真菌细胞的活细胞成像研究抗真菌植物防御的进入和亚单位定位

这种活细胞成像方法的总体目标是研究真菌细胞中抗真菌植物防御素作用机制的关键方面。随着先进的共聚焦显微镜技术的出现，活细胞成像已成为研究抗真菌植物防御素作用模式的有力工具。利用这项技术，我们在这里提出了一种方法来帮助回答理解抗真菌植物防御素的作用方式的关键问题。

我们的重点是这些肽如何内化到真菌细胞中，以及这些肽如何定位到细胞器中或在细胞质中扩散。为了制备禾谷镰刀菌 PH-1 菌株的分生孢子悬浮液，首先在含有完全培养基的平板上建立该菌株的培养物。在 28 摄氏度下培养 5 天。

为了生产分生孢子，将 5 天龄培养物的四个直径为 10 毫米的塞子接种到 50 毫升羧甲基纤维素培养基中。将这些塞子在 28 摄氏度下在设置为 180 rpm 的旋转振荡器上培养 4 到 7 天。当培养物呈红色时，分生孢子已经形成。

为了在悬浮液中收集分生孢子，涡旋液体培养物，并通过两层过滤材料过滤 1 毫升分生孢子，放入 2 毫升微量离心管中。将悬浮液离心 2 分钟，弃去上清液。然后，用 1 毫升无菌水洗涤沉淀，并重复离心。

接下来，将沉淀重悬于一毫升 2x SFM 中。然后，使用血细胞计数器计数分生孢子，并将悬浮液的密度调节至每毫升 100， 000 个分生孢子。为了制备 Neurospora crassa 分生孢子悬浮液，将分生孢子从原液培养物转移到含有 Vogel 琼脂培养基的斜管中，并将试管在室温下恒光孵育 5 天。

五天后，使用接种环将少量生长的培养物转移到含有 2 毫升 Vogel's 液体培养基的微量离心管中。确保将分生孢子从环中混合。然后，过滤悬浮液，离心，并将分生孢子沉淀重悬于 Vogel 培养基中，无需洗涤步骤。

最后，将最终悬浮液调整为每毫升 100， 000 个分生孢子。为了为共聚焦显微镜做准备，将 50 微升分生孢子悬浮液移液到 35 毫米培养皿上，让分生孢子在室温下发芽 3 到 6 小时。对于共聚焦显微镜，将 50 微升分生孢子悬浮液移液到 10 毫米玻璃底培养皿的微孔中。

然后，在预定的最小抑制浓度下，向悬浮液中加入 50 μL 荧光标记的防御素，并将分生孢子与标记的防御素在室温下孵育 2.5 小时。孵育后，加入 2 微升膜选择性染料 FM4-64，终浓度为 5 微摩尔。然后，在室温下孵育培养物 30 分钟，然后检查分生孢子。

要设置共聚焦显微镜，请选择白光激光器。使用 488 纳米和 550 纳米激光器分别激发罗丹明标记的防御素和 FM4-64 染料。将这些激光器的强度设置为 1%然后，将罗丹明标记的防御素的检测波长设置为 580 至 700 纳米，将 FM4-64 染料的检测波长设置为 690 至 800 纳米。

现在，收集图像。对于延时成像，将 50 微升分生孢子悬浮液加入玻璃底微孔培养皿中。接下来，将微孔培养皿安装在显微镜上，找到低功率的细胞。

然后，切换到 100 倍、1.44 油物镜。要观察 DyLight550 标记的防御素，请将激光线设置为 550 纳米进行激发，将激光线设置为 560 至 600 纳米进行检测。接下来，将扫描模式设置为 xyzt。

然后，根据需要设置 Z 位置、缩放、图像捕获频率等。现在，向分生孢子悬浮液中加入 50 微升荧光团标记的防御素，最低抑制浓度为 3 微摩尔，并加入 2 微升膜选择性染料 FM4-64，终浓度为 5 微摩尔。然后，如果需要，重新聚焦光学元件。

在捕获图像之前，将小块湿滤纸放入微孔培养皿中以防止蒸发。然后，在 2.5 小时内每 3.5 分钟捕获一次图像。进行活细胞成像以跟踪和比较来自 Medicago truncatula 的两种防御素的内化和亚细胞定位。

化学合成的罗丹明标记的防御素 4 在 Neurospora crassa 和 Fusarium graminearum 中的运输方式不同。FM4-64 标记了两种真菌的质膜。然而，在镰刀菌中，防御素 4 在细胞质中扩散。

而在 Neurospora 中，它被转运到囊泡体。为了进行比较，使用 Neurospora crassa 中的 DyLight550 标记以及 FM4-64 的质膜标记来可视化防御素 5。延时成像显示，这种防御素在 30 到 40 分钟内进入细胞，然后通过细胞质扩散。

这与防御素 4 的运输不同，防御素 4 进入细胞并在三个小时后仍被困在囊泡体内。总之，活细胞成像是增加我们对抗真菌植物差异作用模式的理解的有力工具。与其他重要的荧光染料和细胞标志物一起，它具有针对其他抗菌肽进行改性的灵活性。

最终，该技术可以帮助开发在农业和医学中使用抗菌肽作为抗真菌剂的新策略。