Name: Hemoglobinopathies 患者造血干细胞移植后残余供红祖细胞的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: 学习利用流式细胞术分选、集落形成实验和短串联重复序列分析，监测血红蛋白病患者造血干细胞移植后的嵌合状态，评估红系祖细胞增殖与分化，识别疾病复发风险并指导免疫调节策略。

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本工作由Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol资助。

1. 通过多参数荧光激活细胞分选法分离造血骨髓细胞
<ol>
	<li>样品染色
	<ol>
		<li>在开始该流程之前，需要收集并准备好以下物品：
		<ol>
			<li>用于单个核细胞制备的梯度介质（GM），50 mL 圆锥形管</li>
			<li>用于细胞染色的12 x 75 mm流式管</li>
			<li>染色缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS）+ 3% 胎牛血清（FCS）</li>
			<li>移液器</li>
			<li>FC封闭液及染色抗体（CD34 APC、CD36 FITC、CD45 V450，BD Biosciences）。该荧光染料组合在其他检测通道中的溢出可忽略不计，但也可使用其他合适的荧光染料组合。</li>
			<li>补偿微珠（如需要）</li>
			<li>悬浮缓冲液：Hank's 平衡盐溶液 (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS</li>
			<li>台盼蓝和血细胞计数板</li>
			<li>收集管：可使用任何含高血清的富集培养基管（含1 mL FCS + 25 mM HEPES）来收集分选后的细胞。</li>
			<li>骨髓样本：通常需要获得患者关于从髋骨后部髂嵴进行骨髓活检的知情同意。骨髓样本采集后应保存在含肝素的注射器中，于室温下避光保存直至染色。以下实验步骤均依照本机构人类研究伦理委员会关于人类受试者福利的相关指南执行。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备骨髓样本的单细胞悬液。向离心管中加入3 mL GM。将4 mL单细胞悬液小心地铺加到GM溶液上层。在20 °C条件下以550 g离心30分钟（关闭刹车）。使用无菌移液管吸除含有血浆和血小板的上层液体，保留位于界面处的单个核细胞层不受扰动。使用无菌移液管将单个核细胞层转移至另一无菌离心管中。</li>
		<li>用5 mL染色缓冲液洗涤后，将细胞重悬于2 mL悬浮缓冲液中，并测定细胞浓度。取5 µL细胞悬液置于带螺帽的试管中，加入95 µL 0.2%台盼蓝染液，充分混匀。室温静置5分钟。按细胞计数方法充入血细胞计数板。在显微镜下观察非活细胞是否被染色，并计数活细胞。</li>
		<li>在20 °C下以250 g离心10分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于染色缓冲液中，细胞浓度不超过1 x 106 每 100 µL</li>
		<li>使用每 1 x 10⁶ 个细胞 2.5 µg Fc Block 来阻断 FcR6 冰上孵育细胞 10 - 15 分钟。</li>
		<li>加入适量组合的10 µg单克隆抗体，用于染色1 x 10⁶细胞6 细胞并在 4°C 避光孵育 20 分钟，随后用 3 mL 染色缓冲液洗涤。为正确进行补偿，取少量细胞（或更优选择为补偿微珠）分别单独标记单种抗体，另留一份样本不染色。</li>
		<li>将浓度调整至 20 x 106 cells/mL</li>
		<li>设置并优化细胞分选仪。流式细胞仪及其软件的设置流程已由厂商提供详细操作说明，属于标准化操作，须由经过适当培训的人员完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞分选仪分选
	<ol>
		<li>准备步骤 1.1.1.9 中的收集管。</li>
		<li>设置一个包含双变量图的模板，用于显示前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）。</li>
		<li>运行细胞样本，并调节FSC/SSC以使目标细胞群位于量程范围内</li>
		<li>记录阴性对照管。</li>
		<li>运行单阳性质控管；记录每根管的数据。</li>
		<li>使用采集软件提供的功能手动或自动计算补偿。</li>
		<li>获取实验样本，并在双变量FSC/SSC点图上设门图1A) 以包含淋巴细胞和髓系细胞。通过比较FSC的不同信号来排除双联体和聚集体。即、高度、宽度和面积）（图1B). 在显示 CD45 和 CD36 的双变量点图上观察单细胞群体（图1C)。CD45阳性的事件为白细胞（包括其前体细胞），CD45阴性而CD36阳性的事件为红系前体细胞。使用设门工具定义CD36+细胞（如需要，可进一步分为CD36高表达和低表达细胞）以及CD45+细胞。在另一幅显示CD34与SSC参数的散点图中观察CD45+事件。使用设门工具定义CD34+细胞（白细胞前体）和SSC高表达细胞（处于不同分化阶段的髓系细胞）。</li>
		<li>确定门控参数后，可选择这些门控参数以分选至外部收集管中。</li>
		<li>在4 °C条件下继续分选，直至获得所需数量的细胞</li>
		<li>进行分选后分析，以确定分选后细胞群体的纯度（图1E, 1F).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 克隆形成实验
<ol>
	<li>试剂准备 
	开始实验前，需准备以下物品：
	<ol>
		<li>移液器、100 mm 培养皿</li>
		<li>台盼蓝和血细胞计数板</li>
		<li>用含有至少 0.1% 人血清白蛋白的无菌 PBS 将人重组促红细胞生成素（EPO）重悬至 500 U/mL。将此溶液分装成小份，保存于 -20 °C，避免反复冻融。</li>
		<li>配制完全的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基（IMDM），终浓度为 5% 胎牛血清（FCS）、2 mM 谷氨酰胺、100 单位/mL 青霉素/链霉素（PS）。在不同孔中向完全 IMDM 培养基中添加不同浓度的人重组促红细胞生成素（EPO）：每孔 3 单位 EPO、每孔 6 单位 EPO 和每孔 12 单位 EPO（分别为 1×、2× 和 4× EPO）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨髓细胞的制备
	<ol>
		<li>在无菌条件下，将 10 mL 骨髓样本与 20 mL PBS 混合后，缓慢叠加于 50 mL 锥形管中的 15 mL 密度梯度介质上方，保持两相之间界面清晰。随后以 550 × g 在室温（RT）下离心 30 分钟，加速度设为 9，减速度设为 0（或关闭刹车）。</li>
		<li>离心后，将界面层转移至新的 50 mL 管中，并加入 PBS 至终体积为 50 mL。</li>
		<li>在 10 °C 下以 250 × g 离心 10 分钟后，弃去上清液，将细胞重悬于完全 IMDM 培养基中，浓度约为 0.5 × 106 个细胞/mL。取 10 µL 细胞悬液加入微量离心管中，与等体积的 0.4% 台盼蓝溶液混合，用血细胞计数板进行计数。</li>
		<li>可选步骤：根据 Miltenyi CD34 磁珠试剂盒制造商提供的说明，通过磁性细胞分选富集 CD34+ 细胞。该富集步骤的主要优势在于可评估造血干细胞的质量，这些细胞在半固体培养基中培养，其中添加了 50 ng/mL 干细胞因子（SCF）、20 ng/mL 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、20 ng/mL 白细胞介素-3（IL-3）、20 ng/mL 白细胞介素-6（IL-6）、20 ng/mL 粒细胞集落刺激因子（G-CSF）以及如 1.4 所述的三种不同浓度的 EPO。</li>
		<li>用补充 EPO 的完全 IMDM 培养基将细胞稀释至 0.1 - 0.15 × 106 个单个核细胞/mL 或 2 × 103 个 CD34+ 细胞/mL，并将 300 µL 加入 3 mL Methocult H4434 培养基中。充分振荡混匀后，短暂孵育 5 分钟，然后在 35 mm 培养皿中每皿接种 1.1 mL，共接种三皿。其中两个培养皿与第三个盛有水的培养皿一同置于 100 mm 培养皿中。</li>
		<li>细胞在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养 14 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>集落分析
	<ol>
		<li>使用倒置显微镜在 40× 放大倍数下，根据集落形态对培养皿中带有计数网格的集落进行计数。在本实验中，集落形成单位（CFU）分为四类：多向祖细胞（CFU-GEMM）、粒细胞-巨噬细胞祖细胞（CFU-GM）、红系爆式形成单位（BFU-E）和红系集落形成单位（CFU-E）。更多集落亚型分类请参阅试剂盒说明书。</li>
		<li>为进一步分析，根据上述四类分别从 CFU 培养板中回收细胞，用含 2% FCS/IMDM 的室温 PBS 悬浮细胞。在 4 °C 下以 400 × g 离心 10 分钟后，弃去上清，将细胞重悬于 PBS 中，计数后进行 DNA 提取处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 嵌合体分析
<ol>
	<li>DNA 提取
	<ol>
		<li>以 400 g 离心 10 分钟，收集细胞沉淀。</li>
		<li>使用血液 DNA 提取试剂盒（QIAmp DNA Blood 提取试剂盒）提取 DNA。将洗脱缓冲液（AE）预热至 37 °C，以提高洗脱 DNA 的得率。</li>
		<li>使用 Nanodrop ND-1000 分光光度计测定 DNA 浓度。OD 260/280 在 1.8–2.0 之间的样品用于后续分析。</li>
		<li>用无 DNA 酶的 H2O 将 DNA 稀释至 0.1 ng/µL，总体积为 50 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>STR 分析
	<ol>
		<li>按照说明书，将反应混合液、AmplTaq Gold DNA 聚合酶和 Profiler Plus 引物组与 20 µL 基因组 DNA（0.1 ng/µL）混合，配制 PCR 反应体系（引物试剂盒包含未标记的引物缓冲液，用于扩增 STR 位点 D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317 和 D7S820，以及性别标记基因 amelogenin）。以无核酸酶水作阴性对照，9947A 作阳性对照。同时包括供体和受体的移植前 DNA。</li>
		<li>使用 Eppendorf Mastercycler gradient 进行 PCR 反应，条件如下：95 °C 预变性 11 分钟，随后进行 28 个循环的扩增（95 °C 变性 1 分钟，59 °C 退火 1 分钟，72 °C 延伸 1 分钟），最后 60 °C 延伸 45 分钟。</li>
		<li>向 1 µL PCR 产物中加入 12 µL Hi-Di 甲酰胺和 0.5 µL GeneScan 500 ROX 大小标准品（均为 Applied Biosystems 产品），配制片段分析反应体系。在第一个和最后一个位置需使用等位基因阶梯（Genotyper AmpFlSTR Blue、Green II 和 Yellow，Applied Biosystems）。</li>
		<li>启动电泳仪进行电泳和信号采集。</li>
		<li>使用软件13分析样品和对照的位点、等位基因及峰高。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Angelucci, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+thalassemia+major+and+sickle+cell+disease%3A+indications+and+management+recommendations+from+an+international+expert+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel.</a> Haematologica. 99, 811-820 (2014).</li>
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<li>Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+chimerism+in+haemoglobinopathies%3A+from+risk+of+graft+rejection+to+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance.</a> Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).</li>
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<li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+of+ex-thalassemic+patients+with+persistent+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation.</a> Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).</li>
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<li>Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+chimerism+between+nucleated+and+red+blood+cells+after+bone+marrow+transplantation+for+haemoglobinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Chimerism%22%5BJournal%5D)">Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies.</a> Chimerism. 2, 21-22 (2011).</li>
<li>Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+management+of+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplant+in+beta-thalassemia+major%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major.</a> Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).</li>
<li>Kimpton, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+DNA+profiling+employing+multiplex+amplification+of+short+tandem+repeat+loci%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci.</a> PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).</li>
<li>Centis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+erythroid+expansion+in+determining+the+extent+of+apoptosis+in+erythroid+precursors+in+patients+with+beta-thalassemia+major%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major.</a> Blood. 96, 3624-3629 (2000).</li>
<li>Miccio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+genetically+modified+erythroblastic+progenitors+leads+to+long-term+correction+of+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究的目的是为读者提供两种方法的结合，用于分析接受造血干细胞移植（HSCT）治疗血红蛋白病患者红系祖细胞中的供者/受者嵌合状态：1）对骨髓样本中的造血祖细胞进行荧光激活细胞分选，随后进行短串联重复序列分析；2）骨髓细胞的集落形成单位培养，将集落分类为不同类型的祖细胞，再进行短串联重复序列分析。该方法的新颖之处在于将这两种技术结合到一个实验流程中，以评估单个集落内的供者/受者嵌合情况。
该方法的特殊重要性体现在接受造血干细胞移植（HSCT）治疗血红蛋白病患者后出现的混合嵌合状态背景下。多项研究已表明，相当一部分患者体内供体髓系细胞比例较低，且与红系前体细胞的比例相一致，从而导致长期稳定的混合性造血嵌合3,11；相比之下，在这些患者中，供体来源的红细胞比例显著更高（比成熟白细胞高出2至5倍），提示无效红细胞生成发生在红系发育的较晚阶段。这些现象被认为与供体有核红细胞前体易于加速凋亡，以及残留的T细胞和B细胞持续存在从而允许混合异基因移植物共存有关<sup class=...

异基因造血干细胞移植（HSCT）是目前唯一可用于治愈多种造血系统先天性遗传病的方法，对于原本预后极差且生存期受限的患者，其无病生存率可超过90%1。这一重要治疗手段的疗效已通过降低移植前后治疗方案的毒性得到优化2，同时也得益于旨在维持移植物稳定功能的干预措施，后者通过密切监测供体来源细胞来量化评估3,4,5。
通常，完全嵌合（CC）指受者的淋巴造血系统被供者来源的细胞完全取代，而混合嵌合（MC）则指供者和受者来源的细胞以不同比例同时存在。分裂嵌合（SC）特指在单一细胞谱系（如红细胞系）中观察到的混合嵌合状态。造血干细胞移植（HSCT）后及时确定嵌合状态至关重要，因其有助于识别疾病复发风险较高的患者，并启动后续免疫调节策略，例如供者淋巴细胞输注或减少免疫抑制治疗6。
已开发出多种方法用于监测HSCT后移植物的植入情况。免疫球蛋白分型和细胞遗传学分析的敏感性较差，且在检测多态性方面存在局限性。7,8荧光的引入 原位 荧光原位杂交（FISH）可提高造血干细胞移植（HSCT）后嵌合体监测的敏感性，但仅限于性别不匹配的异基因移植。9目前，聚合酶链式反应（PCR）是检测嵌合体最广泛使用的方法，该方法基于对可变数目串联重复序列（VNTRs）或短串联重复序列（STRs）进行常规琼脂糖-丙烯酰胺凝胶电泳分析。常规使用的定量PCR能够检测造血干细胞移植（HSCT）后极少量残留供体细胞。迄今为止，相关研究的主要局限在于混合嵌合体（MC）的检测几乎仅限于有核细胞，而非常具有功能重要性的成熟红细胞，后者对于血红蛋白病患者尤为关键。对于血型不同的患者，值得指出的是，流式细胞荧光分析可通过使用针对红细胞ABO及C、c、D、E、e抗原的单克隆抗体，实现对红细胞嵌合体的识别。10,11评估红系嵌合体的另一种非常有趣的方法是通过流式细胞术分选红系祖细胞，并在克隆形成实验中培养以富集不同类型的红系祖细胞，随后进行短串联重复序列（STR）分析。12该方法能够量化红系组分中供体与受体嵌合体的相对比例，并可应用于维持骨髓移植物的策略中。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-02&amp;nbsp;</td><td>去除红细胞</td></tr><tr><td>50 mL 圆底离心管</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>12 x 75 mm 流式管</td><td>Falcon</td><td>352002</td><td>FACS 分选</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000-044</td><td>FCS（热灭活）</td></tr><tr><td>CD34 APC</td><td>BD Bioscience</td><td>561209</td><td>FACS 抗体</td></tr><tr><td>CD36 FITC</td><td>BD Bioscience</td><td>555454</td><td>FACS 抗体</td></tr><tr><td>CD45 V450</td><td>BD Bioscience</td><td>642275</td><td>FACS 抗体</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>自动细胞计数</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>FACS 分析中的悬浮缓冲液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>悬浮缓冲液组分</td></tr><tr><td>FcR</td><td>BD Bioscience</td><td>564220</td><td>封闭 FcR</td></tr><tr><td>FACS Aria I</td><td>BD Bioscience</td><td>23-11539-00</td><td>FACS 分选仪</td></tr><tr><td>重组&amp;nbsp;人促红细胞生成素</td><td>Affimetrix eBioscience</td><td>14-8992-80</td><td>EPO</td></tr><tr><td>Isocove&amp;rsquo;s 改良 Dulbecco&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td>IMDM</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>CD34+ 磁珠</td><td>Milteny Biotech</td><td>130-046-702</td><td>CD34+ 纯化</td></tr><tr><td>重组&amp;nbsp;人 G-CSF</td><td>Gibco</td><td>PHC2031</td><td>CFU-检测</td></tr><tr><td>重组&amp;nbsp;人 SCF</td><td>Gibco</td><td>CTP2113</td><td>CFU-检测</td></tr><tr><td>重组&amp;nbsp;人 GM-CSF</td><td>Gibco</td><td>PHC2015</td><td>CFU-检测</td></tr><tr><td>重组&amp;nbsp;人 IL-3</td><td>BD Bioscience</td><td>554604</td><td>CFU-检测</td></tr><tr><td>重组&amp;nbsp;人 IL-6</td><td>BD Bioscience</td><td>550071</td><td>CFU-检测</td></tr><tr><td>Methocult H4434 培养基</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4444</td><td>CFU-检测</td></tr><tr><td>QiAmp 血液DNA提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>DNA 提取</td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND 1000</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>无DNA酶的 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEREN0521</td><td>DNA 制备</td></tr><tr><td>AmplTaq Gold DNA 聚合酶</td><td>Applied Bioscience</td><td>N8080240</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Eppendorf Mastercycler gradient</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td>PCR&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hi-Di 甲酰胺</td><td>Applied Bioscience</td><td>4311320</td><td>PCR</td></tr><tr><td>GeneScan 500 ROX 大小标准品</td><td>Applied Bioscience</td><td>4310361</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3130 遗传分析仪</td><td>Applied Bioscience</td><td>313001R</td><td>PCR</td></tr></tbody></table>

血红蛋白病患者造血干细胞移植后残余供体红系祖细胞的检测

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

在因重型地中海贫血或镰状细胞病接受骨髓移植的患者中，有相当大比例存在不完全嵌合现象。这一发现具有重要意义，因为后续的治疗性免疫调节策略可能改善临床结局。传统上，通过基于聚合酶链反应的短串联重复序列分析来鉴定供体来源血细胞中的嵌合状态。然而，该方法仅限于有核细胞，且无法区分解离的单个细胞系。我们将短串联重复序列分析应用于流式细胞术分选的造血祖细胞，并与从骨髓中分离的红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid）集落中获得的短串联重复序列分析结果进行比较。通过该方法，我们能够展示供体细胞在红系组分中的不同增殖与分化情况。该技术可补充当前干细胞移植背景下嵌合状态的监测手段，因此有望应用于未来的临床研究、干细胞研究以及基因治疗试验的设计中。

通过FACS细胞分选分离淋系-造血祖细胞
本文展示了为后续 STR 分析而分选所需细胞群的结果。骨髓细胞使用 V450 标记的抗 CD45 抗体、FITC 标记的抗 CD36 抗体以及 APC 标记的抗 CD34 抗体进行染色。目标细胞群为巨核细胞-红系祖细胞（MEP），即负责红细胞发育的有核细胞。这些细胞表达 CD36，但不表达白细胞共同抗原 CD45（图 1C）。如有需要，可根据其 CD36 表达水平进一步区分这些细胞。此外还可分选多个其他细胞群作为对照。我们分选了 CD45+CD34+ 淋巴样/髓样前体细胞作为另一群祖细胞，并分选 CD45+ 且具有高侧向散射（SSC）信号的细胞作为成熟髓样细胞（图 1D）。分选使用 BD FACSAria I 仪器完成。分选后，红系祖细胞纯度 >85%（<st...

为了监测血红蛋白病患者在干细胞移植后的植入情况，需要对供体来源的细胞进行定量。可通过结合基于流式细胞术的细胞分选、集落形成实验以及后续的短串联重复序列分析，来评估红系细胞区室中前体细胞的增殖与分化能力。

在重型地中海贫血或镰状细胞病患者接受骨髓移植后，有相当大比例的患者出现嵌合体不完全现象。

本实验的总体目标是监测干细胞移植环境中的嵌合状态。该方法有助于解决移植领域的一些关键问题，例如，针对血红蛋白病患者的造血干细胞移植的植入情况。该方法的主要优势在于，它结合了基于流式细胞术的细胞分选、柱层析信息分析以及后续的短串联重复序列分析，以评估红系区室中前体细胞的增殖与分化情况。该技术的应用意义超出了移植物抗宿主病的治疗范畴，因为它可能有助于识别易发生疾病复发的患者，并启动后续的免疫调节策略。此外，该技术还可应用于未来的临床研究、干细胞研究以及皮肤治疗试验的设计。由于该操作过程难以掌握，必须由经过培训的专业人员来完成，因此对该方法进行直观演示至关重要。本实验操作将由本实验室的技术员 Elisabeth Hoflehner 演示。首先，制备骨髓样本的单细胞悬液用于脂肪染色。具体操作为：将含有骨髓的细胞筛置于离心管上方，并旋紧固定。使用注射器活塞将组织碎片强行通过滤网。为收集全部材料，用数毫升悬浮缓冲液冲洗。向离心管中加入3毫升梯度介质，并小心地将单细胞悬液铺在上面。将离心管在20摄氏度下以550 G离心30分钟，加速度设为9，减速度设为0。用移液器小心移除含有血浆和血小板的上层液体，确保单个核细胞层在界面处保持不动。将该单个核细胞层转移至另一离心管中。接下来，用10毫升悬浮缓冲液洗涤细胞。在4°C条件下，以250 ×g离心5分钟。弃去上清液，通过移液将细胞重悬于2毫升完全IsoKov改良的DMEM培养基中。使用血细胞计数板测定细胞浓度时，将95微升2%台盼蓝染液加入96孔板中。加入5微升细胞悬液，充分混匀，并在室温下孵育片刻。将血细胞计数板充液后置于显微镜下观察。仅计数经染色的活细胞。随后，将细胞悬液在25摄氏度下以250 G离心10分钟。为阻断Fc受体，每100微升使用2.5微克阻断剂。冰上孵育10至15分钟。加入针对所用体积预滴定好的单克隆抗体组合，用于染色细胞。在4°C避光孵育20分钟。用三毫升染色缓冲液洗涤细胞，然后离心。调整细胞浓度后，通过移液将细胞悬液经70微米细胞滤网转移至标准流式细胞管中，以去除细胞团块。随后，根据制造商说明书设置并优化细胞分选仪及软件。设置一个包含双变量图的模板，用于显示前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）。为使目标细胞群处于合适的量程范围内，先将细胞上样至分选仪，并调节FSC和SSC。首先记录阴性对照管的数据，随后记录每管单染补偿对照管的数据，并计算补偿值。随后，将实验样本置于双变量FSC、SSC点图中，以包含淋巴细胞和髓系细胞。通过比较FSC的不同信号，排除双联体和聚集体。然后在双变量点图上显示表达CD45和CD36的单细胞。CD45阳性事件代表白细胞及其前体细胞。CD45阴性且CD36阳性事件代表红系前体细胞。为界定CD36阳性与CD45阳性细胞，应使用设门工具，随后可视化显示CD45阳性事件，以及另一张展示CD34与SSC参数的散点图。接下来，使用门控工具定义CD34阳性细胞或白细胞前体细胞，以及SSC高表达细胞或髓系细胞在不同分化阶段的群体。随后，设置分选门以将细胞分选至外部收集管中。最后，在4摄氏度条件下继续进行细胞分选，直至获得所需数量的细胞。通过加入添加了人重组促红细胞生成素（erythropoietant）或EPO的完全IMDM培养基稀释细胞。将300微升稀释后的细胞转移至3毫升H4434培养基中，在室温下振荡孵育5分钟。随后，将1毫升细胞悬液分别接种至三个35毫米的培养皿中。将两个培养皿与一个盛有水的培养皿一同放入100毫米的培养板中。在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中培养这些细胞14天。使用40倍放大倍数的倒置显微镜，结合标有计数网格的培养皿，根据菌落形态进行计数。将菌落形成单位（CFU）分类为多能祖细胞、粒细胞-单核细胞祖细胞、红系爆式形成单位和红系菌落形成单位。首先，根据文本方案从 Fax 或 CFU 检测板中回收细胞，随后进行 DNA 提取。细胞离心后，使用自动化血液 DNA 提取仪器从细胞沉淀中分离核酸。使用荧光计测量DNA浓度。按照制造商说明书制备样品，然后将样品加入荧光计的样品室。根据说明书，将稀释后的DNA加入含有DNA聚合酶、引物组和反应混合液的体系中，以建立PCR反应。包括移植前供体和受体的DNA，以及无核酸酶水作为阴性对照，9947A作为阳性对照。为分析PCR结果，将10微升变性DNA样本加入96孔反应板的孔中。密封反应板，短暂离心后置于冰上。巨核细胞-红系祖细胞被鉴定为CD36阳性而CD45抗原阴性的细胞群体。此外，CT45阳性且CD34阳性的细胞被认定为淋系-髓系前体细胞，而CD45阳性且侧向散射信号（SSC）较强的细胞则被认定为成熟的髓系细胞。分选后红系祖细胞的纯度超过85%，髓系细胞的纯度超过95%。通过CD34特异性磁珠分离的骨髓细胞被培养14天。一些细胞似乎能够增殖、分化并形成集落。使用不同浓度的促红细胞生成素（EPO）刺激可增加明显呈红色的红系集落的形成。通过短串联重复序列（STR）的PCR分析，可检测受体与供体DNA特异性序列，从而鉴定细胞中的嵌合现象。该方法成功测定了从骨髓细胞分选所获得的细胞以及从克隆形成实验所获得的细胞中受体与供体DNA的含量。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四小时内完成。在实施该实验时，需牢记该技术必须经过标准化，并由经过适当培训的人员进行操作。通过该操作流程，可进一步分析残留的供体来源红系祖细胞，以回答其他问题，例如基因校正后的红系干细胞是否具有选择性优势。该技术建立后，为干细胞移植领域的研究人员探索红系细胞区室中祖细胞的增殖与分化奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何监测血红蛋白病患者在干细胞移植后的植入情况。

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发育生物学

Hemoglobinopathies 患者造血干细胞移植后残余供红祖细胞的检测

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利用CD71/TER119流式细胞术检测鉴定与分析小鼠红系祖细胞

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慢病毒介导的基因敲低过程 离体 人类造血干细胞的红细胞生成

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从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

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利用单细胞索引分选联合内皮细胞微环境共培养技术对胚胎造血干细胞前体进行克隆分析

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通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

我们描述了利用造血干细胞移植（HSCT）评估基因工程改造的造血细胞的恶性潜能。HSCT可用于评估多种恶性造血细胞 体内...

利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

我们介绍了一种利用Hoxb5报告系统分离长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的逐步实验方案。...

长期与短期造血干细胞的分离方法

体内骨类器官法用于获取治疗性造血干细胞/祖细胞

建立红细胞生成模型为理解该过程中各参与因子的生物学意义以及评估可能缓解分化缺陷的新型治疗策略提供了宝贵机会。本文介绍了一种简单且可靠的方法，可高效地将CD34+ 造血干细胞和祖细胞 离体.

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学习利用流式细胞术分选、集落形成实验和短串联重复序列分析，监测血红蛋白病患者造血干细胞移植后的嵌合状态，评估红系祖细胞增殖与分化，识别疾病复发风险并指导免疫调节策略。

血红蛋白病患者造血干细胞移植后残余供体红系祖细胞的检测

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