Name: 脐带血诱导的多能干细胞的软骨形成颗粒形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 了解从脐带血诱导多能干细胞生成软骨形成颗粒的方法。该技术可大规模生产软骨颗粒，用于疾病建模和药物筛选，为软骨修复研究提供重要工具。

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本工作获得了韩国医疗技术研究开发项目（Korea Healthcare Technology R&amp;#38;D项目，卫生福利部 &amp;#38; 家庭事务，大韩民国（HI16C2177）。

本方案已获得韩国天主教大学机构审查委员会的批准（KC12TISI0861）。用于重编程的脐带血单个核细胞（CBMCs）直接取自首尔圣玛丽医院脐带血库。
1. 从诱导多能干细胞诱导软骨形成分化
<ol>
	<li>CBMC-iPSC 的生成
	<ol>
		<li>使用我们先前研究中所述的方案生成 CBMC-hiPSCs23。</li>
		<li>将血细胞收集至 15 mL 圆锥形离心管中，并使用血细胞计数板进行计数。</li>
		<li>准备 3 × 105 个细胞，在室温下以 515 × g 离心 5 分钟。用抽吸法弃去上清液，并将细胞重悬于 0.5 mL 血细胞培养基中。</li>
		<li>将细胞转移至未包被的 24 孔板的一个孔中，并按照生产商的建议加入仙台病毒混合物。</li>
		<li>将培养板在 30 °C 下以 1,150 × g 离心 30 分钟。</li>
		<li>离心后，在 37 °C、5% CO2 条件下过夜（O/N）培养细胞。</li>
		<li>次日，将转导后的细胞转移至基质包被的孔中。在 30 °C 下以 1,150 × g 离心培养板 30 分钟。</li>
		<li>离心后，弃去上清液，加入 1 mL iPSC 培养基，并在 37 °C、5% CO2 条件下过夜维持细胞。</li>
		<li>将贴壁细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下维持培养，每日更换新鲜 iPSC 培养基。 
		注：转导后第 14–21 天可见克隆形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EB 的生成
	<ol>
		<li>将 hiPSCs 在 37 °C 和 5% CO2 条件下维持培养，每日更换新鲜 Essential 8（E8）培养基。</li>
		<li>在经玻连蛋白包被的 100 mm 培养皿中，用 E8 培养基接种 2 × 106 个 hiPSCs。</li>
		<li>从培养皿中移除 E8 培养基，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。</li>
		<li>加入 1 mL 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 2 分钟。</li>
		<li>用 3 mL E8 培养基收集细胞，转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中，在室温（RT）下以 250 × g 离心 2 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀，将细胞重悬于 5 mL E8 培养基中。</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞，为每个 100 mm 无菌培养皿准备 2 × 106 个细胞。将细胞重悬于 10 mL E8 与 EB 培养基（1:1）的混合液中，并加入 10 µM Rho 相关激酶（ROCK）抑制剂。</li>
		<li>在 37 °C 和 5% CO2 条件下过夜孵育，以促进细胞聚集。</li>
		<li>次日，通过移液收集聚集形成的 EBs，以 250 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，并将 EBs 重悬于 10 mL 新鲜 E8 培养基中。</li>
		<li>在新鲜 E8 培养基中扩增 EBs 5 天，每日更换培养基。为进一步促进成熟，将培养基更换为 E7 培养基，在 37 °C 和 5% CO2 条件下继续维持 5 天，每日更换新鲜 E7 培养基。 
		注：E7 培养基为不含 FGF2 的 E8 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 EBs 诱导外生长细胞
	<ol>
		<li>向 100 mm 培养皿中加入 6 mL 1% 明胶，在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 30 分钟。</li>
		<li>移除明胶，并在使用前将培养皿完全干燥 2–3 小时。</li>
		<li>将 EBs 转移至 50 mL 圆锥形离心管中，静置使 EBs 沉降至管底，小心吸除上清液，避免扰动 EBs。</li>
		<li>用含 20% 胎牛血清（FBS）的 10 mL DMEM 重悬 EBs，转移至明胶包被的 100 mm 培养皿中，并加入 10 µM ROCK 抑制剂。</li>
		<li>在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育并维持培养 7 天，每隔一天更换一次培养基，不添加 ROCK 抑制剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>软骨形成细胞球体的构建
	<ol>
		<li>吸除培养皿中的培养基，用 PBS 洗涤细胞三次。</li>
		<li>加入 1 mL 1 mM EDTA，在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 2 分钟。</li>
		<li>用含 20% FBS 的 5 mL DMEM 收集细胞，转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>在室温下以 250 × g 离心 2 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含 20% FBS 的 10 mL DMEM 中。</li>
		<li>使用 40 µm 细胞筛过滤，去除细胞团块，收集单细胞，并使用血细胞计数板计数。</li>
		<li>在室温下以 250 × g 离心 2 分钟，弃去上清液，将每份 3 × 105 个细胞接种于含 300 µL 软骨分化培养基（CDM）的 15 mL 圆锥形离心管中，形成单个细胞球体。</li>
		<li>为形成细胞球体，在室温下以 680 × g 离心 5 分钟。 
		注：软骨细胞球体在分化期间始终维持于 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>在 37 °C 和 5% CO2 条件下过夜孵育细胞。</li>
		<li>每 2–3 天更换一次 CDM。3 天内，细胞球体将呈现扁平的球形形态。在 37 °C 和 5% CO2 条件下维持培养 21 天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过染色法对软骨形成细胞团进行表征
<ol>
	<li>软骨形成包埋
	<ol>
		<li>包埋前，在58 °C下准备并熔化石蜡。</li>
		<li>在1.5 mL离心管中，用1 mL 4%多聚甲醛于室温固定细胞团块2小时。 
		注意：多聚甲醛具有高毒性。避免接触眼睛、皮肤或黏膜。配制时应尽量减少暴露，并避免吸入。</li>
		<li>将一层纱布放入包埋盒中，用移液器转移已固定的团块。将纱布折叠覆盖团块后，盖上包埋盒盖。</li>
		<li>在100 mL 70%乙醇（EtOH）中进行两次脱水，每次10分钟。随后依次在80%和95% EtOH中各洗涤10分钟完成脱水。</li>
		<li>将团块转移至100% EtOH中10分钟。更换新鲜EtOH重复此步骤三次。</li>
		<li>进行&#34;透明&#34;处理：先用100 mL EtOH与二甲苯按1:1比例混合的溶液处理10分钟，再用1:2比例的混合液处理10分钟。随后将团块在100%二甲苯中孵育两次，每次10分钟，以彻底清除残留的EtOH。</li>
		<li>进行石蜡浸润：将团块依次置于二甲苯与石蜡的混合液中。整个石蜡浸润过程在58 °C下进行。先将团块置于100 mL二甲苯与石蜡按2:1比例混合的溶液中孵育30分钟。</li>
		<li>更换为100 mL二甲苯与石蜡按1:1比例混合的溶液，孵育30分钟。</li>
		<li>更换为100 mL二甲苯与石蜡按1:2比例混合的溶液，孵育30分钟。</li>
		<li>最终浸润步骤：将团块转移至第一缸100%石蜡中，孵育2小时。</li>
		<li>将团块转移至第二缸100%石蜡中，在58 °C下过夜孵育（O/N）。</li>
		<li>次日，用镊子轻轻将团块转移至模具中。从石蜡分配器向模具中加入石蜡，并在4 °C下固化30分钟。</li>
		<li>切片厚度为7 µm，将切片转移至载玻片上。让载玻片干燥过夜，并在室温下保存至使用前。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>载玻片预处理
	<ol>
		<li>将载玻片依次通过100 mL 100%、90%、80%和70% EtOH进行脱蜡，每步5分钟。</li>
		<li>将载玻片放入玻璃罐中，用自来水冲洗5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阿利新蓝染色
	<ol>
		<li>将载玻片置于50 mL 1%阿利新蓝溶液中孵育30分钟。 
		注：阿利新蓝用3%乙酸溶液稀释，使用乙酸调节pH至2.5。</li>
		<li>将载玻片放入玻璃罐中，用自来水冲洗2分钟。</li>
		<li>用去离子水（DW）冲洗载玻片，并用核固红溶液复染2分钟。</li>
		<li>将载玻片放入玻璃罐中，用自来水冲洗1分钟。</li>
		<li>2.3.5) 继续进行步骤2.6中的脱水和封片操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>甲苯胺蓝染色
	<ol>
		<li>将载玻片置于50 mL甲苯胺蓝溶液中孵育4分钟。</li>
		<li>将载玻片放入玻璃罐中，用自来水冲洗5分钟。</li>
		<li>继续进行步骤2.6中的脱水和封片操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学染色
	<ol>
		<li>将载玻片置于3% H2O2中孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。</li>
		<li>将200 µL一抗（抗COL1A1和COL2A1抗体）用含1%牛血清白蛋白（BSA）和5%正常山羊血清（NGS）的Tris缓冲盐水（TBS）按1:100稀释后加至载玻片上，在4 °C下过夜孵育（O/N）。</li>
		<li>次日，将载玻片放入玻璃罐中，用含0.1%吐温20（TBST）的TBS溶液洗涤三次，每次50 mL，每次5分钟。</li>
		<li>将200 µL二抗（山羊抗兔IgG抗体，用含1% BSA和5% NGS的TBS按1:200稀释）加至载玻片上，在室温下孵育40分钟。</li>
		<li>将载玻片放入玻璃罐中，用50 mL TBST洗涤三次，每次5分钟。</li>
		<li>为进行信号放大，将HRP标记的链霉亲和素溶液加至载玻片上，孵育10分钟。</li>
		<li>将载玻片放入玻璃罐中，用50 mL TBST洗涤三次，每次5分钟。</li>
		<li>配制DAB-过氧化物酶底物溶液，每张载玻片加200 µL，孵育1分钟。</li>
		<li>将载玻片放入玻璃罐中，用自来水冲洗5分钟。</li>
		<li>用迈耶苏木精复染1分钟。</li>
		<li>用去离子水（DW）冲洗载玻片。</li>
		<li>继续进行步骤2.6中的脱水和封片操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱水与封片
	<ol>
		<li>将载玻片依次通过100 mL 70%、80%、90%和100% EtOH进行脱水，每步30秒。</li>
		<li>将载玻片浸入两缸二甲苯中，每缸1分钟。</li>
		<li>在盖玻片上加入50 µL封片液，然后将载玻片置于其上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

本方案成功地从脐带血单个核细胞（CBMCs）生成了人诱导多能干细胞（hiPSCs）。我们利用含有山中因子的仙台病毒载体将CBMCs重编程为hiPSCs24。在分化实验中使用了三个案例，所有实验均成功地通过该方案生成了软骨形成细胞团。已有大量研究报道了将hiPSCs分化为软骨细胞的方案25,26,27,28。然而，仍需进一步研究以确认CBMC-hiPSCs是否可作为软骨再生与修复的候选细胞来源。
已使用来源于多种体细胞类型的 hiPSCs 验证了软骨形成能力11,25,26,<...

人诱导多能干细胞（hiPSCs）的应用代表了一种针对多种疾病进行药物筛选和机制研究的新策略。从再生医学的角度来看，hiPSCs 还有望成为修复愈合能力有限的受损组织（如关节软骨）的潜在细胞来源1,2。
天然关节软骨的再生几十年来一直是一项挑战。关节软骨是一种覆盖在骨端的白色柔软组织，可保护骨骼免受摩擦损伤。然而，当其受损后再生能力有限，几乎无法实现自我修复。因此，针对软骨再生的研究已持续数十年。
此前， 体外 向软骨细胞系分化通常使用骨髓间充质干细胞或从膝关节分离的原代软骨细胞进行3由于具有软骨形成潜能，骨髓间充质干细胞（BMSCs）和天然软骨细胞在软骨生成中具有多种优势，支持其在该领域的应用。然而，由于其增殖能力有限且表型不稳定，这些细胞在关节软骨缺损修复中面临诸多局限性。 体外 培养条件下，这些细胞在传代3-4次后 tends to 逐渐丧失其自身特性，最终影响其分化能力4此外，在获取原代软骨细胞时，不可避免地会对膝关节造成额外损伤。
与骨髓间充质干细胞（BMSCs）或原代软骨细胞不同，hiPSCs 可无限扩增 体外在适当的培养条件下，人诱导多能干细胞（hiPSCs）作为软骨分化替代来源具有巨大潜力。然而，改变hiPSCs的内在特性仍具挑战性。5此外，它需要多个复杂的步骤 体外 将hiPSCs定向诱导为特定细胞类型的步骤。尽管存在这些复杂性，由于hiPSCs具有强大的自我更新能力以及分化为靶向细胞（包括软骨细胞）的潜能，仍推荐使用hiPSCs6.
软骨分化通常采用三维培养系统，例如团块培养或微团培养，使用类似间充质干细胞（MSC）的前体细胞。如果使用人诱导多能干细胞（hiPSCs），则生成类MSC前体细胞的方案与现有方案有所不同。一些研究团队采用hiPSCs的单层培养，直接将其表型转化为类MSC细胞7。然而，大多数研究利用拟胚体（EBs）产生具有MSC特征的外延生长细胞8,9,10,11。
常使用多种类型的生长因子来诱导软骨形成。通常单独或联合使用BMP和TGFβ家族蛋白。此外，其他因子如GDF5、FGF2和IGF1也可用于诱导分化。12,13,14,15TGFβ1 已被证明能够以剂量依赖的方式促进间充质干细胞的软骨形成16与另一种同种型TGFβ3相比，TGFβ1通过增强前软骨间充质细胞的凝聚来诱导软骨形成，而TGFβ3则通过显著促进间充质细胞增殖来诱导软骨形成。17然而，研究人员使用 TGFβ3 的频率高于 TGFβ17,10,18,19BMP2 在人关节软骨细胞中增强与软骨形成基质成分相关的基因表达 体外 条件20BMP2 与 TGFβ 蛋白联合使用可上调间充质干细胞中对软骨形成至关重要的基因表达21还已证明，BMP2通过Smad和MAPK通路协同增强TGFβ3的作用效果。22.
本研究中，将CBMC-hiPSCs在低吸附培养皿中使用EB培养基聚集形成拟胚体（EB）。通过将拟胚体接种至明胶包被的培养皿中，诱导其长出外延细胞。利用外延细胞通过团块培养法进行软骨向分化。联合使用BMP2和TGFβ3成功诱导细胞凝聚，并促进细胞外基质（ECM）蛋白的积累，从而形成软骨团块。本研究提出了一种利用CBMC-hiPSCs进行软骨向分化的简单且高效的方案。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;塑料器皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 一次性移液管</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 一次性移液管</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;描述&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;E8 培养基材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12，含 HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>E8 培养基 (500 mL)</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>E8 培养基 (浓度：543 &amp;mu;g/mL)</td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>E8 培养基&amp;nbsp; (浓度：14 ng/mL)</td></tr><tr><td>人转铁蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>E8 培养基 (浓度：10.7 &amp;mu;g/mL)</td></tr><tr><td>碱性 FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>E8 培养基&amp;nbsp; (浓度：100 ng/mL)</td></tr><tr><td>人胰岛素</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>E8 培养基 (浓度：20 &amp;mu;g/mL)</td></tr><tr><td>人 TGF&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 培养基 (浓度：2 ng/mL)</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>E8 培养基&amp;nbsp; (浓度：64 &amp;mu;g/mL)</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;描述&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质量控制材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm 盖玻片</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>抗 SSEA4 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>抗 Oct4 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>抗 TRA-1-60 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>抗 Sox2 抗体</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>抗 TRA-1-81 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>抗 Klf4 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体</td><td>Molecular Probe</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体</td><td>Molecular Probe</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>抗胶原蛋白 II 抗体</td><td>abcam&amp;nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>阿利新蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>快绿 FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>番红 O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>核固红</td><td>Americanmastertech</td><td>STNFR100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Duksan</td><td>115&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>迈耶苏木精溶液</td><td>wako pure chemical industries</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>载玻片，涂层</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;描述&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软骨分化材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>软骨分化培养基组分 (500 mL)</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>软骨分化培养基组分 (浓度：1%)</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>软骨分化培养基组分 (浓度：64 &amp;mu;g/mL)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>软骨分化培养基组分 (浓度：100 mM)</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R&amp;amp;D</td><td>355-BM-050</td><td>软骨分化培养基组分 (浓度：100 ng/mL)</td></tr><tr><td>重组人 TGF-β3</td><td>R&amp;amp;D</td><td>243-B3-002</td><td>软骨分化培养基组分 (浓度：10 ng/mL)</td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>软骨分化培养基组分 (浓度：1%)</td></tr><tr><td>ITS+ 预混液</td><td>BD</td><td>354352</td><td>软骨分化培养基组分 (浓度：1%)</td></tr><tr><td>水溶性地塞米松&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>软骨分化培养基组分 (浓度：10&lt;sup&gt;-7&lt;/sup&gt; M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>软骨分化培养基组分 (浓度：1%)</td></tr><tr><td>丙酮酸钠溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td>软骨分化培养基组分 (浓度：1%)</td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>软骨分化培养基组分 (40 &amp;mu;g/mL)</td></tr></tbody></table>

由脐带血来源的诱导多能干细胞形成软骨细胞样细胞团

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

人体关节软骨缺乏自我修复能力，因此软骨退变的治疗并非采用根治性手段，而是以保守治疗为主。目前，人们正致力于通过再生医学方法修复受损软骨 离体 扩增的软骨细胞或骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）。然而，这些细胞的存活率有限且稳定性较差，限制了其在软骨重建中的应用。人诱导性多能干细胞（hiPSCs）因其在再生医学应用中的潜力而受到科学界关注。凭借无限的自我更新能力和多向分化潜能，hiPSCs 已被视为软骨修复的一种新型替代细胞来源。然而，获得大量高质量的软骨形成细胞团仍是其临床应用的主要挑战。在本研究中，我们采用胚胎体（EB）来源的外生长细胞进行软骨向分化。通过 PCR 以及阿利新蓝、甲苯胺蓝染色和针对 I 型与 II 型胶原蛋白（分别为 COL1A1 和 COL2A1）抗体的免疫染色，证实了软骨形成的成功。本文提供了一种详细的实验方法，用于将脐带血单个核细胞来源的 iPSCs（CBMC-hiPSCs）分化为软骨形成细胞团。

本研究中，我们通过诱导CBMC-hiPSCs来源的拟胚体（EBs）形成外延细胞，进而生成软骨形成细胞团。采用经证实具有高多能性的CBMC-hiPSCs诱导软骨分化11本方案的简要示意图如图所示 图1A. 诱导分化前，iPSC集落进行扩增（图1B）。扩增的iPSCs被组装成EB以启动分化（图1C）。生成的类胚体被接种于明胶包被的培养皿上，以诱导其生长出细胞集落（图1D）。随后，收集迁移出的细胞并用于生成软骨形成细胞团。经过21天的分化后，获得微小珠状的软骨形成细胞团，并用于进一步表征（图1E）。样品的质量 体外-通过多种检测方法证实了成软骨诱导形成的细胞团。
<p class="jove_content" ...

本文提出了一种从脐带血单个核细胞来源的人诱导性多能干细胞进行软骨细胞分化的方法。

人体关节软骨缺乏自我修复能力，因此软骨退变的治疗并非采用根治性手段，而是以保守治疗为主。

本实验的总体目标是利用脐带血来源的诱导性多能干细胞生成软骨形成细胞团。通过本方案，我们能够获得相对大量的软骨形成细胞团。所获得的软骨形成细胞团可用于软骨生物学特性研究或疾病建模、药物筛选以及从研究向临床转化，以进一步加深对软骨本质的理解。人类软骨去年修复进展滞后。因此，软骨退变必须通过保守治疗进行处理。由于具有无限的自我更新能力和多向分化潜能，人诱导多能干细胞（iPSCs）已被视为软骨修复的一种新型替代细胞来源。演示该实验操作的是我实验室的研究生 Eugene Nam 和 Arie Alice Ream。开始实验步骤时，将血细胞收集到一个 15 毫升的锥形管中，并使用血细胞计数板进行计数。准备 3 × 10⁵ 个细胞，于室温下以 515 × g 离心 5 分钟。用吸液法弃去上清液，并将细胞重悬于0.5毫升血液细胞培养基中。接着，将细胞转移至未经包被的24孔板中的一个孔内，按照生产商的建议加入仙台病毒混合物。以1,150 × g离心30分钟，温度为30 °C。离心后，将细胞孵育过夜。第二天，将渗出细胞转移至基质编码孔中。离心培养板。离心后，弃去上清液，加入一毫升 iPSC 培养基，培养细胞。每天更换培养基，并替换为新鲜的 iPSC 培养基。维持人诱导多能干细胞（HIPSCs）的培养。每天更换培养基，替换为新鲜的 Essential Eight（E8）培养基。在含玻连蛋白的 100 毫升培养皿中准备 2 × 10⁶ 个 HIPSCs，并加入 E8 培养基。接着，从培养皿中移除 E8 培养基，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。加入1 mL的1毫摩尔EDTA，将培养皿孵育2分钟。然后用3 mL E8培养基收集细胞，并转移至新的15 mL圆锥形离心管中。在室温下以250 ×g离心2分钟。吸走上清液时避免扰动细胞层，将细胞重悬于 5 毫升 E8 培养基中。使用血细胞计数板计数细胞后，为每个 100 毫米培养皿准备 2 × 10⁶ 个细胞。将制备好的细胞重悬于 10 毫升 E8 与 EB 培养基 1:1 混合液中，并加入 10 微摩尔/升的 Rho 相关激酶抑制剂（rock inhibitor）。将细胞孵育过夜以形成聚集体。次日，通过移液收集聚集的胚胎体（EB）。移除上清液，并将胚胎体重悬于10毫升新鲜E8培养基中。将生成的EB扩大培养五天，每天更换新鲜的E8培养基。为进一步促进成熟，将培养基更换为E7培养基。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续培养EB五天，每天更换新鲜的E7培养基。向100毫米培养皿中加入6毫升1%明胶，孵育30分钟。去除明胶，将培养皿完全干燥2至3小时后备用。将EBs转移至50毫升锥形管中。让EBs沉降到锥形管底部。移除上清液时注意不要扰动EBs。接着，将EBs重悬于10毫升预热的Shilbecco改良必需培养基（DMEM）中，其中含有20%胎牛血清（FBS）。将拟胚体转移至明胶包被的100毫米培养皿中，加入10 µM的ROCK抑制剂。孵育并培养细胞7天。每隔一天更换一次培养基，不添加rock抑制剂。吸出培养皿中的培养液。立即向培养皿中加入1毫升1毫摩尔的EDTA，并将细胞孵育2分钟。接下来，使用5毫升含20%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基收集细胞，并转移至新的15毫升锥形管中。在室温下以250 × g离心2分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于10毫升含20% FBS的DMEM培养基中。使用40微米细胞筛过滤并弃去细胞团块，收集单细胞。用血细胞计数板对单细胞进行计数。离心细胞。吸去上清液，用300 µL软骨诱导分化培养基（CDM）将每团细胞重悬为3 × 10⁵个细胞，转移至15 mL锥形管中。为形成细胞团，离心细胞后，过夜培养。三天内，细胞团将呈现扁平的球状形态。将沉淀物维持21天。包埋前，在58摄氏度下准备并熔化石蜡。在1.5毫升离心管中，用1毫升4%多聚甲醛在室温下固定沉淀物2小时。将一层纱布放入包埋盒中，用移液器转移固定的沉淀物。折叠纱布覆盖沉淀物，并盖上包埋盒盖子。在100毫升70%乙醇中开始脱水。通过依次使用80%和95%乙醇进行终止洗涤，使沉淀脱水。将沉淀转移至100%乙醇中处理10分钟。进行透明处理时，将溶液更换为100毫升乙醇与二甲苯1:1的混合液，作用10分钟。接着，用乙醇与二甲苯按1:2比例配制的混合液置换1:1溶液，处理10分钟。通过将沉淀物在100%二甲苯中孵育以去除残留的乙醇。进行石蜡浸润时，将沉淀物依次置于二甲苯与石蜡的不同混合液中孵育。在 58 摄氏度下进行完整的石蜡浸透过程。将组织块放入 100 毫升二比一的二甲苯与石蜡混合液中，孵育 30 分钟。接着，更换为 100 毫升一比一的二甲苯与石蜡混合液，继续孵育 30 分钟。然后将溶液更换为100毫升体积比为1:2的二甲苯与石蜡混合液，孵育30分钟。进行最终浸润时，将沉淀物转移至第一缸100%石蜡中，孵育2小时；再将沉淀物转移至第二缸100%石蜡中，在58°C下孵育过夜。第二天，使用镊子将团块轻轻转移至模具中。从石蜡分配器中向模具内加入石蜡。在 4°C 条件下使石蜡固化 30 分钟。将切片切成七微米厚度，并将切片转移至载玻片上。让载玻片在室温下过夜干燥，然后于室温保存，直至使用。在分化前，iPSC 克隆已进行扩增。扩增的iPSCs被组装成拟胚体（EBs）以启动分化。将生成的拟胚体接种于明胶包被的培养皿中，以诱导细胞向外生长。经过21天的分化后，获得微小珠状的软骨形成细胞团，并用于进一步表征。在第21天对软骨形成类球体的质量进行组织学评估，以BMSC软骨形成类球体作为阳性对照。通过阿利新蓝染色和甲苯胺蓝染色确认由分化软骨细胞分泌的细胞外基质蛋白的积累。由CDMC HIPSCs生成的软骨形成类球体比由CBMSC HIPSCs衍生的类球体表达更高的COL2A1。与COL2A1的表达相比，来源于CBMC HIPSC的软骨细胞团中作为纤维化软骨标志物的I型胶原表达较低。通过实时PCR检测证实了第21天软骨诱导细胞团中软骨细胞外基质蛋白的基因表达。来源于CBMC HIPSC的细胞团与来源于BMSC的细胞团在聚集蛋白聚糖表达上相似。我们提供了一种将脐血单个核细胞来源的诱导多能干细胞（iPSCs）分化为软骨形成细胞团的详细方法。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两个月内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何从iPSCs生成软骨形成细胞团。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

脐带血诱导的多能干细胞的软骨形成颗粒形成

机械应力可诱导干细胞的软骨向分化，为受损软骨的修复提供了一种潜在的治疗策略。本文介绍了一种利用离心重力（CG）诱导脂肪来源干细胞（ASCs）向软骨细胞分化的实验方案。由离心重力诱导的SOX9表达上调可促进软骨向表型的形成。...

通过离心重力诱导脂肪源性干细胞的软骨分化

干细胞向软骨分化需要精细调控培养条件。本文介绍一种利用磁力方法聚集细胞的技术，这是启动软骨分化的关键步骤。此外，我们还表明，在生物反应器中进行动态成熟培养可对细胞构建物施加机械刺激，从而增强软骨样细胞外基质的生成。...

三维磁性干细胞聚合并结合生物反应器成熟化用于软骨再生

本文介绍一种从人脐带（UC）和胎儿胎盘样本中分离出脐带内层（CL）、华通胶（WJ）、脐带-胎盘连接处（CPJ）以及胎儿胎盘（FP）的实验方案，用于通过组织块培养法分离和鉴定间充质基质细胞（MSCs）。...

人脐带和胎儿胎盘间充质基质细胞的分离与鉴定

我们介绍一种通过无整合方法利用人外周血（PB）来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）生成软骨细胞系的方案，该方法包括拟胚体（EB）形成、成纤维细胞扩增以及软骨诱导。...

从外周血来源的人诱导性多能干细胞分化软骨细胞

我们提出了一种实验方案，用于诱导多能干细胞来源的角质形成细胞和成纤维细胞的分化，并利用这些角质形成细胞和成纤维细胞构建三维皮肤类器官。该方案包含建立人源化小鼠模型的额外步骤。本文所介绍的技术将有助于推动皮肤科领域的研究进展。...

由脐带血来源的诱导多能干细胞生成三维皮肤类器官

通过植入由间充质干细胞构建的人工软骨组织，以软骨内成骨方式实现骨修复，有望克服传统治疗方法的局限性。透明质酸水凝胶在规模化制备均一分化软骨移植物以及促进融合移植物间血管化整合骨形成方面具有显著优势。 体内.

通过整合性骨形成 在体 内 利用间充质干细胞进行软骨内成骨

本方案描述并比较了两种将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为间充质基质细胞（MSCs）的代表性方法。单层培养法具有成本较低、操作简便以及更易实现成骨分化的优点；拟胚体（EBs）法的特点是耗时较短。...

人诱导性多能干细胞向间充质基质细胞分化的两种代表性方法的比较

本方案详细描述了从人关节软骨中分离软骨细胞、纤维连接蛋白黏附实验衍生的软骨祖细胞（FAA-CPs）以及迁移性软骨祖细胞（MCPs）的方法。内容涵盖用于分离和鉴定这些细胞的酶消化、纤维连接蛋白黏附以及基于迁移的实验方法。...

利用纤连蛋白黏附与迁移实验分离软骨细胞和软骨祖细胞

本研究描述了一种通过在低黏附条件下利用重力使细胞聚集形成软骨细胞球体，随后将所得球体在微型生物反应器中进行培养的方法。...

利用重力条件和自制微型生物反应器在低黏附环境下由不同软骨细胞生成球状体

锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮层中大多数兴奋性突触的所在部位。本方法描述了对来源于诱导 多能干细胞的人类皮层锥体谷氨酸能神经元的树突棘形态进行三维定量分析。...

源自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘三维定量分析

了解从脐带血诱导多能干细胞生成软骨形成颗粒的方法。该技术可大规模生产软骨颗粒，用于疾病建模和药物筛选，为软骨修复研究提供重要工具。

由脐带血来源的诱导多能干细胞形成软骨细胞样细胞团

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