植物原生质体mRNA相互作用组捕获

本优化的 mRNA 相互作用组捕获技术的总体目标是从植物细胞中分离并鉴定与 mRNA 结合的蛋白质组。该方法应用于拟南芥（arabidopsis thaliana）叶肉原生质体，这是一种在多种细胞实验中广泛使用的多功能工具性细胞类型。该技术有助于解答转录后基因调控领域中的关键科学问题，例如发现并深入理解植物信使 RNA 结合蛋白的功能与作用机制。

该技术的主要优势在于能够直接从生理环境中分离并鉴定植物信使RNA结合的蛋白质组。因此，该方法可深入了解拟南芥叶肉原生质体中的信使RNA结合蛋白。此外，该方法还可应用于其他系统，如其他植物的原生质体或组织。

当我们注意到该方法已成功应用于酵母和哺乳动物细胞系时，首次产生了本方法的构想。按照文本方案所述，分别制备两份拟南芥叶肉组织原生质体样本。将不进行紫外交联的对照样本，即非交联样本（non-CL样本），置于冰上保存。

将待交联的原生质体悬液，即CL样品，转移至一个大培养皿中。加入30毫升冰预冷的MMG溶液以覆盖培养皿表面，并通过轻柔吹打使细胞均匀分散。在转移至紫外交联装置时，用铝箔覆盖培养皿。

立即将打开的培养皿放入紫外交联仪中。确保培养皿与紫外灯之间的距离为八厘米，然后照射样品一分钟。之后，迅速将培养皿中的原生质体悬液分装到两个新的50毫升圆底离心管中。

用额外的五毫升冰冻 MMG 溶液冲洗培养皿底部，以收集剩余的原生质体。将悬液均分至两个离心管中。接下来，将非 CL 样品管和两个 CL 样品管在 4 摄氏度下以 100 × g 离心五分钟。

弃去上清液后，将含有非交联沉淀物的离心管放回冰上。向每个交联样品管中加入10毫升预冷的MMG溶液，并轻轻振荡试管以重悬沉淀物。将两个样品合并至一个50毫升圆底离心管中，在4°C下以100 × g离心5分钟。

弃去上清液后，将沉淀置于冰上。然后向每个样品的细胞沉淀中加入九毫升预冷的裂解结合缓冲液。通过上下吹打约二十次裂解原生质体，直至溶液呈均匀的浅绿色。

进行匀浆时，将原生质体裂解液用带有细针的 50 毫升玻璃注射器推注两次，然后将裂解液置于冰上孵育 10 分钟。用液氮速冻样品，并在 -80 摄氏度条件下保存最多三周。将装有冷冻原生质体裂解液的离心管在室温下解冻后，立即置于冰上保存。

将1.8毫升寡聚(dT)磁珠分装至六个置于冰上的新2毫升圆底微量离心管中。每管中加入600微升裂解结合缓冲液，轻轻吹打混匀，然后在旋转仪上温和旋转2分钟以洗涤磁珠悬液。保持磁珠置于冰上。

接下来，将所有六个含有磁珠的试管放入磁力架中至少三分钟，以确保磁珠完全捕获。当磁珠完全被吸附后，悬浮液将变得澄清。随后，弃去六个试管中的上清液，并立即向其中各加入九毫升原生质体裂解液。

用移液枪将磁珠与裂解液混合，直至悬液呈现均匀的棕色。将离心管置于4摄氏度下轻轻旋转孵育一小时。孵育结束后，将离心管重新放回磁力架上静置三分钟。

当所有磁珠被吸附在管壁一侧时，将含有原生质体裂解液的上清液收集到六个新的 2 毫升圆底微量离心管中。接着，向每管含有磁珠的样品中加入 1.5 毫升预冷的洗涤缓冲液一，并通过移液重悬磁珠。轻轻旋转孵育 1 分钟后，将各管重新置于磁力架上静置 3 分钟。

弃去上清液，并重复此洗涤步骤一次。使用1.5毫升冰冻的洗涤缓冲液二，重复相同的洗涤程序两次。如果mRNP已从原生质体裂解液中有效分离，则在CL样品中应可见到珠粒沉淀周围出现光环。

最后，用1.5毫升冰冻的低盐缓冲液再洗涤一次。洗涤后，向每根试管中加入500微升洗脱缓冲液，用移液器轻轻重悬磁珠。在50摄氏度孵育3分钟，以释放带有poly-A尾的RNA。

用移液器轻轻吹打重悬磁珠一次，并将离心管放回4摄氏度的磁力架中静置五分钟。将全部六个离心管中的洗脱液转移并合并至一个置于冰上的15毫升圆底离心管中。此步骤将获得约三毫米的洗脱液体积。

可立即使用分光光度计测定RNA的质量和数量。用一毫升冰浴洗脱缓冲液将寡聚(dT)磁珠清洗两次，以准备重复使用。随后，用一毫升冰浴裂解结合缓冲液清洗磁珠，使盐浓度恢复至500毫摩尔。

使用这些已洗涤的寡聚(dT)磁珠重复结合、洗涤和洗脱步骤，额外进行两轮。这将耗尽原生质体裂解液中的poly-A尾RNA，并为每个样品总共获得九毫米的洗脱液。磁珠可储存并用于其他实验，最多使用三次。

为了检测RNA的质量，根据文本方案使用蛋白酶K溶液消化经紫外线交联的蛋白质。然后，使用RNA纯化试剂盒纯化RNA，以去除任何残留的污染物。纯化后，样品即可用于通过qRT-PCR进行RNA质量检测。

首先，向每个样品中加入8毫升，并加入含有RNA酶A和RNA酶T1的RNA酶混合液100单位。短暂涡旋混匀后，将样品在37摄氏度下孵育1小时。为浓缩mRNA结合蛋白（mRBP），使用离心过滤装置对样品进行过滤。每个样品将获得75微升溶液，含2微克蛋白质。

长期保存时，将样品在负80摄氏度下冷冻。进行SDS-PAGE凝胶电泳时，取25微升浓缩样品与15微升2X上样缓冲液混合，于95摄氏度加热5分钟。将样品加载至含有5%浓缩胶和12%分离胶的SDS-PAGE凝胶中，并同时加入蛋白Marker。

接下来，用超纯水洗涤凝胶两次，每次五分钟。使用商用银染试剂盒对凝胶进行染色。如果起始原生质体数量足够，蛋白条带将在五分钟内显现。

为进一步验证mRBP，按照文本方案所述，从第二块一维凝胶中纯化肽段。这些纯化的肽段现可通过纳米级反相液相色谱、质谱以及定性和定量蛋白质组学进行分析。在寡核苷酸-d(T)磁珠捕获后，qRT-PCR结果显示，与18S rRNA相比，多聚泛素10参考mRNA的水平显著升高。

由于寡聚-d(T)磁珠仅与带有poly-A尾的RNA结合，这表明洗脱液中富集了mRNA。通过银染的SDS-PAGE凝胶进一步评估寡聚-d(T)磁珠对mRBP的捕获效果。该凝胶显示，与未交联的非CL样品相比，经紫外交联的CL样品中蛋白质含量显著更高。

紫外照射的持续时间会影响交联效率。该银染SDS-PAGE凝胶证实，紫外照射1分钟或3分钟为最佳条件，条带强度最强。通过定量蛋白质组学分析共鉴定出325种蛋白质。

由于这些蛋白质各自的肽段丰度较低且肽段强度变异性较高，其中225种蛋白质低于显著性水平。然而，由于它们仅在CL样品中被定性检出，因此均被视为阳性结果。这325种蛋白质进一步分为三类：核糖体蛋白质、主要RBP和候选RBP。

这些候选的RBP缺乏传统的RNA结合结构域，且大多数尚未验证其功能，提示其可能在RNA调控中具有新的作用。一旦掌握，该技术若操作得当可在一周内完成。该技术建立后，为研究人员探索双子叶和单子叶植物细胞与组织中全基因组范围的信使RNA结合蛋白质组开辟了道路。