下培养8天后，转基因植株将表现出较长的根，并长出两片莲座叶。</li>
		<li>将转基因植株转移至土壤中，按照1.1.6和1.1.7所述条件进行培养。</li>
		<li>从独立的T1代株系中收集T2代种子。将种子播种于含潮霉素的MS平板上，筛选含有单拷贝DR5-GFP插入的植株（抗性植株与敏感植株的比例约为3:1），然后将其移栽至土壤中。</li>
		<li>按照1.1.6和1.1.7所述条件培养T2代植株。</li>
		<li>从T2代植株中收集T3代种子。将种子播种于含潮霉素的MS平板上，筛选纯合的转基因植株（单个株系的所有植株均表现出潮霉素抗性），然后将其移栽至土壤中。</li>
		<li>按照1.1.8所述方法对纯合T3代植株的花蕾进行标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP信号观察
	<ol>
		<li>将3 mL甘油与47 mL超纯水混合，配制6%甘油溶液。</li>
		<li>在玻璃载玻片上贴一段双面胶带，并按照1.3.1所述方法固定一个角果。</li>
		<li>在体视显微镜下，用注射器针头沿假隔膜两侧切开子房，并将解剖得到的两个子房壁按照1.3.2所述方法贴附在载玻片上。</li>
		<li>在载玻片上滴加30 µL 6%甘油溶液，用精细镊子将解剖所得子房中的所有胚珠放入溶液中，然后轻轻盖上盖玻片。</li>
		<li>由于每个胚珠的种皮和胚乳可能阻碍胚胎中GFP信号的观察，需将胚胎从胚珠中分离出来。快速而轻柔地敲击载玻片，使胚胎从胚珠中挤出（胚珠越成熟，施加于载玻片的力度应越小）。</li>
		<li>使用共聚焦激光扫描显微镜观察载玻片上的GFP荧光。先在低倍镜（10X）下找到分离的胚胎并记录其位置，然后切换至高倍镜（100X油镜），将激发光源设为488 nm，以检测GFP信号，观察胚胎中DR5-GFP的表达情况。</li>
		<li>检测胚胎中的GFP表达，以选择适合进一步分析的T3代株系。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过胚珠透明化和标记蛋白观察对胚胎致死突变体中胚胎模式形成的表征：Naa10 为例
<ol>
	<li>naa10 突变体植株中的胚胎模式形成
	<ol>
		<li>按照 1.1.1–1.1.7 中所述准备植物材料。</li>
		<li>使用基因特异性引物通过 PCR 鉴定 naa10+/− 植株5，然后按照 1.1.8 中所述标记 naa10+/− 植株的花蕾。</li>
		<li>按照 1.2 和 1.3 中所述对 naa10+/− 胚胎进行胚珠透明化处理及显微观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用 naa10 胚胎进行标记蛋白分析
	<ol>
		<li>按照 2.1–2.2 中所述步骤获得合适的 DR5-GFP 转基因株系。</li>
		<li>将纯合的 DR5-GFP 转基因株系与 naa10+/− 植株杂交，获得在 F2 代中对 GFP 荧光标记呈纯合状态的 naa10+/− 植株（通过基因特异性 PCR 鉴定），以表征 naa10+/−5 并利用纯合的 DR5-GFP 株系在显微镜下观察 GFP 信号。</li>
		<li>按照 2.1.7 中所述标记对 DR5-GFP 呈纯合状态的 naa10+/− 植株的花蕾。</li>
		<li>按照 2.2 中所述在对 DR5-GFP 呈纯合状态的 naa10 胚胎中检测 GFP 信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

胚珠清除法是一种在胚胎发育过程中检测细胞分裂和评估形态的有用方法 拟南芥；利用该技术，可直接在微分干涉差显微镜下观察胚胎5,12胚珠透明化的关键步骤是步骤1.3.4。该步骤中胚珠透明所需时间具有可变性。在Hoyer's溶液中处理2小时后，可清晰观察到处于2细胞/4细胞阶段的胚胎，而处理12小时后则变得不清晰。因此，胚珠越成熟，所需透明时间越长。
在步骤 2.2.5 中，为了从胚珠中分离胚胎，施加在载玻片上的力度至关重要。如果施加的力过大，胚胎可能会被压碎；然而，如果施加的力过小，则无法将胚胎从胚珠中挤出。根据我们的经验，胚珠越成熟，所需施加的力越小。鱼雷形胚和成熟胚胎可直接用注射器针头切开胚珠后剥离获得。由于在分离过程中部分悬垂细胞可能被破坏，分离得到的胚胎中悬垂细胞的荧光信号可能会丢失或不完整。该方法的另一个局限性在于，四细胞阶段之前的胚胎因体积过小且被胚珠碎片遮蔽，难以从挤出的材料中找到。
<p class="jove_content"...

胚胎发生是高等植物发育的最初事件。在严格的遗传调控下，合子通过细胞分裂和分化形成成熟的胚胎1,2。拟南芥胚胎是研究形态建成调控的有用模型，因为在胚胎发生过程中，细胞分裂的顺序遵循一种可预期的模式3,4。然而，含有一个或几个细胞的拟南芥胚胎过于微小，难以观察和分析。此外，某些基因的突变可导致胚胎致死5，表明这些基因在胚胎发生中具有关键作用。对胚胎致死突变体中模式形成的表征，为理解关键基因如何调控胚胎发育的分子机制奠定了基础。
本文详细描述了通过直接显微观察对模式植物Arabidopsis胚胎模式形成进行表征的实验方法。该方法包括胚珠透明化处理，随后对胚胎进行显微观察。文中还介绍了胚胎致死突变体的表征方法。
通过使用Hoyer's溶液透明处理的胚珠，可以直接利用显微镜观察不同发育阶段胚胎的形态6,7。此类透明处理后的胚珠具有较高的折射率，因此该胚珠透明方法特别适用于需通过微分干涉差（DIC）显微镜观察的样品。
此外，在胚胎发生过程中于特定细胞或少数细胞中表达的基因可作为标记物，用于识别胚胎中的细胞。因此，可通过共聚焦激光扫描显微镜监测GFP标记的标记蛋白的表达，来注释胚胎发生过程中的细胞身份特化。相反，观察功能未知基因与GFP融合蛋白在胚胎发生过程中的表达模式，可建立胚胎图式形成与该基因表达之间的关联，并有助于鉴定拟南芥（Arabidopsis）胚胎发生所必需的新基因。
本文所述方法还可用于鉴定胚胎致死型突变体的表型，并确定受影响基因在细胞水平上对胚胎发育的影响。此外，结合野生型与突变体植物在胚胎发育过程中标记基因表达模式的比较，该方法可为参与胚胎发育的分子机制和信号通路提供线索8,9。事实上，该方法已应用于naa10突变体植物，研究发现突变体中胚根顶端细胞的异常分裂可能源于胚胎发育过程中生长素分布的改变5。

<table><tbody><tr><td>水合氯醛</td><td>Sigma</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>MS基础培养基（Murashige和Skoog）</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>植物凝胶（Phytagel）</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>生长培养箱</td><td>Percival</td><td>CU36L5</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss Image M2</td><td>相机：AxioCam 506 color</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss LSM 5</td><td>滤光片：BP 495 - 555 nm</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Axio Zoom V16</td><td>相机：AxioCam MRc5</td></tr><tr><td>营养丰富的土壤</td><td>KLASMANN，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 次氯酸钠溶液</td><td></td><td></td><td>国产分析纯试剂</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td></td><td></td><td>国产分析纯试剂</td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td></td><td></td><td>国产分析纯试剂</td></tr><tr><td>甘油</td><td></td><td></td><td>国产分析纯试剂</td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td>国产耗材</td></tr><tr><td>蛭石</td><td></td><td></td><td>国产耗材</td></tr><tr><td>载玻片</td><td></td><td></td><td>国产耗材</td></tr><tr><td>注射器针头</td><td></td><td></td><td>国产耗材</td></tr><tr><td>尖头镊子</td><td></td><td></td><td>国产耗材</td></tr><tr><td>超净工作台</td><td></td><td></td><td>国产设备</td></tr></tbody></table>

一种表征胚胎发生的方法 拟南芥

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

鉴于其发育过程具有高度可预测性， 拟南芥 胚胎已被用作研究植物形态发生的模型。然而，植物胚胎的早期阶段体积微小且细胞数量较少，难以观察与分析。本文描述了一种利用模式生物在显微镜下对植物胚胎模式形成进行表征的方法。 拟南芥在使用Hoyer's溶液清除新鲜胚珠后，可通过100倍油镜下的微分干涉差显微镜观察胚胎的细胞数目和形态，并确定其发育阶段。此外，利用共聚焦激光扫描显微镜监测绿色荧光蛋白（GFP）标记的特定标记蛋白的表达，以注释胚胎模式形成过程中的细胞命运决定。因此，该方法可用于在细胞和分子水平上观察野生型植物胚胎的模式形成，并通过比较野生型植株与胚胎致死突变体中胚胎的模式形成，来鉴定特定基因在胚胎模式形成中的作用。该方法可用于研究胚胎发生过程中的 拟南芥.

本文所述方法可用于在显微镜下直接观察胚胎发育过程，利用特异性标记物注释胚胎发育过程中的细胞命运决定，并表征特定基因在胚胎发育中的作用。
野生型胚胎模式形成分析的代表性结果（从拉长的合子阶段到成熟的棒状幼虫阶段） 拟南芥 如图所示 图2卵珠清除后，可通过微分干涉差显微镜（DIC显微镜）区分不同发育阶段的胚胎（图2）。其表达模式 DR5-GFP 在胚胎发育过程中，通过共聚焦激光扫描显微镜记录图3) 以确定生长素在胚胎中的分布，并研究生长素在胚胎发育过程中可能发挥的作用 拟南芥.
该方案还可用于表征特定基因在...

本方案概述了一种观察胚胎发生的方法 拟南芥 通过胚珠透明化处理后在显微镜下观察胚胎模式的形成。

鉴于其发育过程的高度可预测性，拟南芥胚胎已被用作植物形态发生研究的模式材料。然而，……

本方法的总体目标是利用模式生物对植物胚胎发育过程中的胚胎图式形成进行表征。该方法有助于回答植物学领域的一些关键问题，例如拟南芥的胚胎发育。该技术的主要优势在于，可通过推荐的操作步骤对模式植物拟南芥的胚胎图式形成过程进行表征。演示该实验步骤的是我实验室的研究生 Jinlin Feng。开始此操作时，将 100 粒种子加入一个 1.5 毫升离心管中。加入 1 毫升次氯酸钠溶液以对种子进行表面消毒。将试管倒置数次，确保种子与溶液充分混匀。5分钟后，在1200 G下离心30秒。弃去上清液，并用无菌水洗涤种子4次，以去除残留的次氯酸钠。接下来，将4.4克MS基本盐混合物和10克蔗糖加入1升超纯水中。搅拌至盐和蔗糖完全溶解。使用1 mol的氢氧化钾将溶液的pH值调节至5.8。然后，加入3克凝固剂，并在121摄氏度下灭菌15分钟。将30毫升配制好的MS培养基倒入直径12厘米的培养皿中。将灭菌后的种子置于MS培养基平板上。将培养皿转移至冰箱中，在避光条件下于4°C保存三天，以对种子进行春化处理。随后，将培养皿置于长日照条件下的生长室中培养八天。然后，将植株移栽至托盘中的土壤内。用透明白色盖子盖住托盘以防止水分流失。留出一个小缝隙，以避免植物玻璃化。五天后，移除盖子，并将植物置于人工气候室中，在长日照条件下培养。生长约20天后，在晚上8:00用细线标记10至15个花蕾，位置位于种子 stalk 和花序处。当标记的花蕾次日早晨8:00开放时，定义为胚珠授粉的开始。开始准备Hoyer's溶液时，将24克氯氢酸盐加入50毫升离心管中。用铝箔完全包裹离心管，确保铝箔完全避光。加入 9 mL 超纯水和 3 mL 甘油。振荡试管以溶解盐酸盐。然后将配制好的 Hoyer 氏溶液在室温下静置过夜，以消除所有气泡。首先，将一片双面胶带贴附在显微镜玻璃载片上。取一个授粉后培养了所需天数的角果，将其放置在胶带上，使假隔膜一侧垂直于载片表面。使用注射器针头沿假隔膜两侧切开果瓣。接下来，将解剖好的两个腕骨附着在载玻片上，使胚珠和角果在体视显微镜下可见。在玻璃载玻片上加入70微升Hoyer's溶液，然后将一对尖头镊子浸入溶液中，以润湿镊子尖端。使用体视显微镜和镊子将胚珠移入霍耶氏溶液中以清洗胚胎。随后，轻轻将盖玻片覆盖在载玻片上，注意避免产生气泡。将制备好的载玻片放入盒中，置于暗室中，室温下放置 2 至 12 小时。在必要时间过后，使用显微镜的微分干涉差（DIC）功能观察已透明化的胚珠。先在低倍视野下定位胚胎，然后转换至高倍视野，观察发育中胚胎的细胞模式。随后，观察处于不同发育阶段的胚胎。首先，制备 DR5 GFP 质粒，并按照文本方案所述，通过农杆菌介导的转化方法将其导入野生型植物中。使用含有水解酪蛋白的 MS 培养基平板筛选 T1 代植株。然后，按照文本方案所述转移并培养植株，以获得 T3 代植株。使用细线在晚上8:00对纯合T3植株的花蕾进行标记，标记位置为花序上果柄的位置。随后，将3毫升甘油与47毫升超纯水混合，配制6%甘油溶液。然后将一段双面胶带贴在显微镜玻片上。将T3植株的一个角果放置在玻片上，使假隔膜垂直于玻片表面。使用注射器针头，沿假隔膜两侧切开子房室。将解剖好的两个子房室固定在载玻片上，使胚珠和角果在体视显微镜下可见。随后，向载玻片上滴加 30 微升 6% 甘油。将一对尖头镊子浸入溶液中以润湿尖端。在体视显微镜下用镊子将胚珠移入甘油溶液中。轻轻将盖玻片盖在载玻片上。然后，快速而轻柔地轻敲载玻片，使胚胎从胚珠中挤出。接着，使用共聚焦激光扫描显微镜观察载玻片上的绿色荧光蛋白荧光。在低倍视野下找到分离的胚胎，并记录其位置。切换至高倍视野，并将激发光源设置为 488 纳米，以观察胚胎中 GR5 GFP 的表达。随后检测 GFP 表达，并根据文本方案中所述对胚胎的模式形成进行表征。在本研究中，拟南芥的胚胎发育通过胚珠透明化方法进行观察，如图所示。胚珠清除后，可利用微分干涉差显微镜区分不同发育阶段的胚胎。随后在共聚焦激光扫描显微镜下记录 GR5 GFP 在胚胎发育过程中的表达模式。结果显示，DR5 在野生型球形期和心形期胚胎的根极部位表达。DR5 在胚胎子叶尖端以及成熟野生型胚胎的维管组织中均有表达。此后，研究拟南芥胚胎发生过程中 naa10 的作用。观察到的假设是，与野生型植株的横向不对称分裂相比，naa10 中的细胞分裂异常，表现为偏斜和垂直分裂。如图所示，在球形期的大多数 naa10 胚中，oxen 呈几乎均匀分布，与野生型胚相比，在假说中保留了更广泛的信号。这些结果表明，naa10 对胚胎发育是必需的，并且其可能通过拟南芥中的 oxen 信号通路发挥作用。在进行该实验操作时，重要的是要记住如何种植拟南芥以获取植物材料。完成此操作后，还可进行其他检测，例如原位杂交，以回答有关细胞特异性基因表达等进一步的问题。该技术建立后，为胚胎发育领域研究人员探索特定基因介导拟南芥胚胎发育的分子机制提供了途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对拟南芥的胚胎发育过程进行表征。

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一种表征胚胎发生的方法拟南芥

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