Name: 高尔基蛋白质荧光质量中心的定量定位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: 学习利用常规显微镜和软件工具对高尔基体蛋白质进行纳米级精确定量的定位分析方法。该技术使用HeLa细胞培养，通过荧光标记和图像处理，帮助研究人员深入理解高尔基体的组织结构与功能机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢英国布里斯托大学的 D. Stephens 提供 TPST1-EGFP DNA 质粒，同时感谢 Lakshmi Narasimhan Govindarajan 在软件优化方面的协助。本研究工作获得了新加坡国家医学研究理事会（NMRC/CBRG/007/2012）以及教育部（AcRF 第1级 RG 18/11、RG 48/13 和 RG132/15，以及 AcRF 第2级 MOE2015-T2-2-073）向 L.L. 提供的资助。

<ol><li>Glick, B. S., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+Golgi+traffic%3A+a+critical+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Models for Golgi traffic: a critical assessment.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215(2011).</li>
<li>Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mammalian+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mammalian Golgi.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).</li>
<li>Lu, L., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+endosomes+to+the+trans-Golgi+network%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From endosomes to the trans-Golgi network.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li>
<li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exiting+the+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exiting the Golgi complex.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).</li>
<li>Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Tie, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+imaging+method+for+quantitative+Golgi+localization+reveals+differential+intra-Golgi+trafficking+of+secretory+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes.</a> Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).</li>
<li>Trucco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+traffic+triggers+the+formation+of+tubular+continuities+across+Golgi+sub-compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).</li>
<li>Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+dispersal+during+microtubule+disruption%3A+regeneration+of+Golgi+stacks+at+peripheral+endoplasmic+reticulum+exit+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites.</a> Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).</li>
<li>Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+microtubule+assembly+status+on+the+intracellular+processing+and+surface+expression+of+an+integral+protein+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane.</a> J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).</li>
<li>Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nocodazole+and+taxol+affect+subcellular+compartments+but+not+secretory+activity+of+GH3B6+prolactin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells.</a> Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).</li>
<li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+cis-Golgi+matrix+protein%2C+GM130%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130.</a> J Cell Biol. 131, 6 Pt 2 1715-1726 (1995).</li>
<li>Roth, J., Berger, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+localization+of+galactosyltransferase+in+HeLa+cells%3A+codistribution+with+thiamine+pyrophosphatase+in+trans-Golgi+cisternae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae.</a> J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).</li>
<li>Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+sulfation+is+a+trans-Golgi-specific+protein+modification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification.</a> J Cell Biol. 105 (6), Pt 1 2655-2664 (1987).</li>
<li>Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Arf-1+to+the+early+Golgi+by+membrin%2C+an+ER-Golgi+SNARE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE.</a> J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).</li>
<li>Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapled+Golgi+cisternae+remain+in+place+as+cargo+passes+through+the+stack%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack.</a> Elife. 2, 00558(2013).</li>
<li>Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+large+ADP-ribosylation+factor-guanine+nucleotide+exchange+factors+to+different+Golgi+compartments%3A+evidence+for+distinct+functions+in+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).</li>
<li>Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy-based+linescan+methodologies+for+intra-Golgi+localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins.</a> J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).</li>
<li>Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-independent+secretion+requires+functional+maturation+of+Golgi+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements.</a> J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).</li>
<li>Volchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Countercurrent+distribution+of+two+distinct+SNARE+complexes+mediating+transport+within+the+Golgi+stack%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack.</a> Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).</li>
<li>Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+budding+within+the+Golgi+stack%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">COPI budding within the Golgi stack.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231(2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

此前，在光学显微镜下对高尔基体蛋白定位的量化主要依赖于该蛋白图像与已知定位的高尔基体标志物图像之间的相关性或重叠程度15,16,17。所得的相关性或重叠系数反映了待测蛋白在空间上与高尔基体标志物的接近程度。然而，该方法至少存在三个局限性。第一，相关性或重叠系数是非线性的，不能直接反映空间距离。第二，相关性程度严重依赖于显微系统的分辨率，因此两个高尔基体蛋白之间的系数并非系统无关的常数。第三，具有相同轴向定位但沿高尔基池侧向分布不同的两个高尔基体蛋白可能表现出不同的系数。因此，相关性或重叠系数并不能指示高尔基体蛋白的轴向定位。Dejgaard et al. 提出了一种替代方法，即在经诺考达唑处理的高尔基体迷你堆上对cis、trans-高尔基体标志物及目标蛋白进行三重标记，类似于GLIM方法。在每个高尔基体迷你堆中，获取三个信号最强像素点的位置，并将待测蛋白的相对位置计算为距离比值<sup class=...

高尔基体在哺乳动物细胞中对蛋白质和脂质的分泌/内吞运输（以下简称货物）起着至关重要的作用1,2,3在高尔基体中，货物不仅被分选至各种亚细胞区室，还通过多种类型的糖基化进行修饰。哺乳动物的高尔基复合体由许多侧向连接的高尔基堆组成，每个高尔基堆通常包含4至11个紧密相邻且扁平的膜性囊泡，称为潴泡。这些依次堆叠的高尔基潴泡从一端到另一端可进一步分为 顺式，内侧和 转-池。在 转高尔基体堆的-侧 转- 大多数膜囊发育成一种称为管状网状膜网络的结构 转高尔基体网络（TGN）4在分泌途径中，源自内质网（ER）的货物在其高尔基堆的入口处进入 顺式侧，然后依次通过内侧和 转-池。货物最终从高尔基体的 转-高基氏体或反式高尔基网络靶向质膜、内体或分泌颗粒。
货物如何通过高尔基体堆栈以及高尔基体如何维持其囊泡结构的分子与细胞机制至今仍不明确，目前仍存在激烈争论1。该领域的一个难点在于，高尔基体囊泡只能通过电子显微镜（EM）才能分辨，因为光学显微镜的分辨率（约 200 nm）不足以分辨单个高尔基体囊泡（囊泡厚度和间距均&#60; 100 nm）。因此，高尔基体亚结构中驻留蛋白和转运货物的定位通常依赖免疫金标记电镜（immuno-gold EM）来确定。然而，免疫金标记电镜技术难度极高，超出了大多数细胞生物学实验室的能力范围。尽管电子显微镜本身的分辨率可达亚纳米级别，但免疫金标记电镜的实际分辨率受到抗体复合物（一抗加二抗）和金颗粒尺寸的严重限制，分辨率可能劣于 20 nm。此外，电镜图像来源于二维超薄切片，而非高尔基体的三维整体视图，这可能导致错误结论，具体取决于二维切片的相对位置和取向5。例如，仅凭一张电镜单层切片无法可靠区分囊泡与小管的正交截面，因为两者均可呈现相同的圆形膜轮廓。近年来兴起的超分辨率显微技术，如三维结构照明显微镜（3D-SIM）、受激辐射损耗显微镜（STED）、光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM），使得在光学显微镜下分辨高尔基体亚结构成为可能6。然而，这些技术至少存在四个显著缺陷，严重限制了其在细胞生物学中对高尔基体研究的应用：1）当前的超分辨率技术需要昂贵且特殊的硬件配置，大多数细胞生物学实验室难以具备；2）某些超分辨率技术需要特殊的荧光标记方案；3）尽管在最佳条件下这些技术声称可达到 20–110 nm 的空间分辨率，但在实际样品中获得的分辨率往往远低于此；4）与常规显微镜相比，这些超分辨率技术在多色、三维或活细胞成像方面，无论是单独还是组合应用，仍然面临困难。或许最重要的是，免疫金标记电镜和超分辨率显微技术所提供的均为定性而非定量的定位数据。
为了部分解决上述问题，我们近期开发了一种基于常规光学显微镜的方法，称为通过质心成像实现高尔基体蛋白定位（Golgi protein localization by imaging centers of mass, GLIM），可系统性且定量地将高尔基体蛋白定位至相当于免疫胶体金电镜的分辨率水平7。该方法中，通过使用诺考达唑（nocodazole）处理培养的哺乳动物细胞，使高尔基体分散为高尔基体迷你堆（Golgi mini-stacks），诺考达唑是一种微管去聚合药物。大量研究表明，诺考达唑诱导形成的高尔基体迷你堆（下文简称高尔基体迷你堆）在结构组织和细胞功能方面均与天然高尔基体堆高度相似8,9,10,11。通过GLIM方法可获得待测蛋白的定位商值（localization quotient, LQ），该数值表示蛋白在高尔基体内的亚区室定量定位信息。LQ的数值可进行相互比较，目前已建立包含25种以上高尔基体标志蛋白的LQ数据库。
在GLIM中，高尔基体小堆通过内源性或外源性表达的GM130、GalT-mCherry和待测蛋白（x）进行三重标记。GM130和GalT-mCherry分别为cis-和trans-高尔基体标志物12,13，提供参考点。三色荧光信号——红色（R）、绿色（G）和远红（B）——被人为显示为红、绿、蓝三色。采用荧光质心（以下简称“中心”）以实现亚像素分辨率。高尔基体轴定义为GM130质心指向GalT-mCherry质心的向量。高尔基体小堆被建模为围绕高尔基体轴具有无限旋转对称性的圆柱结构。因此，高尔基体小堆可进一步简化为沿高尔基体轴的一维结构。待测蛋白x的LQ定义为dx/d1，其中dx表示蛋白x质心到GM130质心的距离，d1表示GalT-mCherry质心到GM130质心的距离。若蛋白x的质心偏离轴线，则使用其在轴上的投影距离进行计算。GLIM中的变量，包括高尔基体轴、轴向角、dx、d1、角α和角β，在图1中进行了示意图说明。LQ与高尔基体轴向角无关，因为细胞内高尔基体小堆的取向是随机的。
高尔基体小堆在图像中呈现不均匀性。我们制定了三个标准来为GLIM选择可分析的高尔基体小堆。1）信噪比标准，即每个通道中高尔基体小堆的总强度与背景标准差（SD）之比≥30。该标准旨在确保质心定位的准确性，因为质心定位精度依赖于高尔基体小堆的信噪比。2）轴向角度或距离标准，要求d1≥70 nm。d1随高尔基体轴向角度的增大而减小。当轴向角度接近90°（即垂直方向）时，d1趋近于0，导致小堆无法分辨。d1≥70 nm可有效排除接近垂直的高尔基体小堆。3）共线性标准，要求|tan α|或|tan β|≤0.3。该标准确保一个小堆的三个中心点足够共线，以满足我们对高尔基体小堆建立的一维模型。所有光学显微镜均存在色差问题，这会严重扭曲红色、绿色和远红荧光中心的相对位置。显微镜系统的色差通过成像110 nm的三标（红、绿、远红荧光）微球进行实验校准。对于每个微球图像，以红色中心定义为微球的真实位置，并通过一阶多项式函数拟合绿色和远红荧光中心的色位移。高尔基体小堆的中心位置需经由该多项式函数校正绿色和远红通道中的色位移。
在标准条件下，通过GLIM技术可沿高尔基体轴向实现约30 nm的分辨率。重要的是，该方法为定量绘制任何高尔基体蛋白的空间分布提供了一种系统性的策略。GLIM可在常规显微镜（如宽场或共聚焦显微镜）上进行，结合常用的荧光标记方案即可完成。成像与数据处理最快可在一小时内完成。利用GLIM，我们已直接证实了分泌性货物蛋白在高尔基体从cis侧向trans侧的渐进式转运过程7。

<table><tbody><tr><td>荧光微球。商品名：TetraSpeck beads</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td>作为多色微球用于校正显微镜的色差位移</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片 &amp;Phi; 12 mm（No. 1.5）</td><td>Menzel</td><td>CB00120RAC</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片 &amp;Phi; 25 mm（No. 1.5）</td><td>Menzel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Capricon</td><td>DMEM-HPA-P50</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GE Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>诺考达唑（Nocodazole）</td><td>Merck</td><td>487928</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂。商品名：Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>转染培养基。商品名：OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TPST1-EGFP</td><td>Addgene</td><td>66617</td><td>由英国布里斯托大学D. Stephens惠赠</td></tr><tr><td>GalT-mCherry</td><td></td><td></td><td>本实验室制备</td></tr><tr><td>多聚甲醛（paraformaldehyde）</td><td>Merck</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>皂苷（saponin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇（Mw ~31,000）。商品名：Mowiol-488</td><td>CALBIOCHEM</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人GM130抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>610823</td><td>人源GM130的一抗</td></tr><tr><td>远红荧光标记的山羊抗小鼠IgG。商品名：Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td>远红荧光标记的二抗</td></tr></tbody></table>

通过成像荧光质量中心对高尔基体蛋白进行定量定位

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

高尔基体复合物由一系列平行堆叠的膜性扁囊组成，可进一步分为不同的亚高尔基区，包括顺式高尔基体（cis-Golgi）、中间高尔基体（medial-Golgi）、反式高尔基体（trans-Golgi）以及反式高尔基体网络（trans-Golgi network）。高尔基体的细胞功能取决于其驻留蛋白的特征性分布。传统光学显微镜的空间分辨率过低，无法分辨亚高尔基结构或扁囊。因此，免疫金标电子显微镜是实现高尔基体蛋白亚区定位的首选方法。然而，该技术及仪器超出了大多数细胞生物学实验室的能力范围。本文介绍我们近期开发的一种超分辨率方法——基于质心成像的高尔基体蛋白定位法（GLIM），可用于系统性且定量地定位高尔基体蛋白。GLIM基于标准的荧光标记流程以及常规的宽场或共聚焦显微镜。该方法包括显微系统色位移像差的校准、图像采集以及采集后的分析。待测蛋白的亚高尔基定位以定位商值进行定量表达。GLIM具有四个主要优势：快速、基于常规方法和工具、定位结果为定量数据，并可在高尔基体轴向上实现约30 nm的实际分辨率。本文详细描述了使用GLIM方法定位待测高尔基体蛋白的具体实验流程。

配备平场复消色差物镜的现代科研级光学显微镜（例如本实验室所使用的显微镜）表现出极小的色差（图2A）。然而，仔细检查同一荧光微珠的多色荧光图像，仍可观察到不同颜色图像之间的位移（图2B）。我们将红色通道定义为无色差，因此红色荧光的中心即为微珠的真实位置。绿色和远红荧光的相对色位移可用从红色荧光中心出发的绿色和蓝色矢量表示（图2C）。每个微珠的成像平面上的色位移通过绿色和蓝色矢量经验性地展示出来（图2D）。对于本显微镜系统，色位移并不均匀，其位移的大小和方向随x和y位置的变化而变化。色位移会显著影响GLIM的准确性，因为远红荧光中心的位移可达50 nm。因此，必须对色位移进行校正。在获取微珠中心位置后，我们...

高尔基体驻留蛋白的精确定位对于理解高尔基体的细胞功能至关重要。然而，传统的光学显微镜无法分辨高尔基体的亚结构。本文介绍了一种基于常规显微镜的超分辨率方法，用于定量确定蛋白质在高尔基体内的亚定位。

高尔基体由一系列堆叠的膜性扁囊组成，可进一步分为高尔基体亚区，包括顺面高尔基体（cis-Golgi）、……

本成像方法的总体目标是以纳米级分辨率对高尔基体蛋白进行精确定位。该方法有助于解答高尔基体研究中的关键问题，例如高尔基体的结构组成及其功能机制。该方法的主要优势在于其使用常规光学显微镜和软件工具即可实现。首先，在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，于37°C和5%二氧化碳条件下，在T25培养瓶中培养HeLa细胞。当细胞融合度达到约80%时，吸除培养基，向培养瓶中加入1毫升25%胰蛋白酶-EDTA溶液。将细胞在37°C下孵育2分钟。从培养箱中取出细胞，加入一毫升完全培养基，轻轻冲洗培养瓶壁以使细胞脱落。将脱落的细胞转移至无菌离心管中，在500 ×g 下离心两分钟以沉淀细胞。吸除上清液后，用一毫升完全培养基重悬细胞沉淀。从含有无菌玻璃盖玻片的24孔板孔中移除培养基，向孔中接种约100,000个细胞。用完全培养基将孔内液体体积补至5毫升。随后，将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育。当细胞达到80%融合度时，使用80纳克GalT-mCherry和320纳克TPST1-EGFP质粒DNA，按照制造商的说明书与转染试剂共同转染细胞。将细胞孵育4至6小时后，更换培养基，并将细胞放回培养箱中继续孵育12小时。吸除孔内培养基，加入5毫升含33微摩尔诺考达唑的完全培养基，然后在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育细胞3小时。按照文本方案清洁玻璃盖玻片后，使用含1微克/微升BSA的一倍PBS缓冲液将110纳米多色荧光微球稀释80倍。短暂涡旋混匀管内液体以分散微球聚集体。用移液器吸取60微升稀释后的微球溶液，均匀滴加到洁净的盖玻片上。在暗处，将盖玻片放入一个35毫米的培养皿中，并用铝箔覆盖。将盖玻片置于连接真空泵的干燥器中，在暗处干燥。然后使用50 µL封片剂将盖玻片封固在载玻片上。正确清洁的盖玻片对于消除荧光碎屑至关重要。为了在绿色、红色和远红通道中对多色微球进行成像，在成像开始时应采集三维图像堆栈，分别在最佳焦平面的上方和下方各采集三个层面。将这些堆栈保存为TIFF文件。为了成像高尔基体小片段，使用转染了 TPST1-EGFP 和 GalT-mCherry 的荧光标记载玻片，寻找表达 TPST1-EGFP 且 GalT-mCherry 表达水平为低或中等的细胞。按照前述方法采集三维图像序列。为分析图像，在 ImageJ 中选择“文件”→“图像”→“打开”，以打开一组包含三个 TIFF 文件的微珠图像。选择图像，堆栈，Z 投影，以在红色通道中对最佳焦平面周围的三个连续切片进行平均。输入起始切片和终止切片的切片编号，在投影类型选项中选择平均强度。在图像中绘制不包含微珠的背景感兴趣区域（ROI）。然后在“分析”中，选择“设置测量值”，仅勾选平均灰度值和标准差（SD）。执行“分析”→“测量”，以获得背景的平均强度和标准差。选择“处理”→“数学运算”→“减去”，将图像减去背景平均强度加上六倍标准差的对应值，然后输入该通道对应的计算值。使用相同的起始和终止切片以及相同的背景 ROI，对绿色和远红通道的图像堆栈重复进行平均和减去背景的操作。通过选择图像、颜色、合并通道，将通道 R 设为红色，通道 G 设为绿色，通道 B 设为蓝色，合并这三个处理后的图像。通过选择分析、工具、ROI 管理器，启动 ROI 管理器。在单个微珠周围绘制方形感兴趣区域（ROI）。然后按键盘上的 T 键将该 ROI 添加到 ROI 管理器中。在“分析”菜单下选择“设置测量值”，仅勾选“质心”选项。在 ROI 管理器中，选择 R 通道，单击“测量”以获取结果窗口中 ROI 中心的 X 和 Y 坐标。将这两列数据复制并粘贴到电子表格中。获取 G 通道和 B 通道 ROI 中心的坐标。将电子表格保存为 beads.csv。在 Image J 中，使用插件安装功能来安装两个宏：“macro golgi ROI inspection”和“macro output three channels data”。清除 ROI 管理器和结果窗口。打开一组由三个 TIFF 文件组成的高尔基体小栈图像。按照本视频前面演示的方法生成背景相减后的图像，以供后续使用。然后复制这些图像。在“处理”菜单下选择“图像计算器”，将背景相减后的通道G、通道R和通道B的图像相加。在“图像”下的“调整”中，选择“阈值”，将输入的最低阈值设为1。在“分析”下的“分析颗粒”中，同时输入像素大小范围，设置为50至无穷大，勾选“排除边缘”，并添加到管理器中。接下来，使用图像、颜色、合并通道功能，将之前生成的三个扣除背景后的图像进行合并，选择通道 R 作为红色，通道 G 作为绿色，通道 B 作为蓝色。然后通过选择插件、宏、Golgi ROI Inspection 来运行宏 macro golgi ROI inspection。在一组图像中，应尽可能多地选择包含单个高尔基体迷你堆的 ROI。在“分析”中，设置测量参数，仅勾选面积、平均灰度值和质心。通过启动宏工具获取数据，宏将输出三个通道的数据。按此处列出的顺序，将质心坐标复制到电子表格中。然后将电子表格另存为 ministacks.csv。根据文本方案，继续进行中心点的色差校正以及定位商（Localization Quotient，LQ）的计算。配备普通复消色差物镜（如本实验所用）的现代科研级光学显微镜，其色差位移极小。然而，仔细检查多色微珠图像可以揭示这一点。红色荧光的中心被定义为微珠的真实位置。绿色和远红荧光的相对色差偏移可用矢量表示。成像平面内的色差通过每个微珠的绿色和蓝色矢量表示。如图所示，色差校正显著减小了色差。在哺乳动物细胞中，高尔基体复合物聚集在核周区域，通常在常规光学显微镜下无法分辨。经诺考达唑处理后，核周高尔基复合体消失，数十个高尔基小体堆栈在内质网出芽位点处组装，分布于整个细胞质中。此处展示的是通过本视频所述图像分析方法生成的一个示例图像。使用高尔基体ROI检测宏工具，列出了40个选定的高尔基小体堆栈。在应用三项标准后，共有21个高尔基体小堆可用于TPST1-EGFP定位质量（LQs）的计算。一旦掌握该技术，在完成荧光标记后，可在一小时内完成操作。该方法建立后，为研究高尔基体的研究人员提供了定量定位高尔基体蛋白的手段，其分辨率可达到免疫电镜水平。

quantitative-localization-golgi-protein-imaging-its-center

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高尔基蛋白质荧光质量中心的定量定位

我们描述了一种在电子显微照片中定位荧光标记蛋白的方法。首先在超薄切片上利用光激活定位显微镜对荧光信号进行定位，然后将这些图像与同一切片的电子显微照片进行配准对齐。...

纳米级荧光-电子显微：利用光激活定位显微镜与电子显微镜进行蛋白质定位

突触处聚集的神经递质受体丰度显著影响突触强度。该方法可在单个突触分辨率下，对秀丽隐杆线虫（C.

C. elegans 中突触荧光的自动化定量分析

在此，开发了一种新型的定量荧光检测方法，通过将特定蛋白在中心体处的荧光强度归一化至适当的内参标准荧光强度，从而定量检测该蛋白在中心体局部水平的变化。...

定量免疫荧光测定法用于测量中心体蛋白水平的变化

本文描述了一种用于可视化并定量亚细胞区室中局部翻译事件的方法。该方法仅需基础的共聚焦成像系统及试剂，具有快速、经济高效的特点。...

定量免疫荧光法检测全局限域性翻译

本文概述了一种利用基态耗尽（GSD）超分辨率显微技术在哺乳动物细胞中检测一种或多种血浆和/或细胞内膜蛋白的实验方案。本文讨论了采用此类方法在细胞蛋白可视化与定量分析中的优势及注意事项。...

基态耗尽超分辨率成像在哺乳动物细胞中的应用

本文介绍了一种在活细胞细胞器中对单个膜蛋白进行多色定位的实验方案。通过使用自标记蛋白来连接荧光染料，可对同一细胞器不同膜区室中分布的蛋白质实现约18...

活体哺乳动物细胞器中单个膜蛋白的多色定位显微成像

本文介绍了一种定量分析方法，通过免疫荧光染色、共聚焦显微镜和计算机辅助分析，确定突触蛋白相对于标记蛋白的分布情况。...

使用免疫荧光法量化小鼠脑内突触蛋白的异质性分布

SUMO 是一种必需且高度保守的小分子泛素样修饰蛋白。本实验方案描述了利用一种耐受应激的重组 SUMO 捕获蛋白（kmUTAG）来可视化多种细胞类型中天然的、未标记的 SUMO...

利用荧光Sumo捕获蛋白定位SUMO化修饰蛋白

本方案描述了可用于研究ATG9A生物学的多种方法，包括免疫荧光结合图像分析、瞬时过表达的注意事项，以及利用蛋白质印迹法检测ATG9A糖基化状态。...

成像ATG9A，一种多跨膜蛋白

本文介绍了一种在siRNA转染后对活体哺乳动物组织培养细胞进行有丝分裂时间成像与定量分析的基本实验方案。...

siRNA 转染后有丝分裂的延时成像

学习利用常规显微镜和软件工具对高尔基体蛋白质进行纳米级精确定量的定位分析方法。该技术使用HeLa细胞培养，通过荧光标记和图像处理，帮助研究人员深入理解高尔基体的组织结构与功能机制。

通过成像荧光质量中心对高尔基体蛋白进行定量定位

探索更多视频