Name: 真菌细胞的活细胞成像研究抗真菌植物防御的进入和亚单位定位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 了解活细胞成像技术用于研究抗真菌植物防御素在真菌细胞中的内化过程及亚细胞定位。该方法利用共聚焦显微镜观察Fusarium graminearum中防御素的扩散特性，为农业抗真菌策略开发提供基础。

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我们感谢唐纳德·丹佛斯植物科学中心整合显微技术平台负责人 R. Howard Berg 博士在共聚焦显微镜使用方面提供的指导与帮助。作者声明无利益冲突。

1. 用荧光染料标记防御素
<ol>
	<li>选择一种对防御素在活细胞内的抗菌特性、摄取和定位影响最小的荧光染料。 
	注意：选择最佳荧光染料需根据具体的实验目标而定。还应考虑荧光染料的光谱特性、化学性质、光稳定性、大小和电荷。</li>
	<li>使用商业供应商提供的适当多肽标记试剂盒，用所选荧光染料对防御素进行标记。或者，可通过化学方法合成荧光染料标记的防御素。在本研究中，使用商业试剂盒按照制造商的说明书将MtDef5防御素标记DyLight550，而TAMRA标记的MtDef4防御素则由商业机构化学合成。 
	注意：建议使用化学合成的荧光标记肽（尤其是长度为50个或更少氨基酸的短肽），因为可将荧光染料连接至肽的N端或C端残基，以确保对其抗菌活性的影响最小。合成含有三个以上二硫键的长肽具有挑战性。在此情况下，建议使用合适的市售肽标记试剂盒，选择最佳荧光染料对肽进行标记。</li>
	<li>测试 体外 测定标记防御素的抗菌活性，并确定其对目标真菌的最小抑菌浓度（MIC）。 
	注意：本研究中，测定了 DyLight550-MtDef5 和 TMR-MtDef4 对 Neurospora crassa 和 Fusarium graminearum.</li>
</ol>
2. 真菌培养与培养基
<ol>
	<li>将分生孢子从一个 N. crassa 将菌种接种至含Vogel培养基的斜面试管中21 在室温光照条件下孵育5天。</li>
	<li>培养 F. graminearum 含完全培养基（CM）平板上的 PH-1 菌株22 在28 ºC下培养5天。为产生分生孢子，接种4块（直径10 mm）5天大的菌落菌块于 F. graminearum 将PH-1接种于50 mL羧甲基纤维素（CMC）培养基（15 g羧甲基纤维素、1 g酵母提取物、0.5 g MgSO₄·7H₂O、0.5 g K₂HPO₄、0.5 g NaCl、0.2 g NH₄Cl、0.1 g CaCl₂·2H₂O，溶于1 L蒸馏水，pH调至7.0）中40.7 H2O，1 g NH₄Cl4一氧化氮3，以及 1 g KH2PO4在28 ºC、180 rpm条件下，于旋转摇床中培养4-7天。</li>
</ol>
3. 准备 的 分生孢子悬浮液
<ol>
	<li>F. graminearum 分生孢子悬液
	<ol>
		<li>涡旋混合 F. graminearum 液体培养并收集分生孢子：将1.5 mL真菌培养液通过两层滤膜材料（如Miracloth）过滤&#160;转移到2 mL微量离心管中。在微量离心机中以13,226 × g离心2分钟。</li>
		<li>弃去上清液，加入1 mL无菌水洗涤沉淀。</li>
		<li>在微量离心机中以13,226 x g离心孢子悬液2分钟。弃上清液，将沉淀重悬于1 mL 2X SFM（合成真菌培养基）中。23.</li>
		<li>使用血细胞计数板在光学显微镜下对分生孢子进行计数。</li>
		<li>将分生孢子悬液调整至105 分生孢子/mL 与 2X SFM</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N. crassa 分生孢子悬液
	<ol>
		<li>转移少量培养物（培养5天） N. crassa 使用接种环将样品转移至含有2 mL Vogel液体培养基的微量离心管中。</li>
		<li>涡旋振荡分生孢子悬液，并通过滤材过滤至新的微量离心管中。</li>
		<li>在微量离心机中以最大速度离心分生孢子悬浮液2分钟。弃去上清液，将分生孢子沉淀重悬于1 mL Vogel液体培养基中。</li>
		<li>使用血细胞计数板在光学显微镜下对分生孢子进行计数。</li>
		<li>将分生孢子悬液调整至105 分生孢子/mL，使用Vogel液体培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 样品制备与共聚焦显微镜观察
<ol>
	<li>MtDef4 defensin 在真菌细胞中的亚细胞定位
	<ol>
		<li>将每种分生孢子悬浮液（105 个分生孢子/mL）各 50 µL 加入 35 mm 玻璃底微孔培养皿的 10 mm 微孔中。若需观察分生孢子，可直接进入下一步；若需制备萌发菌丝，则将 N. crassa 和 F. graminearum 的分生孢子各 50 µL 加入 35 mm 培养皿中，在室温下孵育 3–6 小时以促进萌发。</li>
		<li>向每个微孔培养皿中加入 50 µL 处于最低抑菌浓度（MIC）的荧光标记 defensin，并孵育 2.5 小时。此处使用的荧光标记 defensin（步骤 1.3）对 N. crassa 和 F. graminearum 的 MIC 均为 3 µM；TMR-MtDef4 对 N. crassa 和 F. graminearum 的 MIC 分别为 1 µM 和 12 µM。</li>
		<li>在培养皿中加入 2 µL 膜特异性染料 FM4-64（终浓度：5 µM），孵育 30 分钟后立即置于共聚焦显微镜下进行成像。</li>
		<li>选择白光激光器（WLL）。使用 488 nm 和 550 nm 的两种激光源分别激发 TMR-MtDef4 和 FM4-64 染料。TMR-MtDef4 的荧光检测范围为 580–700 nm，FM4-64 染料的检测范围为 690–800 nm。 
		注：共聚焦显微镜操作应在暗室中进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MtDef5 defensin 内化过程的时间序列成像
	<ol>
		<li>将 N. crassa 和 F. graminearum 的分生孢子悬浮液（105 个分生孢子/mL）各 50 µL 加入 35 mm 玻璃底微孔培养皿的 10 mm 微孔中。该微孔未经包被，底部为 No. 1.5 盖玻片。若需观察分生孢子，可直接进入下一步；若需观察萌发菌丝，则在室温下孵育分生孢子 3–6 小时后再进行显微观察。</li>
		<li>开启白光激光器（WLL）。选择 550 nm 激光线以激发此处使用的荧光标记 defensin（步骤 1.3）和 FM4-64，激光强度设为 1.00%，并激活相应的检测器。此处使用的荧光标记 defensin（步骤 1.3）的荧光检测范围为 560–600 nm，FM4-64 染料的检测范围为 690–800 nm。 
		注：活细胞成像时应使用低激光强度，高激光强度可能对活体真菌细胞造成损伤。</li>
		<li>将微孔培养皿置于显微镜载物台上。先使用 10× 物镜定位细胞，再切换至 100×/1.44 油镜以获得更高放大倍数。 
		注：在进入下一步前，应预先设置扫描模式为 xyzt 模式（Z-层扫与时间序列模式的组合）、Z 轴位置、缩放倍数、图像采集频率等参数。</li>
		<li>向每个微孔培养皿中加入 50 µL 处于 MIC（3 µM）的荧光标记 defensin（步骤 1.3）以及 2 µL 膜特异性染料 FM4-64（终浓度 5 µM），随后启动时间序列成像。在微孔培养皿内放置少量湿润的滤纸片以防止蒸发。图像采集频率为每 3 分 30 秒一次，总时长为 2 小时 30 分钟。 
		注：若在将微孔培养皿置于显微镜后才加入 defensin 和荧光染料，可能导致目标区域失焦。因此，在向微孔中加入 defensin 和荧光染料后，需重新对目标区域进行调焦，这可能导致图像采集延迟。</li>
		<li>所有共聚焦成像均使用共聚焦显微镜完成，实验在室温下的暗室中进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究描述了一种可靠的活细胞成像方法，该方法利用荧光标记的抗真菌防御素，用于研究这些肽进入真菌细胞的内化动力学，并确定其亚细胞靶标。该方法是一种强大的工具，可实现对防御素与真菌细胞之间相互作用在时间和空间上的动态可视化。
已有多种方法用于研究植物防御素在真菌细胞内的内化过程及细胞内定位。这些方法通常先将经防御素处理的细胞固定，再进行免疫定位、电子显微镜观察或X射线断层扫描15,24,25。此外，大多数此类技术仅限于在特定时间点对细胞进行成像，而无法通过延时成像对同一活细胞进行实时监测，以观察防御素刺激下发生的动态变化。能够实时可视化、分析并比较防御素抗真菌作用过程中真菌细胞内发生的动态事件，使该技术具有高效性和吸引力。此外，该技术有助于更深入地理解肽段在细胞内的动态定位如何随时间影响单个真菌细胞的形态发生过程。
该方法的一个重要方面是利用荧光...

植物已进化出一套复杂的先天免疫系统，以防御微生物植物病原体1它们表达多种由基因编码的宿主防御肽，具有潜在的抗菌活性。2事实上，这些肽中的许多都表现出抗菌活性 体外3防御素是植物界中最大的宿主防御肽类之一4这些富含半胱氨酸的阳离子肽在微摩尔浓度下即对真菌和卵菌病原体表现出强烈的生长抑制活性，是抵御这些病原体的第一道防御屏障之一。5,6由于防御素具有强效的抗真菌活性，可在农业生物技术应用中用于培育抗病作物。在转基因作物的温室和田间试验中，组成型过表达多种植物防御素已被证明可增强其抗病性。6阐明这些抗真菌肽的作用机制（MOA）对于充分发掘其作为作物保护有效工具的潜力至关重要。然而，这些植物防御素的作用机制目前尚不明确。现有证据表明，它们表现出不同的作用机制5,6,7,8某些防御素在胞外作用于真菌，靶向特定的细胞壁/质膜定位的鞘脂类分子，破坏膜完整性并激活细胞毒性通路9,10,11然而，最近已发现可转位进入真菌细胞的抗真菌防御素12,13,14某些防御素可结合膜上的生物活性磷脂，形成寡聚复合物并使质膜通透化15,16,17因此，植物防御素的作用机制（MOA）在某些方面已得到阐明。然而，植物防御素的作用机制可能涉及一系列尚未被识别并整合到综合性模型中的复杂事件。特别是，我们对这些肽类分子的细胞靶标仍存在重大认知空白。
随着显微技术的最新进展以及新型荧光探针的开发，活细胞成像技术现已被广泛用于研究抗菌肽（AMPs）的作用机制（MOA）。这些技术补充了免疫定位、电子显微镜、原子力显微镜或X射线断层扫描等常用方法18，后者主要用于分析抗真菌肽对真菌细胞形态和生长的影响，包括细胞壁完整性、细胞生长/分枝模式的改变，以及质膜通透性和杀伤效应的研究。然而，这些研究大多局限于在肽处理后的某一时间点对细胞进行成像，而未对同一细胞进行时间序列的活细胞成像以监测其对防御素刺激的动态变化。近年来，将荧光标记的肽与共聚焦显微镜下的活细胞成像相结合，实现了对AMP–微生物相互作用动态过程的实时可视化。无论是天然纯化的还是化学合成的抗真菌肽，均可标记荧光染料（例如，DyLight、罗丹明、BODIPY或Alexa Fluor系列染料），并通过时间序列活细胞成像直接观察其与细胞的相互作用过程。这些标记肽的应用显著加深了我们对其作用机制多个方面的理解，包括进入模式、亚细胞定位、胞内转运过程以及在活体真菌细胞内的抗真菌作用位点18。
最近，多项研究表明，包括植物防御素在内的多种抗真菌肽能够被活体真菌细胞内化12,14,19,20。这些防御素的作用机制（MOA）可能涉及与细胞内靶标的相互作用。我们近期报道了植物防御素 MtDef4 在两种子囊菌（Neurospora crassa 和 Fusarium graminearum）中的抗真菌作用。研究表明，MtDef4 在这些真菌中通过不同的途径进入细胞，并实现亚细胞定位14。该研究采用了化学合成的四甲基罗丹明（TAMRA）标记的 MtDef4，并结合活细胞荧光染料（膜特异性染料 FM4-64、膜通透性染料 SYTOX Green、细胞死亡报告染料碘化丙啶）以及代谢抑制剂。这些分析揭示了 MtDef4 内化过程的动力学特征、其细胞内转运机制以及亚细胞作用靶标14。
本文介绍了一种利用共聚焦显微镜进行活细胞成像的实验方案。该方案结合荧光标记的多肽与活细胞荧光染料，用于研究植物防御素与真菌之间的相互作用，特别是防御素在真菌细胞中的转位途径及其细胞内作用靶点。

<table><tbody><tr><td>FM4-64 染料</td><td>Life Technologies</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 550 抗体标记试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底细胞培养皿</td><td>Mat TeK</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Mira 布</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>475855-1R</td><td></td></tr><tr><td>SP8-X 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>FiJi</td><td></td><td>用于图像分析</td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Bitplane</td><td></td><td>用于图像分析</td></tr></tbody></table>

活细胞成像技术研究抗真菌植物防御素进入真菌细胞的方式及其亚细胞定位

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

小分子富含半胱氨酸的防御素是存在于所有植物中的一类最大的宿主防御肽家族。许多植物防御素表现出强烈的 体外 对多种真菌病原体具有抗真菌活性，因此在转基因作物中作为抗真菌剂具有潜在应用价值。为了充分挖掘植物防御素在病害防控中的潜力，阐明其作用机制（MOA）至关重要。随着先进显微技术的发展，活细胞成像已成为研究植物防御素抗真菌作用机制动态过程的有力工具。本文介绍了一种基于共聚焦显微镜的活细胞成像方法，结合两种荧光标记的植物防御素（MtDef4 和 MtDef5）与活体荧光染料，实现对MtDef4和MtDef5进入真菌细胞过程的实时可视化与分析。该方法能够提供丰富的信息，包括这些多肽的内化动力学、进入方式及其亚细胞定位。结合其他细胞生物学工具，这些技术为深入理解此类多肽作用机制的动态特征与复杂性提供了关键见解，并可用于比较这些多肽对不同真菌的作用机制。

通过活细胞成像技术追踪并比较了来自Medicago truncatula的两种防御素MtDef4和MtDef5在真菌细胞内的内化过程及亚细胞定位。TMR-MtDef4为化学合成，而MtDef5则用Dylight550标记（Dylight550-MtDef5）。分生孢子与任一防御素及膜特异性染料FM4-64共同孵育。图1显示，TMR-MtDef4在N. crassa中的运输途径与在F. graminearum中不同。在N. crassa中，FM4-64不与防御素共定位，而是标记了含有防御素的液泡膜；而在F. graminearum中，TMR-MtDef4未定位于任何特定的膜结合细胞器内，而是弥散分布于细胞质中（图1）。
对同时用本实验所用的荧光标记...

植物防御素在植物抵御病原体过程中发挥着重要作用。为了有效利用这些抗真菌肽作为抗真菌剂，了解其作用机制（MOA）至关重要。本文描述了一种活细胞成像方法，用于研究这些肽作用机制中的关键方面。

小分子富含半胱氨酸的防御素是存在于所有植物中的一类最大的宿主防御肽。许多植物防御素在体外表现出强烈的...

本活细胞成像方法的总体目标是研究抗真菌植物防御素在真菌细胞中作用机制的关键方面。随着先进共聚焦显微镜技术的发展，活细胞成像已成为研究抗真菌植物防御素作用模式的有力工具。利用该技术，本文介绍了一种有助于解答抗真菌植物防御素作用模式关键问题的方法。我们的研究重点是这些肽如何被真菌细胞内化，以及这些肽如何定位于细胞器内或在细胞质中扩散。为了制备禾谷镰刀菌PH-1菌株的分生孢子悬浮液，首先在含有完全培养基的平板上培养该菌株。在28°C条件下培养五天。为产生分生孢子，将五个五日龄培养物的4个直径10毫米的菌块接种至50毫升羧甲基纤维素培养基中。在28°C、180 rpm的旋转摇床中培养4至7天。当培养物呈现红色时，表明分生孢子已形成。为了收集悬浮液中的分生孢子，将液体培养物涡旋振荡，取一毫升经两层滤材过滤，收集至一个两毫升的微量离心管中。将悬浮液离心两分钟，弃去上清液。然后用一毫升无菌水洗涤沉淀物，并重复离心步骤。接下来，将沉淀重悬于1毫升2倍浓度的SFM培养基中。然后使用血细胞计数板对分生孢子进行计数，并将悬浮液的浓度调整至每毫升10万个分生孢子。制备粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）分生孢子悬浮液时，将保藏菌种中的分生孢子转移至含有Vogel's琼脂培养基的斜面管中，在室温下持续光照条件下培养五天。培养五天后，用接种环取少量生长的菌液，转移到含有两毫升 Vogel 液体培养基的微量离心管中。确保将孢子从接种环上充分混入培养基中。随后，过滤该悬浮液，离心，并将孢子沉淀重悬于 Vogel 培养基中，无需洗涤步骤。最后，将悬浮液调整至每毫升含100,000个分生孢子。为制备共聚焦显微镜观察用的萌发菌丝样品，取50微升分生孢子悬浮液滴加到35毫米的培养皿中，在室温下孵育3至6小时，使分生孢子萌发。进行共聚焦显微镜观察时，将50微升分生孢子悬浮液加入玻璃底培养皿的10毫米微孔中。随后，在预设的最低抑菌浓度下，向悬浮液中加入 50 微升荧光标记的防御素，并在室温下将分生孢子与标记的防御素共同孵育 2.5 小时。孵育结束后，加入 2 微升膜特异性染料 FM4-64，使其终浓度为 5 微摩尔。然后，在室温下继续孵育培养物 30 分钟，随后观察分生孢子。设置共聚焦显微镜时，选择白光激光器。使用488纳米和550纳米的激光分别激发罗丹明标记的防御素和FM4-64染料。将这些激光的强度设置为1%。然后，将罗丹明标记防御素的检测波长设置为580至700纳米，FM4-64染料的检测波长设置为690至800纳米。现在，采集图像。进行延时成像时，将50 µL分生孢子悬液加入玻璃底微型培养皿中。接着，将微型培养皿安装到显微镜上，在低倍镜下找到细胞。然后，切换至100倍、数值孔径1.44的油镜。为观察DyLight550标记的防御素，将激光激发波长设为550纳米，检测波长设为560至600纳米。接着，将扫描模式设为xyzt。然后，根据需要设置Z轴位置、缩放倍数、图像采集频率等参数。向分生孢子悬液中加入50微升浓度为3微摩尔（最低抑菌浓度）的荧光标记防御素，再加入2微升膜特异性染料FM4-64，使其终浓度为5微摩尔。如有需要，重新调整光学焦平面。在采集图像之前，将少量湿润的滤纸片放入微孔板中，以防止蒸发。随后，在2.5小时内每3.5分钟采集一次图像。通过活细胞成像技术，追踪并比较来自截形苜蓿（Medicago truncatula）的两种防御素的内化过程及亚细胞定位。化学合成的罗丹明标记防御素四在粗糙脉孢菌和禾谷镰刀菌中的转运方式不同。FM4-64 标记了两种真菌的质膜。然而，在禾谷镰刀菌中，防御素四在细胞质中扩散。而在粗糙脉孢菌中，该物质会被转运至囊泡结构。作为对比，使用DyLight550标记的防御素5在粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）中进行可视化观察，并结合FM4-64对细胞质膜进行标记。延时成像显示，该防御素在30至40分钟内进入细胞，随后在细胞质中扩散。这与防御素4的转运方式不同，后者进入细胞后即使经过三小时仍被滞留在囊泡结构内。总之，活细胞成像是一种强大的工具，可加深我们对植物抗真菌差异作用机制的理解。结合其他活体荧光染料和细胞标记物，该方法具有良好的灵活性，可针对其他抗菌肽进行相应优化。最终，该技术可有助于开发新的策略，将抗菌肽作为抗真菌剂应用于农业和医学领域。

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真菌细胞的活细胞成像研究抗真菌植物防御的进入和亚单位定位

本视频展示了利用荧光标记的Aspergillus报告分生孢子对人中性粒细胞抗真菌活性进行活细胞成像的分析方法。最初，中性粒细胞内可同时检测到红色和洋红色荧光，随着时间推移，红色荧光逐渐减弱，表明分生孢子被降解，从而证实了中性粒细胞具有抗真菌活性。...

原代人类免疫细胞抗真菌活性的实时评估

我们描述了利用活细胞视频显微镜观察巨噬细胞吞噬Candida...

活细胞视频显微镜观察真菌病原体的吞噬作用

本文介绍了一种利用荧光标记的Aspergillus报告分生孢子，结合活细胞视频显微镜和流式细胞术，实时评估原代人免疫细胞抗真菌活性的实验方案。所获得的数据可揭示宿主细胞与Aspergillus之间的相互作用，包括杀菌活性、吞噬作用、细胞迁移以及对真菌生长的抑制等过程。...

人原代中性粒细胞和单核细胞对A. fumigatus反应中抗真菌活性的活体成像

基于荧光蛋白的方法在监测细菌向宿主细胞分泌效应蛋白时面临挑战，这主要是由于荧光蛋白与III型分泌系统之间存在不兼容性。本文采用一种优化的分裂型超折叠GFP系统，用于可视化细菌向宿主植物细胞中分泌的效应蛋白。...

利用分裂型绿色荧光蛋白系统可视化细菌感染过程中递送的效应蛋白

活性荧光染料是现代真菌细胞生物学中活细胞成像分析的重要工具。本文详细介绍了已知及较少使用的荧光染料在丝状真菌中用于追踪质膜动态、内吞/外排作用以及细胞壁形态发生的应用方法。...

膜和细胞壁选择性荧光染料在丝状真菌活细胞成像中的应用

由于土壤不透明，其内部微生物组分之间的相互作用难以在细胞分辨率下直接观察。本文介绍了两种微流控工具，为研究真菌-微生物相互作用提供了新的机会。这些装置用途广泛且操作简便，能够实现高时空控制，并在细胞水平上进行高分辨率成像。...

用于在细胞水平上探究真菌-微生物相互作用的微流控工具

本文详细描述了一种优化的接种方案，该方案利用分离的玉米叶鞘进行可重复的细胞学、生理学和分子水平研究，以分析玉米与真菌植物病原体之间的互作。叶鞘有助于在未固定的组织中实时观察活体植物与真菌之间的细胞相互作用。...

用于真菌性叶部玉米病原菌侵染活细胞成像的离体玉米叶鞘

活细胞成像与胚胎上皮细胞的定量分析 Xenopus laevis

可通过荧光Ca2+指示剂来监测库容性Ca2+内流（SOCE）的程度。利用Mn2+淬灭此类指示剂的方法，可检测培养细胞和骨骼肌纤维中的SOCE。本文还描述了一种通过共聚焦成像技术对机械去膜肌纤维进行成像，以实现SOCE时空分辨率分析的技术。...

基于荧光的活细胞内库控钙离子内流检测：从培养的癌细胞到骨骼肌纤维

本实验方案描述了一种用于可视化DNA损伤应答中被激活的DNA双链断裂信号蛋白及其在有丝分裂过程中定位的方法。...

活细胞中DNA损伤应答蛋白的二维与三维实时成像

了解活细胞成像技术用于研究抗真菌植物防御素在真菌细胞中的内化过程及亚细胞定位。该方法利用共聚焦显微镜观察Fusarium graminearum中防御素的扩散特性，为农业抗真菌策略开发提供基础。

活细胞成像技术研究抗真菌植物防御素进入真菌细胞的方式及其亚细胞定位

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