无异条件下多原代羊水和膜细胞重新编程

该程序的总体目标是通过游离素重编程从两种不同类型的胎儿干细胞中有效地获得诱导多能干细胞。该方法有助于为组织工程、疾病建模、基础研究或纵向研究提供多能干细胞来源。该技术的主要优点是 iPSC 的重编程和成熟在化学定义的条件下发生，同时可早期用于潜在的基于儿科细胞的治疗。

演示此程序的是首席研究员 Steven McClellan 和我本人。出生后尽快获取胎盘。切下 9 平方厘米的羊膜段，并在 50 毫米离心管中用 30 毫升 PBS 洗涤，并补充有抗生素、抗真菌溶液。

从膜上去除血凝块，然后用一把细手术刀在 10 厘米的无菌组织培养皿中将膜切成细块。使用手术刀刀片将切碎的膜组织团转移到一个含有 4.7 毫升 RPMI-1640 培养基的组织解离管中。混合解离酶。

将试管安装到组织分离器上，然后运行 program h_tumor_01。然后将试管在 37 摄氏度的摇床上孵育 30 分钟。用 35 毫升 RPMI-1640 进一步稀释悬浮液，并应用于放置在 50 毫升离心管上的 70 微米过滤器上。

在室温下以 200 x g 离心 5 分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于 5 ml RPMI-1640 中，并使用血细胞计数器计数细胞。将细胞以大约每平方厘米 10， 000 个细胞的密度接种到组织培养瓶中，加入新鲜制备的 AFMC 培养基，并补充有抗生素、抗真菌溶液。

通过向细胞片中添加 2 毫升细胞分离酶，从一个 T75 培养瓶中收获低传代数羊水和膜干细胞，用于重编程。在 37 摄氏度下孵育 5 到 8 分钟。以 200 次 g 离心 45 分钟后，将沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并充分混合以洗去血清成分。

使用血细胞计数器计数细胞。然后将细胞密度调整为每毫升 PBS 100， 000 个细胞，现在四方放入 1.5 毫升微量离心管中。将微量离心管放入 5 毫升聚苯乙烯管中，在常规摆动舵中离心，并在室温下以 200 倍 g 离心 4 分钟。

离心后，倒置试管，将上清液倒入废液容器中，然后以 200 x g 的速度进行额外的离心步骤，持续 3 分钟。离心后，使用 200 微升移液器小心地从试管中吸出剩余的液体。将转染吸头、试管、重悬缓冲液和电解缓冲液放入组织培养柜中。

将转染装置靠近，以便将其管站直接放入柜中。在一个转染管中加入 3 mL 电解缓冲液，然后将试管完全推入插槽内，将其安装到工作站中。从零下 80 摄氏度的储存中取出先前制备的重编程质粒溶液等分试样，并在培养柜中让它们在室温下解冻。

在设备上设置转染参数，以在 950 伏电压下提供一个 40 毫秒的脉冲。将含有 100， 000 个细胞的沉淀重悬于 10 μL 重悬缓冲液中。快速工作，向重悬细胞中加入 1/10 的重编程质粒溶液。

将转染吸头安装到转染移液器上。然后小心地将细胞悬液吸入转染吸头中，避免形成气泡。将转染移液管插入转染管中。

然后按下转染设备屏幕上的开始按钮。等待有关转染成功的筛选消息。然后立即从试管中取出移液器。

将悬浮液排出到目标六孔板的一个孔中。混合来自相邻孔的培养基，并将悬浮液均匀分配到两个孔中。对每个微量离心管重复细胞转染。

首先将 30 微升 0.5 毫摩尔 EDTA 和 PBS 添加到五个 PCR 管中。然后将吸头加载到设置为 2 微升的 10 微升移液器上。将移液器吸头以一定角度握住菌落边缘，然后小心地逐渐将整个菌落从表面刮下。

立即将整个菌落吸入移液器吸头中，并将其转移到含有 EDTA 的制备的 PCR 管之一中。对其他 4 个菌落重复该过程后，在室温下孵育 4 到 6 分钟。使用较大的移液器吸头轻轻上下移液每个细胞悬液，将集落分解成更小的团块。

避免创建单细胞悬液。然后将悬浮液直接接种到重组玻连蛋白包被的 24 孔板的目标孔中。对剩余的菌落重复该过程后，孵育 3 到 6 天。

4 到 6 天后，当集落生长并变得紧凑时，用 300 微升 0.5 毫摩尔 EDTA 洗涤细胞片，并立即吸出。然后再加入 300 μL，在室温下孵育 5 分钟。吸出 EDTA 后，将 1 毫升移液器设置为容量，安装到 1 毫升宽口径尖端，然后从玻连蛋白包被的六孔板的目标孔中吸出 E8 培养基。

源板的一个孔中喷出培养基流，以洗去 iPSC 培养物。然后将悬浮液转移到目标孔中，上下移液数次，将集落分解成 20 至 40 个细胞的团块。铺板所有细胞后，通过轻轻摇动板来确保团块均匀分布。

然后将板放回培养箱中，以进行团块粘附和菌落生长。羊水和膜干细胞代表重编程的源细胞，显示出典型的细长和相亮的间充质形态。细胞在经历间充质到上皮转变后获得上皮特性，这导致形成带有鹅卵石样细胞的集落。

这些集落增殖并产生不规则的 MET 细胞团块。在重编程的后期阶段，出现完全重编程的细胞集落，这些细胞具有明确的边界，可单独识别。这些完全重编程的细胞与数量更多的 MET 集落一起存在。

此处显示了一个完全重编程的分离成熟克隆。在 iPSC 衍生和成熟之后，可以对其进行详细表征，并将分化指导为多种细胞类型。不要忘记，与未经病原体检测的人体组织一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如个人防护设备和在生物安全柜中工作。

看完这个视频，你应该对如何在胎儿干细胞中诱导多能性、使用什么试剂和设备以及如何常规培养多能干细胞有一个很好的了解。