通过成像荧光质量中心对高尔基体蛋白进行定量定位

本成像方法的总体目标是以纳米级分辨率对高尔基体蛋白进行精确定位。该方法有助于解答高尔基体研究中的关键问题，例如高尔基体的结构组成及其功能机制。该方法的主要优势在于其使用常规光学显微镜和软件工具即可实现。

首先，在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，于37°C和5%二氧化碳条件下，在T25培养瓶中培养HeLa细胞。当细胞融合度达到约80%时，吸除培养基，向培养瓶中加入1毫升25%胰蛋白酶-EDTA溶液。将细胞在37°C下孵育2分钟。

从培养箱中取出细胞，加入一毫升完全培养基，轻轻冲洗培养瓶壁以使细胞脱落。将脱落的细胞转移至无菌离心管中，在500 ×g 下离心两分钟以沉淀细胞。吸除上清液后，用一毫升完全培养基重悬细胞沉淀。

从含有无菌玻璃盖玻片的24孔板孔中移除培养基，向孔中接种约100,000个细胞。用完全培养基将孔内液体体积补至5毫升。随后，将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育。

当细胞达到80%融合度时，使用80纳克GalT-mCherry和320纳克TPST1-EGFP质粒DNA，按照制造商的说明书与转染试剂共同转染细胞。将细胞孵育4至6小时后，更换培养基，并将细胞放回培养箱中继续孵育12小时。吸除孔内培养基，加入5毫升含33微摩尔诺考达唑的完全培养基，然后在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育细胞3小时。

按照文本方案清洁玻璃盖玻片后，使用含1微克/微升BSA的一倍PBS缓冲液将110纳米多色荧光微球稀释80倍。短暂涡旋混匀管内液体以分散微球聚集体。用移液器吸取60微升稀释后的微球溶液，均匀滴加到洁净的盖玻片上。

在暗处，将盖玻片放入一个35毫米的培养皿中，并用铝箔覆盖。将盖玻片置于连接真空泵的干燥器中，在暗处干燥。然后使用50 µL封片剂将盖玻片封固在载玻片上。

正确清洁的盖玻片对于消除荧光碎屑至关重要。为了在绿色、红色和远红通道中对多色微球进行成像，在成像开始时应采集三维图像堆栈，分别在最佳焦平面的上方和下方各采集三个层面。将这些堆栈保存为TIFF文件。

为了成像高尔基体小片段，使用转染了 TPST1-EGFP 和 GalT-mCherry 的荧光标记载玻片，寻找表达 TPST1-EGFP 且 GalT-mCherry 表达水平为低或中等的细胞。按照前述方法采集三维图像序列。为分析图像，在 ImageJ 中选择“文件”→“图像”→“打开”，以打开一组包含三个 TIFF 文件的微珠图像。

选择图像，堆栈，Z 投影，以在红色通道中对最佳焦平面周围的三个连续切片进行平均。输入起始切片和终止切片的切片编号，在投影类型选项中选择平均强度。在图像中绘制不包含微珠的背景感兴趣区域（ROI）。

然后在“分析”中，选择“设置测量值”，仅勾选平均灰度值和标准差（SD）。执行“分析”→“测量”，以获得背景的平均强度和标准差。选择“处理”→“数学运算”→“减去”，将图像减去背景平均强度加上六倍标准差的对应值，然后输入该通道对应的计算值。

使用相同的起始和终止切片以及相同的背景 ROI，对绿色和远红通道的图像堆栈重复进行平均和减去背景的操作。通过选择图像、颜色、合并通道，将通道 R 设为红色，通道 G 设为绿色，通道 B 设为蓝色，合并这三个处理后的图像。通过选择分析、工具、ROI 管理器，启动 ROI 管理器。

在单个微珠周围绘制方形感兴趣区域（ROI）。然后按键盘上的 T 键将该 ROI 添加到 ROI 管理器中。在“分析”菜单下选择“设置测量值”，仅勾选“质心”选项。

在 ROI 管理器中，选择 R 通道，单击“测量”以获取结果窗口中 ROI 中心的 X 和 Y 坐标。将这两列数据复制并粘贴到电子表格中。获取 G 通道和 B 通道 ROI 中心的坐标。将电子表格保存为 beads.csv。

在 Image J 中，使用插件安装功能来安装两个宏：“macro golgi ROI inspection”和“macro output three channels data”。清除 ROI 管理器和结果窗口。打开一组由三个 TIFF 文件组成的高尔基体小栈图像。

按照本视频前面演示的方法生成背景相减后的图像，以供后续使用。然后复制这些图像。在“处理”菜单下选择“图像计算器”，将背景相减后的通道G、通道R和通道B的图像相加。

在“图像”下的“调整”中，选择“阈值”，将输入的最低阈值设为1。在“分析”下的“分析颗粒”中，同时输入像素大小范围，设置为50至无穷大，勾选“排除边缘”，并添加到管理器中。

接下来，使用图像、颜色、合并通道功能，将之前生成的三个扣除背景后的图像进行合并，选择通道 R 作为红色，通道 G 作为绿色，通道 B 作为蓝色。然后通过选择插件、宏、Golgi ROI Inspection 来运行宏 macro golgi ROI inspection。在一组图像中，应尽可能多地选择包含单个高尔基体迷你堆的 ROI。

在“分析”中，设置测量参数，仅勾选面积、平均灰度值和质心。通过启动宏工具获取数据，宏将输出三个通道的数据。按此处列出的顺序，将质心坐标复制到电子表格中。

然后将电子表格另存为 ministacks.csv。根据文本方案，继续进行中心点的色差校正以及定位商（Localization Quotient，LQ）的计算。配备普通复消色差物镜（如本实验所用）的现代科研级光学显微镜，其色差位移极小。

然而，仔细检查多色微珠图像可以揭示这一点。红色荧光的中心被定义为微珠的真实位置。绿色和远红荧光的相对色差偏移可用矢量表示。

成像平面内的色差通过每个微珠的绿色和蓝色矢量表示。如图所示，色差校正显著减小了色差。在哺乳动物细胞中，高尔基体复合物聚集在核周区域，通常在常规光学显微镜下无法分辨。

经诺考达唑处理后，核周高尔基复合体消失，数十个高尔基小体堆栈在内质网出芽位点处组装，分布于整个细胞质中。此处展示的是通过本视频所述图像分析方法生成的一个示例图像。使用高尔基体ROI检测宏工具，列出了40个选定的高尔基小体堆栈。

在应用三项标准后，共有21个高尔基体小堆可用于TPST1-EGFP定位质量（LQs）的计算。一旦掌握该技术，在完成荧光标记后，可在一小时内完成操作。该方法建立后，为研究高尔基体的研究人员提供了定量定位高尔基体蛋白的手段，其分辨率可达到免疫电镜水平。