血红蛋白病患者造血干细胞移植后残余供体红系祖细胞的检测

本实验的总体目标是监测干细胞移植环境中的嵌合状态。该方法有助于解决移植领域的一些关键问题，例如，针对血红蛋白病患者的造血干细胞移植的植入情况。该方法的主要优势在于，它结合了基于流式细胞术的细胞分选、柱层析信息分析以及后续的短串联重复序列分析，以评估红系区室中前体细胞的增殖与分化情况。

该技术的应用意义超出了移植物抗宿主病的治疗范畴，因为它可能有助于识别易发生疾病复发的患者，并启动后续的免疫调节策略。此外，该技术还可应用于未来的临床研究、干细胞研究以及皮肤治疗试验的设计。由于该操作过程难以掌握，必须由经过培训的专业人员来完成，因此对该方法进行直观演示至关重要。

本实验操作将由本实验室的技术员 Elisabeth Hoflehner 演示。首先，制备骨髓样本的单细胞悬液用于脂肪染色。具体操作为：将含有骨髓的细胞筛置于离心管上方，并旋紧固定。

使用注射器活塞将组织碎片强行通过滤网。为收集全部材料，用数毫升悬浮缓冲液冲洗。向离心管中加入3毫升梯度介质，并小心地将单细胞悬液铺在上面。

将离心管在20摄氏度下以550 G离心30分钟，加速度设为9，减速度设为0。用移液器小心移除含有血浆和血小板的上层液体，确保单个核细胞层在界面处保持不动。将该单个核细胞层转移至另一离心管中。

接下来，用10毫升悬浮缓冲液洗涤细胞。在4°C条件下，以250 ×g离心5分钟。弃去上清液，通过移液将细胞重悬于2毫升完全IsoKov改良的DMEM培养基中。

使用血细胞计数板测定细胞浓度时，将95微升2%台盼蓝染液加入96孔板中。加入5微升细胞悬液，充分混匀，并在室温下孵育片刻。将血细胞计数板充液后置于显微镜下观察。

仅计数经染色的活细胞。随后，将细胞悬液在25摄氏度下以250 G离心10分钟。为阻断Fc受体，每100微升使用2.5微克阻断剂。

冰上孵育10至15分钟。加入针对所用体积预滴定好的单克隆抗体组合，用于染色细胞。在4°C避光孵育20分钟。

用三毫升染色缓冲液洗涤细胞，然后离心。调整细胞浓度后，通过移液将细胞悬液经70微米细胞滤网转移至标准流式细胞管中，以去除细胞团块。随后，根据制造商说明书设置并优化细胞分选仪及软件。

设置一个包含双变量图的模板，用于显示前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）。为使目标细胞群处于合适的量程范围内，先将细胞上样至分选仪，并调节FSC和SSC。首先记录阴性对照管的数据，随后记录每管单染补偿对照管的数据，并计算补偿值。

随后，将实验样本置于双变量FSC、SSC点图中，以包含淋巴细胞和髓系细胞。通过比较FSC的不同信号，排除双联体和聚集体。然后在双变量点图上显示表达CD45和CD36的单细胞。

CD45阳性事件代表白细胞及其前体细胞。CD45阴性且CD36阳性事件代表红系前体细胞。为界定CD36阳性与CD45阳性细胞，应使用设门工具，随后可视化显示CD45阳性事件，以及另一张展示CD34与SSC参数的散点图。

接下来，使用门控工具定义CD34阳性细胞或白细胞前体细胞，以及SSC高表达细胞或髓系细胞在不同分化阶段的群体。随后，设置分选门以将细胞分选至外部收集管中。最后，在4摄氏度条件下继续进行细胞分选，直至获得所需数量的细胞。

通过加入添加了人重组促红细胞生成素（erythropoietant）或EPO的完全IMDM培养基稀释细胞。将300微升稀释后的细胞转移至3毫升H4434培养基中，在室温下振荡孵育5分钟。随后，将1毫升细胞悬液分别接种至三个35毫米的培养皿中。

将两个培养皿与一个盛有水的培养皿一同放入100毫米的培养板中。在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中培养这些细胞14天。使用40倍放大倍数的倒置显微镜，结合标有计数网格的培养皿，根据菌落形态进行计数。

将菌落形成单位（CFU）分类为多能祖细胞、粒细胞-单核细胞祖细胞、红系爆式形成单位和红系菌落形成单位。首先，根据文本方案从 Fax 或 CFU 检测板中回收细胞，随后进行 DNA 提取。细胞离心后，使用自动化血液 DNA 提取仪器从细胞沉淀中分离核酸。

使用荧光计测量DNA浓度。按照制造商说明书制备样品，然后将样品加入荧光计的样品室。根据说明书，将稀释后的DNA加入含有DNA聚合酶、引物组和反应混合液的体系中，以建立PCR反应。

包括移植前供体和受体的DNA，以及无核酸酶水作为阴性对照，9947A作为阳性对照。为分析PCR结果，将10微升变性DNA样本加入96孔反应板的孔中。密封反应板，短暂离心后置于冰上。

巨核细胞-红系祖细胞被鉴定为CD36阳性而CD45抗原阴性的细胞群体。此外，CT45阳性且CD34阳性的细胞被认定为淋系-髓系前体细胞，而CD45阳性且侧向散射信号（SSC）较强的细胞则被认定为成熟的髓系细胞。分选后红系祖细胞的纯度超过85%，髓系细胞的纯度超过95%。通过CD34特异性磁珠分离的骨髓细胞被培养14天。

一些细胞似乎能够增殖、分化并形成集落。使用不同浓度的促红细胞生成素（EPO）刺激可增加明显呈红色的红系集落的形成。通过短串联重复序列（STR）的PCR分析，可检测受体与供体DNA特异性序列，从而鉴定细胞中的嵌合现象。

该方法成功测定了从骨髓细胞分选所获得的细胞以及从克隆形成实验所获得的细胞中受体与供体DNA的含量。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四小时内完成。在实施该实验时，需牢记该技术必须经过标准化，并由经过适当培训的人员进行操作。

通过该操作流程，可进一步分析残留的供体来源红系祖细胞，以回答其他问题，例如基因校正后的红系干细胞是否具有选择性优势。该技术建立后，为干细胞移植领域的研究人员探索红系细胞区室中祖细胞的增殖与分化奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何监测血红蛋白病患者在干细胞移植后的植入情况。