使用凝胶内杂交法进行改良末端限制性片段分析以定量端粒长度

本实验的总体目标是利用 Jerry W. Shay、Woodring Wright 及其同事所描述的端粒限制性片段分析方法的一种改进版本，测定真核细胞中端粒的长度。通过提供端粒长度的数据，该方法可用于回答细胞生物学、行为医学、流行病学和传染病学领域中的问题，例如年龄、压力、药物治疗和感染对端粒长度的影响。该技术的主要优势在于，它能够以千碱基（kilobases）为单位，直接测量多种细胞中端粒的平均长度。

待分析的基因组DNA样品是按照文本方案所述，使用商业DNA提取试剂盒从细胞中提取的。在20至40微升的终体积中进行基因组DNA的消化反应。在每个微量离心管中加入以下组分：三微克基因组DNA；10倍浓度的DNA消化缓冲液；一微升Rsa1限制性内切酶；一微升Hinf1限制性内切酶；以及无菌去离子水补足至终体积。

短暂离心，确保所有组分位于管底。在37摄氏度下孵育消化反应，时间至少为16小时。首先按照文本方案中的描述制备0.6%琼脂糖溶液，以开始本实验步骤。

准备凝胶电泳系统以进行凝胶制备。将两端的挡板安装到凝胶制胶槽上。当琼脂糖凝胶溶液冷却至50摄氏度时，将其倒入制胶槽中，插入梳子，并在室温下敞口静置45分钟，使凝胶完全凝固。

从制胶托盘上取下两端的挡板，并从凝胶中取出梳子。向电泳槽中加入电泳缓冲液至加样孔填充线，确保凝胶完全浸没在缓冲液中。将DNA样品加入凝胶的加样孔中，样品之间留出一个空白孔。

在凝胶两端的加样孔中各加入10 µL DNA Marker。以150伏电压进行凝胶电泳30分钟，使DNA快速进入凝胶。30分钟后，将电压调整至57伏，继续电泳18至24小时。

凝胶电泳运行 18 至 24 小时后，关闭电泳电源，将装有凝胶的玻璃板从电泳缓冲液中取出。切下凝胶右上角的一小部分，作为凝胶方向的标记。裁剪一张滤纸，使其尺寸略大于凝胶。

将滤纸放置在制胶盘中凝胶的上方，使滤纸吸去凝胶表面的多余溶液。使用移液枪作为滚轮，轻轻挤压滤纸与凝胶之间的气泡，使其从边缘排出。将凝胶连同滤纸一起翻转，使滤纸位于凝胶下方，从而将凝胶从制胶盘中取出。

将带有滤纸的凝胶转移至凝胶干燥仪中，并用塑料膜覆盖凝胶。使用移液管作为滚轮，去除塑料膜与凝胶之间的所有气泡。在50°C下干燥两小时。

凝胶干燥后，除去塑料膜，将凝胶和滤纸转移至含有 250 毫升去离子水的玻璃皿中。小心移除滤纸，将凝胶在室温下孵育 15 分钟。将凝胶置于一张 12 英寸×12 英寸的尼龙网筛上方。

将尼龙膜和凝胶一起卷起，确保凝胶不会相互接触。将尼龙膜和凝胶放入杂交管中。混合 100 毫升 5x SSC 和 12 微升绿色荧光核酸染料，并加入杂交管中。

在42摄氏度的杂交炉中旋转孵育30分钟。避光保护溶液。30分钟后，从杂交管中取出尼龙网和凝胶。

将凝胶卷开并平放于含有 250 毫升去离子水的玻璃培养皿中。轻轻去除尼龙网膜。使用磷屏成像仪，按照指定设置对凝胶进行成像。

按照放射性操作设施的规定制备放射性端粒探针。在微量离心管中加入以下组分：2 微升端粒探针；2.5 微升 10× 多聚核苷酸激酶反应缓冲液；3 微升用 P32 标记在γ磷酸基团上的 ATP；4 微升 T4 多聚核苷酸激酶；以及无 DNase、无菌、去离子水，加至终体积为 20 微升。短暂离心该离心管。

将试管置于37摄氏度水浴中孵育1小时。短暂离心试管，然后在65摄氏度孵育20分钟以终止反应。将放射性探针溶液加入预先准备好的G25层析柱中，并在700 × g条件下离心2分钟。

保存含有放射性端粒探针的滤液。将凝胶放入盛有250毫升变性溶液的玻璃皿中，在室温下孵育15分钟。弃去变性溶液，加入250毫升无菌去离子水。

在室温下于摇床中孵育10分钟。去除去离子水，加入250毫升中和溶液，在室温下孵育15分钟。

将凝胶卷入尼龙网中，并放入杂交管内。加入20毫升杂交液，在42摄氏度的杂交炉中旋转孵育10分钟。10分钟后，移除杂交液，并更换为20毫升新鲜杂交液。

加入全部端粒探针，在42摄氏度杂交炉中旋转孵育过夜。端粒探针杂交完成后，从杂交管中取出凝胶和尼龙膜，放入含有250毫升2x SSC的玻璃皿中。展开并从皿中取出尼龙膜。

将玻璃培养皿置于旋转摇床中，在室温下孵育15分钟。移除2×SSC溶液，加入250毫升0.1×SSC溶液并添加0.1% SDS，然后在室温下于旋转摇床中继续孵育15分钟。移除0.1×SSC溶液并添加0.1% SDS溶液。

用 250 毫升 2x SSC 替换，并在旋转摇床上再孵育 15 分钟。从 2x SSC 中取出凝胶，用保鲜膜包裹凝胶。去除凝胶与保鲜膜之间的所有气泡和空气 pockets。

将凝胶放入含有磷屏的曝光盒中，使磷屏与凝胶过夜曝光。次日，使用磷屏成像仪对曝光后的磷屏进行成像。所得磷屏图像将用于端粒长度的定量分析，具体方法如文本方案所述。

采用永生化人包皮成纤维细胞系和人外周血单个核细胞提取的三种浓度DNA，分析其端粒长度。该磷屏成像图显示了经绿色荧光核酸染料染色后干燥琼脂糖凝胶中DNA条带的位置，其中泳道一和泳道八为DNA分子量标记。从凝胶顶部到各分子量标准条带的距离以蓝色箭头标示。

与端粒探针杂交后，每条泳道中的端粒条带呈弥散状。每条泳道及一条背景泳道均计算了包含150个方格的网格。每组样本的选定分析区域已显示。

为每组样品分别选择标记为 B 的背景条带，以确保每组样品的背景强度相似。平均端粒长度计算结果显示，永生化细胞系的平均端粒长度高于人外周血单个核细胞。这些结果还表明，每条泳道中分析的基因组 DNA 量对于杂交后获得可检测信号至关重要。

一旦掌握，该技术可在2个半日内完成，总计耗时约12小时，期间包含两次过夜孵育，前提是操作正确。在进行该实验时，需注意每个样本至少使用三微克DNA，并对每个样本进行双份测量。该技术建立后，为衰老领域研究人员探索不同动物物种（包括人类）中维持端粒长度的机制铺平了道路。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何直接测定端粒本身的平均长度。请务必注意，操作放射性物质可能具有极高危险性，在进行本实验时，应始终采取佩戴实验服和手套等防护措施。