使用 madSTORM 对 T 细胞进行高度多重化的超分辨率成像

本成像方案的总体目标是利用单分子定位显微镜技术，对活化T细胞中的多种蛋白质进行可视化观察。该方法有助于解答T细胞活化研究领域中的关键问题，例如T细胞受体（TCR）或微簇成分的单分子分布情况。该技术的主要优势在于，相较于目前常用的共聚焦显微镜方法，能够实现更高程度的多重检测。

首先，使用 Alexa 647 抗体标记试剂盒，按照制造商提供的标记方案将抗体直接与 Alexa 647 染料进行偶联。将标记后的抗体在 20,800 × g 条件下离心 5 分钟。离心后，收集上清液以去除聚集的抗体。接下来，用 250 µL 的 0.1% 多聚赖氨酸（poly-L-lysine）对 A12 盖玻片培养皿进行包被，孵育 15 分钟。

然后，吸除溶液并不进行冲洗，将小室在 65 °C 下干燥 30 分钟。用 1× PBS 配制 100 纳米荧光纳米金刚石（FNDs）的稀释液，测试不同稀释度以确保每个视野中有足够数量的 FNDs 可见。将稀释后的 FNDs 涡旋震荡 1 分钟。

接下来，将FND上清液在高功率条件下超声处理30秒。将超声处理后的FND上清液加入多聚-L-赖氨酸包被的A12盖玻片腔室中，室温孵育30分钟。用1×PBS洗涤腔室五次后，使用turf显微镜在647纳米激光激发下观察FND包被的腔室。

使用100倍物镜，视野为61 × 61微米。理想情况下，在适当的FND稀释度下，视野中应可见4至10个单独的FND，且成像视野的每个象限中至少有一个FND。当FND密度达到合适水平后，向每孔中加入250微升抗CD3抗体。

将培养板在37摄氏度孵育一小时，或在4摄氏度孵育过夜。孵育结束后，从孔中移除溶液，并加入1×PBS洗涤30秒。重复此洗涤步骤五次。

将1毫升Jurkat T细胞在800 × g条件下离心6分钟。离心前，Jurkat T细胞浓度应理想地调整至每毫升0.5×10⁶至1×10⁶个细胞。将细胞重悬于300 µL 1× HBS溶液中。

同时，向培养板的每个孔中加入 150 微升 1x HBS 溶液，在 37 摄氏度孵育 15 分钟。然后，向每个孔中加入 50 微升重悬的 Jurkat T 细胞，于 37 摄氏度孵育 3 分钟。接着，向每个孔中加入 300 微升 4% 多聚甲醛，于 37 摄氏度孵育 30 分钟。

用 1× PBS 洗涤三次后，在室温下加入 250 微升 0.1% Triton X 溶液，作用 5 分钟，以对细胞进行透化处理。随后用 1× PBS 再次洗涤三次，在每个孔中加入 250 微升 1% 鱼源明胶溶液，室温孵育 30 分钟。最后，再用 1× PBS 洗涤细胞三次。

在室温下，向固定后的细胞中加入200微升浓度为每毫升0.1至0.5微克的标记抗体，孵育一小时。用1×PBS洗涤细胞五次后，加入一毫升STORM缓冲液，并用玻璃盖玻片覆盖样品腔以减少暴露。使用显微镜载物台上的夹具将盖玻片固定到位。

此步骤对于大规模多重检测至关重要，因为在多轮洗涤和孵育后必须能够找到相同的视野。在涡流模式下使用较低的647纳米激光功率，定位视野中至少含有三个FND的染色细胞。随后提高647纳米激光功率并采集图像。

典型参数可在文本方案中找到。用1× tris缓冲盐水或1× TBS洗涤细胞五次。然后加入一毫升洗脱缓冲液，在室温下孵育一分钟。

重复洗脱三次。使用每种抗体所指定的确切洗脱条件和所需洗脱次数以去除信号。然后用1x TBS洗涤细胞三次，并加入一毫升1x PBS。

正确执行此洗脱步骤将去除先前结合的抗体，从而提高后续抗体标记的效率。在洗脱步骤之间使用TBS进行洗涤以尽量减少沉淀物的形成至关重要。使用647纳米激光以高功率对细胞进行光漂白，同时使用405纳米激光（2至5毫瓦）照射以激活处于暗态的Alexa 647染料。

等待未洗脱抗体的所有残留信号被光漂白。通常，这需要两到五秒的激光照射。在消像和光漂白后，使用STORM设置采集样品图像，以确认信号已被去除。

接下来，加入 250 微升 4% 多聚甲醛，作用 15 分钟。此步骤可防止细胞内固定分子发生逆转交联。用 1× PBS 洗涤细胞三次。

重复这些步骤以实现多个靶标的连续标记。最后，按照文本方案中所述进行多重图像堆栈的漂移校正和对齐。采用连续幻影与固定方法生成了活化Jurkat T细胞中微簇及其他结构的多重MET STORM图像。

最终的MET STORM图像已使用平均基准校正和FND基准标记对漂移和对齐进行了校正。此处显示的是单个FND在30,000帧图像中经平均基准校正前后漂移校正前后的单分子定位显微镜图像。类似地，此处还展示了经抗磷酸化SLP76抗体染色并用FND基准标记标记的活化Jurkat T细胞在平均基准校正前后漂移校正前后的单分子定位显微镜图像。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用MET STORM技术对活化T细胞中的蛋白质进行多重超分辨率成像。掌握该技术后，每轮多重成像可在三小时内完成。在操作过程中，务必注意保持样品在显微镜载物台上的位置不变。

可以使用载物台夹具来完成此操作。请注意，使用我们改良的STORM缓冲液时可能存在极高危险性，因此在进行该操作时，必须采取防护措施，例如佩戴呼吸器和护目镜。