Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

该程序的总体目标是监测干细胞移植环境中的嵌合体。这种方法可以帮助解决移植领域的关键问题，例如血红蛋白病患者的造血干细胞移植植入。该方法的主要优点是它结合了基于流式细胞术的细胞分选、柱信息测定和随后的短期重复分析，以评估红系区室中祖细胞的增殖和分化。

该技术的意义扩展到移植物下排斥反应的治疗，因为它可能有助于识别易患疾病复发的患者并启动后续的免疫调节策略。此外，它还可以应用于未来的临床研究、干细胞研究和皮肤治疗试验的设计。这种方法的视觉演示至关重要，因为该过程很难学习，需要由训练有素的人员执行。

演示此程序的将是我实验室的技术人员 Elisabeth Hoflehner。首先，生成骨髓样品的单细胞悬液用于脂肪染色。为此，放置一个含有骨髓的细胞过滤器并将其拧在离心管的顶部。

使用注射器柱塞，迫使组织块穿过网片。要收集所有材料，请用几毫升悬浮缓冲液冲洗。向离心管中加入 3 mL 梯度培养基，并小心地将单细胞悬液分层。

在 20 摄氏度下以 550 G 离心管 30 分钟，加速度设置为 9，减速设置为 0。用移液管去除含有血浆和血小板的上层，确保在界面处保持单核细胞层不受干扰。将此单核细胞层转移到离心管中。

接下来，用 10 毫升悬浮缓冲液洗涤细胞。将试管在 4 摄氏度下以 250 G 离心 5 分钟。弃去上清液，通过移液将细胞重悬于两毫升完整的 isokov 改良的 dulbecco 培养基中。

要使用血细胞计数器测定细胞浓度，请将 95 微升 2% 台盼蓝染色剂放入 96 孔板中。加入 5 μL 细胞悬液，充分混匀并在室温下孵育短时间。填充血细胞计数器并在显微镜下观察。

仅对染色的活细胞进行计数。之后，将细胞悬液在 250 G 和 25 摄氏度下离心 10 分钟。要阻断 FC 受体，每 100 μL 使用 2.5 μg 阻断剂。

在冰上孵育 10 到 15 分钟。添加适合细胞染色体积的预滴定单克隆抗体组合。在 4 摄氏度下避光孵育 20 分钟。

用 3 ml 染色缓冲液洗涤细胞，然后离心。调整细胞浓度后，将细胞悬液转移到标准流式细胞仪管中，通过 70 μL 细胞过滤器移液以去除聚集体。然后，根据制造商的说明设置和优化细胞分选仪和软件。

设置一个包含二元图的模板，以显示前向散射或 FSC 和侧向散射或 SSC。要将感兴趣的细胞群进行缩放，请在分选仪上运行细胞并调整 FSC 和 SSC。首先记录阴性对照管的数据，然后记录每个单染色补偿对照管的数据并计算补偿。

之后，在双变量 FSC 上对实验样品进行 gabe ，SSC 点图以包括淋巴细胞和骨髓细胞。通过比较 FSC 的不同信号，排除双峰和聚集体。然后在双变量点图上可视化显示 CD45 和 CD36 的单线细胞。

CD45 阳性事件代表白细胞及其祖细胞。CD45 阴性和 CD36 阳性事件代表红系祖细胞。要定义 CD36 阳性和 CD45 阳性细胞，请使用设门工具，然后可视化 CD45 阳性事件和另一个显示 CD34 和 SSC 参数的点图。

接下来，使用设门工具定义处于不同分化阶段的 CD34 阳性细胞或白细胞祖细胞以及 SSC 高细胞或髓样细胞。之后，选择门以分类到外部收集管中。最后，在 4 摄氏度下继续进行细胞分选，直到获得所需数量的细胞。

通过添加补充有人重组促红细胞生成剂或 EPO 的 IMDM 完全培养基来稀释细胞。将 300 μL 稀释的细胞转移到 3 mL H4434 培养基中，并在室温下振荡孵育 5 分钟。接下来，将三个 35 毫米的培养皿接种，每个培养皿放置 1 毫升细胞悬液。

将两个培养皿和第三个装满水的培养皿一起放入 100 毫米的盘子中。将这些细胞在 37 摄氏度的加湿培养箱中培养 5% 二氧化碳 14 天。使用 40 倍放大倍率的倒置显微镜和用评分网格标记的培养皿，根据其形态对菌落进行评分。

将集落形成单位或 CFU 分为多电位祖细胞、粒细胞单核细胞祖细胞、爆发形成单位红细胞和集落形成单位红细胞。首先，根据文本方案从传真或 CFU 检测板中回收细胞，然后进行 DNA 提取。离心细胞后，使用自动血液 DNA 分离仪器从沉淀中分离核酸。

使用荧光计测量 DNA 浓度。根据制造商的说明准备样品，然后将样品放入荧光计的样品室中。根据手册，将稀释的 DNA 添加到 DNA 聚合酶、引物组和反应混合物的混合物中，以构建 PCR 反应。

包括来自供体和受体的移植前 DNA 以及不含核酸酶的水作为阴性对照，9947A 为阳性对照。为了分析 PCR 结果，将 10 μL 变性 DNA 样品添加到 96 孔反应板的孔中。密封板，短暂离心并将板放在冰上。

巨核细胞红细胞祖细胞分为 CD36 阳性和 CD45 抗原阴性的群体。此外，CT45 阳性和 CD34 阳性细胞被鉴定为淋巴髓系前体细胞和 CD45 阳性细胞，作为成熟髓系细胞具有高 SSC 信号。分选后红系祖细胞纯度在 85% 以上，髓系细胞纯度在 95% 以上用 CD34 特异性磁珠分离的骨髓细胞培养 14 d。

其中一些细胞似乎会增殖、分化并形成集落。用不同浓度的 EPO 刺激增加了显著的红色红细胞菌落的形成。对受体和供体 DNA 具有特异性的短串联重复序列或 STR 进行 PCR 分析可以检测细胞中的嵌合体。

该方法成功测定了从骨髓细胞的细胞分选获得的细胞中，以及从克隆形成测定中获得的细胞中受体 DNA 与供体 DNA 的量。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住此技术需要标准化并由经过适当培训的人员执行。

在此程序之后，可以进一步分析残留供体来源的红系祖细胞，以回答其他问题，例如，遗传校正的红系干细胞的选择性优势。经过开发，这项技术为干细胞移植领域的研究人员铺平了道路，以探索红系细胞隔室中祖细胞的增殖和分化。看完这个视频，你应该对血红蛋白病患者干细胞移植后如何监测植入情况有一个很好的了解。