一种表征胚胎发生的方法 拟南芥

本方法的总体目标是利用模式生物表征植物胚胎发育过程中胚胎的图式形成。该方法有助于回答植物学领域的一些关键问题，例如拟南芥的胚胎发育。该技术的主要优势在于，可通过推荐的操作步骤对模式植物拟南芥中的胚胎图式形成进行表征。

演示该实验步骤的是我实验室的研究生 Jinlin Feng。开始此操作时，将100粒种子加入一个1.5毫升离心管中。加入1毫升次氯酸钠溶液以对种子进行消毒。

将离心管颠倒数次，确保种子与溶液充分混匀。5分钟后，在1200 ×g条件下离心30秒。弃去上清液，并用无菌水洗涤种子4次，以去除残留的次氯酸钠。

接下来，将4.4克MS基本盐混合物和10克蔗糖加入1升超纯水中。搅拌至盐和蔗糖完全溶解。使用1 mol的氢氧化钾将溶液的pH值调节至5.8。

然后，加入3克凝固剂，并在121摄氏度下灭菌15分钟。将30毫升配制好的MS培养基倒入直径12厘米的培养皿中。将灭菌后的种子置于MS培养基平板上。

将培养皿转移至冰箱中，在避光条件下于4 °C保存三天，以对种子进行春化处理。随后，将培养皿置于长日照条件的培养室中培养八天。然后，将植株移栽至托盘中的土壤内。

用透明白色盖子盖住托盘，以防止水分流失。留出一个小缝隙，以避免植物玻璃化。五天后，移除盖子，并将植物置于步入式培养室中，在长日照条件下培养。

生长约20天后，于晚上8:00用细线标记10至15个花蕾，位置位于果柄和花序处。当标记的花蕾次日早晨8:00开放时，定义为胚珠授粉的开始时间。开始配制Hoyer's溶液时，将24克氯甘油加入50毫升离心管中。用铝箔完全包裹该离心管，确保铝箔密封严实，隔绝所有光线。

加入 9 mL 超纯水和 3 mL 甘油。振荡试管以溶解盐酸盐。然后将配制好的 Hoyer 氏溶液在室温下静置过夜，以消除所有气泡。

首先，将一片双面胶带贴附在显微镜玻片上。取一个授粉后生长了所需天数的角果，将其放置在胶带上，使假隔膜一侧与玻片表面垂直。使用注射器针头，沿假隔膜两侧切开心皮。

接下来，将两个解剖好的子房固定在载玻片上，使胚珠和角果在体视显微镜下可见。在玻璃载玻片上滴加70 µL Hoyer's溶液，然后将一对尖头镊子浸入溶液中，以润湿镊尖。

使用体视显微镜和镊子将胚珠移入Hoyer's溶液中以清洗胚胎。随后，轻轻将盖玻片盖在载玻片上，注意避免产生气泡。将制备好的载玻片放入盒中，置于暗处，室温下放置2至12小时。

在所需时间结束后，使用显微镜的微分干涉差（DIC）功能观察已透明化的胚珠。先在低倍视野下找到胚胎，然后转换至高倍视野，观察发育中胚胎的细胞模式。随后，观察处于不同发育阶段的胚胎。

首先，制备 DR5 GFP 质粒，并按照文本方案所述，通过根癌农杆菌介导的转化方法将其导入野生型植物中。使用含有水解酪蛋白的 MS 培养基平板筛选 T1 代植株。然后，按照文本方案所述转移并培养植株，以获得 T3 代植株。

使用细线在晚上8:00对纯合T3植株的花蕾进行标记，标记位置为花序上果柄的位置。随后，将3毫升甘油与47毫升超纯水混合，配制6%甘油溶液。然后将一段双面胶带贴在显微镜玻片上。将T3植株的一个角果放置在玻片上，使假隔膜垂直于玻片表面。

使用注射器针头，沿假隔膜两侧切开子房室。将解剖好的两个子房室固定在载玻片上，使胚珠和角果在体视显微镜下可见。随后，向载玻片上滴加30 µL的6%甘油。

将一对尖头镊子浸入溶液中以润湿镊尖。在体视显微镜下用镊子将胚珠移入甘油溶液中。轻柔地将盖玻片盖在载玻片上。

然后，快速而轻柔地轻敲载玻片，使胚胎从胚珠中挤出。接着，使用共聚焦激光扫描显微镜检测载玻片上的绿色荧光蛋白荧光信号。在低倍视野下找到分离的胚胎，并记录其位置。

转换至高倍视野，并将激发光源设置为 488 纳米，以观察胚胎中 GR5 GFP 的表达。随后检测 GFP 的表达，并根据文本方案中所述对胚胎的模式形成进行表征。在本研究中，拟南芥的胚胎发生通过胚珠透明化方法进行观察，如图所示。

珠心组织清除后，可利用微分干涉差显微镜区分不同发育阶段的胚胎。随后在共聚焦激光扫描显微镜下记录 GR5 GFP 在胚胎发育过程中的表达模式。DR5 在野生型球形期和心形期胚胎的根极区域呈现表达。

DR5 在胚胎子叶尖端以及成熟野生型胚胎的维管组织中均有表达。此后，研究进一步探讨了 naa10 在拟南芥胚胎发育过程中的作用。观察到的假设是，与野生型植株的横向不对称分裂相比，naa10 突变体中的细胞分裂异常，表现为偏斜和垂直分裂。

如图所示，在球形期的大多数 naa10 胚中，OXEN 呈几乎均匀分布，并且与野生型胚相比，在假说中保留了更广泛的信号。这些结果表明，naa10 对胚胎发育是必需的，并且其可能通过拟南芥中的 OXEN 信号通路发挥作用。在进行该实验操作时，重要的是要记住如何种植拟南芥以获取植物材料。

完成此操作后，还可进行原位杂交等其他检测，以回答更多问题，例如细胞特异性基因的表达情况。该技术建立后，为胚胎发生领域研究人员探索特定基因介导拟南芥胚胎发生的分子机制提供了途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何对拟南芥的胚胎发生过程进行表征。