使用凝胶内杂交来定量端粒长度的修饰末端限制片段分析
July 10th, 2017
在本文中，讨论了使用修饰的末端限制性片段分析量化端粒长度的详细方案，其提供了端粒长度的快速和有效的直接测量。该技术可以应用于DNA的各种细胞来源以量化端粒长度。
该程序的总体目标是使用端粒限制性片段分析程序的修改版本来确定真核细胞中端粒的长度，该程序由 Jerry W.Shay、Woodring Wright 博士及其同事描述。通过提供有关端粒长度的数据，该程序可以回答有关细胞生物学、行为医学、流行病学和传染病、年龄、压力、药物治疗和感染影响的问题。该技术的主要优点是它可以直接测量各种细胞中平均端粒长度的千碱基。
使用文本方案中所述的商业 DNA 提取试剂盒从细胞中提取待分析的基因组 DNA 样品。对最终体积为 20 至 40 μL 的基因组 DNA 进行消化。在每个微量离心管中混合以下物质：3 μg 基因组 DNA;10x DNA 消化缓冲液;1 微升 Rsa1 限制性内切酶;1 μL Hinf1 限制性内切酶;和无菌去离子水至最终体积。
短暂离心以确保所有组分都在试管底部。将消化液在 37 摄氏度下孵育至少 16 小时。按照文本方案中的说明制备 0.6% 琼脂糖溶液来开始此过程。
准备用于凝胶灌注的凝胶电泳系统。将端门连接到凝胶灌注托盘上。琼脂糖凝胶溶液冷却至 50 摄氏度后，将其倒入凝胶灌注盘中，将一个锥体放入凝胶中，并在室温下不加盖盖地让凝胶硬化 45 分钟。
从灌注盘上取下端门，然后从凝胶中取出电泳梳。将电泳缓冲液填充凝胶电泳系统至填充线，确保凝胶完全浸没在缓冲液中。将 DNA 样品加载到凝胶孔中，样品之间留一个空白孔。
将 10 μL DNA ladder 加入凝胶相对两端的孔中。在 150 伏特下运行凝胶电泳 30 分钟，以将 DNA 快速移动到凝胶中。30 分钟后，将电压调整为 57 伏，并运行 18 到 24 小时。
凝胶电泳 18 至 24 小时后，关闭电泳源，并从电泳缓冲液中取出装有凝胶的凝胶灌注盘。凝胶右上角的切片，作为凝胶方向的参考。将一张滤纸剪成比凝胶略大的尺寸。
将滤纸放在流延盘中的凝胶顶部，让滤纸吸收凝胶上多余的溶液。小心地去除滤纸和凝胶之间的气泡，使用移液管作为滚轮，从侧面挤出气泡。将凝胶和滤纸翻转过来，使滤纸位于凝胶下方，从灌注盘中取出凝胶。
将凝胶和滤纸转移到凝胶干燥器中，并用保鲜膜覆盖凝胶。使用移液管作为滚轮去除保鲜膜和凝胶之间的所有气泡。将凝胶在 50 摄氏度下干燥 2 小时。
凝胶干燥后，取下保鲜膜，将凝胶和滤纸转移到装有 250 毫升去离子水的玻璃皿中。小心地取出滤纸，并在室温下孵育凝胶 15 分钟。将凝胶放在 12 x 12 英寸的尼龙网上。
将尼龙网和凝胶卷在一起，确保凝胶不与自身接触。将网片和凝胶放入杂交管中。将 100 ml 5x SSC 和 12 μL 绿色荧光核酸染色剂混合，并放入杂交管中。
在42 摄氏度下在杂交炉中旋转孵育 30 分钟。避光保护溶液。30 分钟后，从杂交管中取出尼龙网和凝胶。
卷开并平放到装有 250 毫升去离子水的玻璃盘中。轻轻取下尼龙网。使用具有指定设置的磷光成像仪对凝胶进行成像。
按照设施处理放射性的规定准备放射性端粒探针。在微量离心管中混合以下物质：两微升端粒探针;2.5 μL 10x 多核苷酸激酶反应缓冲液;3 μL 到 3 μL 的 ATP，在 γ 磷酸基团上用 P32 标记;4 μL T4 多核苷酸激酶;以及不含 DNase 的无菌去离子水，最终体积为 20 μL。短暂离心管。
将试管置于 37 摄氏度的水浴中孵育 1 小时。短暂离心试管，并在 65 摄氏度下孵育 20 分钟以终止反应。将放射性探针溶液加载到准备好的 G25 色谱柱中，并以 700 x g 离心 2 分钟。
保存含有放射性端粒探针的滤液。将凝胶放入装有 250 毫升变性溶液的玻璃培养皿中，并在室温下孵育 15 分钟。去除变性溶液，更换为 250 毫升无菌去离子水。
在室温下在轨道摇床上孵育 10 分钟。去除去离子水。更换为 250 毫升中和溶液，并在室温下孵育 15 分钟。
将凝胶卷成尼龙网，然后放入杂交管中。加入 20 mL 杂交溶液，在 42 °C 的杂交炉中旋转孵育 10 分钟。10 分钟后，取出杂交溶液，换成 20 mL 新鲜的杂交溶液。
加入整个端粒探针，并在 42 摄氏度的杂交炉中旋转孵育过夜。当与端粒探针杂交完成后，从杂交管中取出凝胶和网片，并放入含有 250 毫升 2x SSC 的玻璃皿中。从培养皿中展开并取出尼龙网。
将玻璃培养皿放在定轨摇床上，在室温下孵育 15 分钟。取出 2 x SSC，更换为 250 ml 0.1x SSC 加 0.1% SDS 溶液，并在定轨摇床上室温孵育 15 分钟。去除 0.1x SSC 加 0.1% SDS 溶液。
更换为 250 mL 2x SSC，并在定轨摇床上再孵育 15 分钟。从 2x SSC 中取出凝胶，并用保鲜膜包裹凝胶。去除凝胶和保鲜膜之间的所有气泡和气穴。
将凝胶放入带有荧光粉屏的曝光盒中，并将荧光粉屏暴露在凝胶上过夜。第二天，使用荧光粉成像仪对曝光的荧光粉屏进行成像。荧光粉图像随后用于端粒长度定量，如文本协议中所述。
分析从永生化人包皮成纤维细胞系和人外周血单核细胞中分离的三种浓度的 DNA 的端粒长度。这张用绿色荧光核酸染料染色的干燥 agerose 凝胶的荧光粉图像显示了泳道 1 和 8 中 DNA 分子量标准条带的位置。从凝胶顶部到每个分子量标准品的测量距离用蓝色箭头表示。
与端粒探针杂交后，端粒条带在每个泳道中显示为弥散条带。计算每个泳道加一个背景泳道的 150 个方框的网格。将显示每组样品的选定分析区域。
为每组样品选择标记为 B 的单独背景泳道，以确保每组样品的背景强度相似。平均端粒长度计算显示，永生化细胞系的平均端粒长度高于人外周血单核细胞。这些结果还表明，每个泳道中分析的基因组 DNA 量对于杂交后获得可检测信号至关重要。
一旦掌握，这项技术可以在 12 小时内完成，分 2 1/2 天进行，如果执行得当，可以进行两次过夜孵育。在尝试此程序时，请务必记住每个样品至少使用 3 微克 DNA，并一式两份测量每个样品。开发后，这项技术为衰老领域的研究人员探索负责维持不同动物物种（包括人类）端粒长度的机制铺平了道路。
看完这个视频，你应该对如何直接确定端粒本身的平均长度有了很好的了解。不要忘记，与放射性一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如穿着实验室外套和手套。
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概述
本文介绍了一种使用修改终端限制片段分析法来量化端粒长度的协议。该方法允许快速高效地直接测量各种细胞类型的端粒长度。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 遗传学
- 行为医学
背景
- 端粒对于染色体的稳定性至关重要。
- 了解端粒长度可以为衰老和疾病提供见解。
- 该协议基于领先研究人员的既定方法。
- 它可以应用于不同来源的基因组DNA。
研究目的
- 测量真核细胞中的端粒长度。
- 探索年龄和压力等各种因素对端粒长度的影响。
- 为相关领域的研究人员提供可靠的方法。
所用方法
- 使用商业试剂盒从细胞中提取基因组DNA。
- 用特定的限制性内切酶消化DNA。
- 以千碱基对为单位测量端粒长度。
- 该方法适用于各种细胞类型。
主要结果
- 该协议提供了端粒长度的直接测量。
- 结果可以为流行病学和传染病研究提供信息。
- 获得的数据可以帮助理解药物治疗的影响。
- 研究结果有助于拓展细胞生物学的广泛知识。
结论
- 修改后的分析提供了一种用于端粒长度测量的稳健方法。
- 它增强了对各种生物学背景下端粒动力学的理解。
- 该技术适用于广泛的研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative telomere length measurement is critical for de-risking early discovery programs focused on cellular aging, genome stability, and stress response. The modified terminal restriction fragment (TRF) analysis with in-gel hybridization provides direct, absolute kilobase readouts, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. This capability enables robust portfolio triage and informs translational continuity across diverse cell models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Direct kilobase quantification of telomere length enables functional interrogation of aging and genome maintenance pathways.
- Supports biological de-risking by providing mechanistic evidence for target engagement and pathway modulation.
- Facilitates predictive confidence in early-stage target validation and prioritization decisions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, quantitative telomere length assays for downstream compound screening workflows.
- Enables reproducible measurement across cell types, supporting assay standardization and platform scalability.
- Provides robust quantitative outputs for reliable compound evaluation and comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns telomere length as a translational biomarker for disease-relevant models and preclinical studies.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct measurement in primary and immortalized cells.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative biomarker data.
Pipeline & Workflow Integration
This modified TRF analysis integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, assay development, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Provides direct evidence for telomere dynamics in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers standardized, quantitative telomere length outputs suitable for high-confidence screening campaigns.
- Analytics: Generates reproducible, absolute measurements for cross-condition and cross-sample comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by supporting biomarker-driven model selection.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, validated workflow for telomere quantification across multiple programs and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in telomere biology studies.
- Operational Value: Standardizes telomere measurement, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust biomarker data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of programs targeting genome stability and aging pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and safe handling of radioisotopes.
- Needs access to gel electrophoresis, hybridization ovens, and phosphorimaging infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample preparation and quantification.
- Adaptable to various eukaryotic cell models with appropriate DNA input and assay controls.
- Signal intensity and background correction are critical for reliable quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Genomic DNA Digestion
1:39
Genomic DNA Gel Electrophoresis
2:56
Gel Fluorescent Imaging and Hybridization
5:17
Hybridization with Telomere Probe
7:36
Gel Washing, Phospher Screen Exposure, and Radio Imaging
9:08
Results: Telomere Length is Quantified by a Modefied Terminal Restriction Fragment Analysis
10:28
Conclusion
