Name: mRNA从植物原生质体捕获 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 学习从拟南芥叶肉原生质体中分离和鉴定mRNA结合蛋白的优化方法。该技术利用体内紫外交联分析mRNA结合蛋白质组，为植物转录后基因调控研究提供可靠的实验手段。

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我们感谢 Joris Winderickx 教授实验室提供了配备常规紫外灯的紫外交联装置。K. G. 由鲁汶大学（KU Leuven）研究基金资助，并获得 FWO 项目 G065713N 的支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

我们成功地将最初为酵母和人类细胞开发的mRNA互作组捕获技术应用于植物叶片叶肉原生质体。叶片叶肉细胞是植物叶片中基本组织的主要类型。该方法的主要优势在于利用体内交联，直接从生理环境中发现结合蛋白。
在本实验方案中，我们主要介绍了一系列优化的实验条件（例如， 原生质体的起始数量以及紫外照射的持续时间50. CL 样品中捕获的蛋白质只有在起始细胞数量不少于 107 原生质体（中等规模）被使用（步骤1.5.5）。较低浓度在SDS-PAGE上无法产生可观察的mRBP条带，可能不应用于后续的蛋白质组学分析。实际上，使用超过107 细胞（例如， 109 在大规模实验中也是可行的20银染实验结果表明，以 0.00875 W/cm² 的强度进行 1 分钟紫外照射2 由连续波紫外光源产生的强度为最佳（图1D...

真核生物利用多种RNA生成调控途径来维持细胞的生物学过程。在已知的RNA类型中，信使RNA（mRNA）具有高度多样性，携带蛋白质及其同工型的编码信息1。转录后基因调控（PTGR）通路决定了前体mRNA（pre-mRNA）的命运2,3。来自不同基因家族的RNA结合蛋白（RBP）调控RNA的代谢过程，在PTGR中，特定的mRNA结合蛋白（mRBP）通过与mRNA直接的物理相互作用引导其命运，形成具有功能的信使核糖核蛋白复合物（mRNP）。因此，鉴定和表征mRBPs及其mRNPs对于理解细胞内mRNA代谢调控机制至关重要2。在过去三十年中，多种体外（in vitro）方法——包括RNA电泳迁移率变动分析（REMSA）、基于文库构建体的指数富集配体系统进化分析（SELEX）、RNA Bind-n-Seq（RBNS）、放射性标记或定量荧光RNA结合分析、X射线晶体学以及核磁共振波谱法（NMR）4,5,6,7,8,9——已被广泛应用于主要来源于哺乳动物细胞的RBP研究。这些哺乳动物RBP研究结果可通过RNA结合蛋白数据库（RBPDB）进行检索，该数据库汇总了已发表的实验观察数据10。
尽管这些体外方法是强大的工具，但它们仅能从给定的RNA序列库中确定结合的RNA基序，因此在发现新的靶标RNA方面存在局限性。基于蛋白质序列和结构保守性的计算策略在预测全基因组范围内的RNA结合蛋白（RBP）时也存在同样的局限15。为克服这一限制，已建立一种新的实验方法，可鉴定目标RBP所相互作用的RNA基序，并确定其结合的精确位置。该方法称为“交联与免疫沉淀”（CLIP），包括体内紫外（UV）交联，随后进行免疫沉淀11。早期研究表明，DNA和RNA核苷酸在激发波长超过245 nm的紫外光照射下可发生光活化反应。其中，胸苷酸的反应最为有利（光反应活性递减顺序：dT ≥ dC > rU > rC, dA, dG）12。使用波长为254 nm（UV-C）的紫外光照射时，当RNA核苷酸与蛋白质残基之间的距离仅为数埃（Å）时，即可形成共价键。因此，该现象被称为RNA与RBP的“零长度”交联。随后可进行严格的纯化步骤，背景信号极低13,14。
一种与CLIP互补的策略是结合 在活体中 通过蛋白质鉴定的紫外交联技术描述RNA结合蛋白的图景。已有多种此类全基因组范围的mRNA结合蛋白质组从酵母细胞、胚胎干细胞（ESCs）和人类细胞系中分离获得。即， HEK293 和 HeLa）中应用这一新型实验方法，称为 &#34;mRNA相互作用组捕获&#34;18,19,20,21该方法包括 在体内 紫外线交联结合mRNP纯化及基于质谱的蛋白质组学分析。通过应用该策略，已鉴定出大量新的 &#34;双功能蛋白&#34; 含有非经典RNA结合结构域（RBDs）的RNA结合蛋白（RBPs）已被发现，且越来越多的证据表明具有RNA结合能力的蛋白质数量远超此前预期15,16,17该方法的使用为研究RNA结合蛋白（RBPs）时开展新的应用和回答新的生物学问题提供了可能。例如，最近一项研究探讨了酵母与人类细胞之间mRNA结合蛋白组（核心RBP蛋白组）的保守性。22.
植物RBPs已被发现参与生长和发育（例如，参与开花时间的转录后调控、昼夜节律以及线粒体和叶绿体中的基因表达24,25,26,27,28,29此外，它们被认为在响应非生物胁迫的细胞过程中发挥功能（例如， 低温、干旱、盐胁迫和脱落酸（ABA）31,32,33,34。在预测中，有超过200个RBP基因 拟南芥 基因组，基于RNA识别基序（RRM）和K同源（KH）结构域序列基序；在水稻中，已发现约250个35,36值得注意的是，许多预测的RNA结合蛋白似乎是植物所特有的（例如， 无后生动物中约50%预测蛋白的直系同源物 拟南芥 含有RRM结构域的RNA结合蛋白（RBPs）35，表明其中许多可能具有新的功能。大多数预测的 RNA 结合蛋白的功能仍有待阐明23.
从与mRNA结合的蛋白质组中分离 拟南芥 通过使用mRNA互作组捕获技术，最近已报道了去黄化幼苗、叶片组织、培养的根细胞以及叶肉原生质体中的mRNA结合蛋白组38,39这些研究展示了近期系统性编目植物中功能性 RBPs 的巨大潜力。本文中，我们提供了一种从植物原生质体中进行 mRNA 互作组捕获的实验方案（即， 无细胞壁的细胞。 拟南芥 叶肉原生质体是叶片细胞的主要类型。分离得到的原生质体可使紫外线充分穿透细胞。该细胞类型可用于瞬时表达蛋白质的功能鉴定实验。40,41此外，原生质体分离技术已应用于多种其他植物细胞类型和物种42,43,44 (例如， Petersson 等，2009；Bargmann 和 Birnbaum，2010；以及 Hong 等., 2012).
该方法共包含 11 个步骤（图 1A）。首先分离 Arabidopsis 叶肉原生质体（步骤 1），随后进行紫外线（UV）照射以形成交联的信使核糖核蛋白复合物（mRNPs）（步骤 2）。当原生质体在变性条件下裂解时（步骤 3），交联的 mRNPs 被释放到裂解/结合缓冲液中，并通过寡聚脱氧胸苷酸磁珠（oligo-d(T)25 beads）进行富集（步骤 4）。经过多轮严格洗涤后，纯化 mRNPs 并进行进一步分析。在蛋白酶 K 消化去除与 mRNA 交联的 mRNA 结合蛋白（mRBPs）的变性肽段后，纯化交联的 mRNA，并通过定量反转录 PCR（qRT-PCR）验证 RNA 质量（步骤 5 和 6）。经过 RNase 处理和蛋白浓缩（步骤 7）后，通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和银染检测蛋白质量（步骤 8）。交联样本（CL）与未交联样本（non-CL；即未经 UV 照射的原生质体阴性对照样本）之间的蛋白条带模式差异可被清晰观察到。蛋白质的鉴定通过基于质谱的蛋白质组学实现。CL 样本中的蛋白质通过一维聚丙烯酰胺凝胶电泳（1D-PAGE）分离，以去除可能的背景污染，随后在凝胶内使用胰蛋白酶将蛋白质酶解为短肽，并进行纯化（步骤 9）。纳米级反相液相色谱联用质谱（nano-LC-MS）可用于确定 mRNA 结合蛋白质组中可靠蛋白质的数量（步骤 10）。最后，通过生物信息学分析对鉴定出的 mRBPs 进行表征和编目（步骤 11）。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.8 M 甘露醇</td><td>Sigma</td><td>M1902-500G</td><td>初级等渗酶溶液 &amp;amp;&lt;br/&gt; MMg 溶液</td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>MERCK</td><td>Art. 4935</td><td>初级等渗酶溶液 &amp;amp;&lt;br/&gt; W5 缓冲液</td></tr><tr><td>0.2 M MES (pH 5.7)&lt;br/&gt; (4-吗啉乙磺酸)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M2933</td><td>初级等渗酶溶液，&lt;br/&gt; W5 缓冲液 &amp;amp;&lt;br/&gt; MMg 溶液，&lt;br/&gt; 过滤除菌</td></tr><tr><td>纤维素酶 R10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>CELLULASE&lt;br/&gt; &amp;ldquo;ONOZUKA&amp;rdquo;&lt;br/&gt; R-10, 10 g</td><td>终末等渗酶溶液</td></tr><tr><td>离析酶 R10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>MACEROZYME R-10, 10g</td><td>终末等渗酶溶液</td></tr><tr><td>10% (&lt;em&gt;w/v&lt;/em&gt;) BSA&lt;br/&gt; (牛血清白蛋白)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>终末等渗酶溶液 &amp;amp;&lt;br/&gt; 过滤除菌</td></tr><tr><td>1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Chem-Lab NV</td><td>CL00.0317.1000</td><td>终末等渗酶溶液，&lt;br/&gt; W5 缓冲液 &amp;amp;&lt;br/&gt; 消化缓冲液</td></tr><tr><td>1 M NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3160/60</td><td>W5 缓冲液</td></tr><tr><td>2 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td>MMg 溶液</td></tr><tr><td>1 M LiCl&lt;br/&gt; (氯化锂)</td><td>Acros</td><td>199885000</td><td>裂解/结合缓冲液，&lt;br/&gt; 洗涤缓冲液 1，&lt;br/&gt; 洗涤缓冲液 2 &amp;amp;&lt;br/&gt; 低盐缓冲液</td></tr><tr><td>5% (&lt;em&gt;w/v&lt;/em&gt;) LiDS&lt;br/&gt; (十二烷基硫酸锂)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4632-25G</td><td>裂解/结合缓冲液，&lt;br/&gt; 洗涤缓冲液 1 &amp;amp;&lt;br/&gt; 过滤除菌</td></tr><tr><td>1 M DTT&lt;br/&gt; (二硫苏糖醇)</td><td>Thermo Fisher Scientific&lt;br/&gt; 洗涤缓冲液 1 &amp;amp;&lt;br/&gt; 洗涤缓冲液 2</td><td>307866</td><td>裂解/结合缓冲液，</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7.5) (三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，盐酸 (HCl))</td><td>Acros &amp;amp;&lt;br/&gt; Fisher Chemical</td><td>167620010 &amp;amp;&lt;br/&gt; H/1200/PB15</td><td>裂解/结合缓冲液，&lt;br/&gt; 洗涤缓冲液 1，&lt;br/&gt; 洗涤缓冲液 2，&lt;br/&gt; 低盐缓冲液 &amp;amp;&lt;br/&gt; 洗脱缓冲液</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (乙二胺四乙酸)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>ED-500G</td><td>裂解/结合缓冲液，&lt;br/&gt; 洗涤缓冲液 1，&lt;br/&gt; 洗涤缓冲液 2，&lt;br/&gt; 低盐缓冲液 &amp;amp;&lt;br/&gt; 洗脱缓冲液</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>8.22184.0500</td><td>寡聚脱氧胸苷酸-d(T)&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt; 磁珠再生</td></tr><tr><td>0.1 M NaOH</td><td>VWR PROLABO CHEMICALS</td><td>28244.295</td><td>寡聚脱氧胸苷酸-d(T)&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt; 磁珠再生</td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7.4)&lt;br/&gt; (磷酸盐缓冲液)&lt;br/&gt; 含&lt;br/&gt; (NaCl; KCl; Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;; KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Chemical, MERCK,&lt;br/&gt; Sigma-aldrich &amp;amp; SAFC</td><td>S/3160/60,&lt;br/&gt; Art. 4935,&lt;br/&gt; 71640-250G &amp;amp;&lt;br/&gt; 60230</td><td>寡聚脱氧胸苷酸-d(T)&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt; 磁珠再生</td></tr><tr><td>蛋白酶 K 溶液 (2 &amp;mu;g/&amp;mu;L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11789020</td><td>蛋白质消化</td></tr><tr><td>上样染料</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>qPCR 预混液</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>qRT-PCR 检测</td></tr><tr><td>RNase Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2286</td><td>RNA 消化</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-aldrich</td><td>322415</td><td>凝胶固定与脱色</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-aldrich</td><td>537020</td><td>凝胶固定与脱色</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20278</td><td>凝胶染色</td></tr><tr><td>1 M NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; (碳酸氢铵)&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>09830-500G</td><td>凝胶水合 &amp;amp;&lt;br/&gt; 消化缓冲液</td></tr><tr><td>CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CN&lt;br/&gt; (乙腈)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>34851-100ML</td><td>凝胶脱水 &amp;amp;&lt;br/&gt; 肽溶解液</td></tr><tr><td>IAA&lt;br/&gt; (碘乙酸)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>I4386-10G</td><td>烷基化试剂</td></tr><tr><td>TFA&lt;br/&gt; (三氟乙酸)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>302031-10X1ML</td><td>肽溶解液</td></tr><tr><td>FA&lt;br/&gt; (甲酸)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>06554-5G</td><td>肽提取</td></tr><tr><td>胰蛋白酶溶液 (6 ng/&amp;mu;L)</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>消化缓冲液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>土壤</td><td>Peltracom</td><td>LP2D</td><td>植物生长</td></tr><tr><td>蛭石 3</td><td>Sibli AS</td><td>05VERMICULIET</td><td>植物生长</td></tr><tr><td>培养皿 (150 x 20 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>原生质体悬浮液载体</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Millipore</td><td>SE2M229104</td><td>终末等渗酶溶液均质化</td></tr><tr><td>剃刀片</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>莲座叶条切割</td></tr><tr><td>35-75 &amp;mu;m 尼龙筛网</td><td>SEFAR NITEX</td><td>74010</td><td>原生质体悬浮液过滤</td></tr><tr><td>50 mL 圆底管</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1918-10EA</td><td>原生质体悬浮液载体</td></tr><tr><td>血细胞计数板&lt;br/&gt; (B&amp;uuml;rker 血细胞计数板)</td><td>MARIENFELD</td><td>650030</td><td>原生质体细胞计数</td></tr><tr><td>紫外交联装置&lt;br/&gt; (HL-2000 HybriLinker)</td><td>UVP, LLC</td><td>UVP95003101</td><td>&lt;em&gt;体内&lt;/em&gt; 紫外交联</td></tr><tr><td>紫外灯&lt;br/&gt; (Sankyo-Denki G8T5)</td><td>SANKYO&lt;br/&gt; DENKI</td><td>SD G8T5</td><td>&lt;em&gt;体内&lt;/em&gt; 紫外交联</td></tr><tr><td>50 mL 玻璃注射器</td><td>FORTUNA Optima</td><td>Z314560</td><td>原生质体裂解物均质化</td></tr><tr><td>细针头 (0.9 x 25 mm)</td><td>Becton Dickinson microlance 3</td><td>2021-04</td><td>原生质体裂解物均质化</td></tr><tr><td>旋转混合仪 L26 型</td><td>Labinco BV</td><td>26110912</td><td>样品旋转孵育</td></tr><tr><td>寡聚脱氧胸苷酸-d(T)&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt; 磁珠&lt;br/&gt; (5 mg/mL)</td><td>New England BioLabs</td><td>S1419S</td><td>mRNPs 和 mRNAs 结合与下拉</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td>mRNPs 和 mRNAs 结合与下拉</td></tr><tr><td>离心过滤装置&lt;br/&gt; (Amicon Ultra-4 离心过滤装置)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>mRBP 浓缩</td></tr><tr><td>Pierce 银染试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24612</td><td>银染检测</td></tr><tr><td>RNA 纯化试剂盒&lt;br/&gt; (InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td><td>STRATEC Molecular</td><td>1064100300</td><td>RNA 纯化</td></tr><tr><td>分光光度计 (NanoDrop 1000 分光光度计)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>RNA 质量与数量</td></tr><tr><td>实时 PCR 仪&lt;br/&gt; (StepOne 实时 PCR 仪)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td>cDNA 定量</td></tr><tr><td>&amp;micro;-C18 柱&lt;br/&gt; (Millipore Zip Tip &amp;micro;-C18 柱)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>720046-960EA</td><td>肽纯化</td></tr><tr><td>质谱仪&lt;br/&gt; (Q Exactive 混合四极杆-轨道阱质谱仪)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>基于质谱的蛋白质组学</td></tr><tr><td>液相色谱仪 (Ultimate 3000 超高效液相色谱 (UHPLC) 仪)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td>基于质谱的蛋白质组学</td></tr><tr><td>C18 柱&lt;br/&gt; (Easy Spray Pepmap RSLC C18 柱)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ES800</td><td>基于质谱的蛋白质组学</td></tr><tr><td>C18 预柱&lt;br/&gt; (Acclaim Pepmap 100 C18 预柱)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td>基于质谱的蛋白质组学</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;qRT-PCR 检测引物&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;序列&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UBQ10&lt;/em&gt; mRNA&lt;br/&gt; (Li &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2014)</td><td>Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG&lt;br/&gt; Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA&lt;br/&gt; (Durut &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2014)</td><td>Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG&lt;br/&gt; Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

植物原生质体mrna相互作用组捕获

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA结合蛋白（RBPs）决定RNA的命运。它们参与所有RNA的生成途径，尤其在信使RNA（mRNAs）的转录后基因调控（PTGR）中发挥重要作用。近年来，通过一种名为“mRNA互作组捕获”（mRNA interactome capture）的新方法，已成功从酵母和哺乳动物细胞系中分离出多个与mRNA结合的蛋白质组，该方法能够直接从生理环境中鉴定出与mRNA结合的蛋白（mRBPs）。该方法包括体内（in vivo）紫外（UV）交联、利用寡聚dT（oligo(dT)）磁珠下拉并纯化信使核糖核蛋白复合物（mRNPs），以及随后通过质谱（MS）对交联蛋白进行鉴定。最近，采用相同方法，已从拟南芥（Arabidopsis）的不同组织来源——黄化幼苗、叶片组织、叶肉原生质体和培养的根细胞——同时报道了多个植物mRNA结合的蛋白质组。本文中，我们介绍了针对拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶肉原生质体优化的mRNA互作组捕获方法，这类细胞是开展多种细胞实验的多功能工具。获得最佳蛋白产量的条件包括起始组织的用量和UV照射时间。在中等规模实验（107个细胞）获得的mRNA结合蛋白质组中，已知具有RNA结合能力的RBPs显著富集，并鉴定出大量新的RBPs。该实验可进一步放大至大规模（109个细胞），且优化后的方法可应用于其他植物细胞类型和物种，以广泛分离、编目和比较植物中的mRNA结合蛋白质组。

在洗涤步骤4.3使用洗涤缓冲液2时，我们在CL样本中观察到一个特征性的晕环结构，环绕在珠粒沉淀周围（图1B）。尽管该现象尚未被深入研究，但可能归因于交联的mRNP复合物在磁力捕获过程中干扰了珠粒的聚集，从而形成更为弥散的聚集体。这表明寡聚-d(T)25 珠粒捕获是有效的14。
在非交联对照样本和交联样本中，UBQ10 参考 mRNA 的水平均显著高于 18S rRNA，结果如图 1C 所示。这表明由于寡核苷酸-d(T)25 磁珠可特异性结合带有 poly(A) 尾的 mRNA，导致洗脱液中富集了 mRNA。寡核苷酸-d(T)25 磁珠捕获的效率进一步通过 SDS-PAGE 及银染（步骤 8）得到验证，结果...

本文介绍了一种应用于Arabidopsis thaliana叶肉原生质体的相互作用组捕获方案。该方法关键依赖于体内紫外线交联，可从生理环境中分离并鉴定植物信使RNA结合蛋白。

植物原生质体mRNA相互作用组捕获

RNA结合蛋白（RBPs）决定RNA的命运。它们参与所有RNA的生物合成途径，尤其在信使RNA（mRNAs）的转录后基因调控（PTGR）中发挥重要作用。近年来，利用一种名为“mRNA相互作用组捕获”的新方法，研究人员已成功从酵母和哺乳动物细胞系中分离出多种与mRNA结合的蛋白质组。该方法通过体内紫外（UV）交联、利用寡聚(dT)磁珠下拉并纯化信使核糖核蛋白复合物（mRNPs），随后通过质谱（MS）鉴定交联的蛋白质，从而直接从生理环境中识别mRNA结合蛋白（mRBPs）。最近，采用相同方法，多个研究团队分别从拟南芥的不同组织来源——黄化幼苗、叶片组织、叶片叶肉原生质体以及培养的根细胞——同时报道了植物mRNA结合蛋白组。本文介绍了针对拟南芥叶肉原生质体优化的mRNA相互作用组捕获方法，该细胞类型是开展多种细胞实验的通用工具。优化蛋白得率的关键条件包括起始组织量和紫外照射时间。在中等规模实验（10⁷个细胞）获得的mRNA结合蛋白组中，已知具有RNA结合能力的RBPs显著富集，并鉴定出大量新的RBPs。该实验可进一步放大至10⁹个细胞，且优化后的方法可推广应用于其他植物细胞类型和物种，以广泛分离、编目和比较植物中的mRNA结合蛋白组。

优化的 mRNA 相互作用组捕获技术的总体目标是从植物细胞中分离并鉴定与 mRNA 结合的蛋白质组。该方法应用于拟南芥（arabidopsis thaliana）叶片叶肉原生质体，这是一种在多种细胞实验中广泛使用的细胞类型。该技术有助于回答转录后基因调控领域中的关键问题，例如发现并理解植物信使 RNA 结合蛋白的功能。该技术的主要优势在于，能够直接从生理环境中分离并鉴定与蛋白质组结合的植物信使分子。因此，该方法可深入了解拟南芥叶肉叶绿体原生质体中与信使RNA结合的蛋白质。此外，该方法还可应用于其他系统，如其他植物的原生质体或组织。当我们注意到该方法已成功应用于酵母和哺乳动物细胞系时，首次产生了采用此方法的想法。按照文本方案所述，分别分离两份不同的拟南芥叶片原生质体样本。将不进行紫外线交联的对照样本，即非交联样本，置于冰上保存。将待交联的原生质体悬液（即CL样品）转移至一个大培养皿中。加入30毫升预冷的MMG溶液，覆盖皿底表面，并通过轻柔吹打使细胞均匀分散。将培养皿用铝箔纸包裹，然后转移至紫外交联仪中。立即将打开的培养皿放入紫外交联仪中。确保培养皿与紫外灯之间的距离为八厘米，然后照射样品一分钟。随后，迅速将培养皿中的原生质体悬液等量分装至两个新的50毫升圆底离心管中。用额外的五毫升冰冻 MMG 溶液冲洗培养皿底部，以收集剩余的原生质体。将悬液均分至两个离心管中。接下来，将非 CL 样品管和两个 CL 样品管在 4°C 条件下以 100 × g 离心 5 分钟。弃去上清液后，将含有非CL沉淀的离心管放回冰上。向每个CL样品管中加入10毫升预冷的MMG溶液，并轻轻振荡离心管以重悬沉淀。将两个样品合并至一个50毫升圆底离心管中，在4°C条件下以100 × g离心5分钟。弃去上清液后，将沉淀置于冰上。然后向每个样品的细胞沉淀中加入9 mL预冷的裂解结合缓冲液。通过上下吹打约20次裂解原生质体，直至溶液呈均匀的浅绿色。进行匀浆时，将原生质体裂解液用带有细针头的 50 毫升玻璃注射器反复通过两次，然后将裂解液置于冰上孵育 10 分钟。将样品在液氮中速冻，并在 -80 °C 下保存不超过三周。将含有冷冻原生质体裂解液的离心管在室温下解冻后，立即置于冰上保存。将1.8毫升寡聚(dT)磁珠分装至六个新的2毫升圆底微量离心管中，置于冰上。每管中加入600微升裂解结合缓冲液，轻轻吹打混匀，然后在旋转仪上温和旋转2分钟以洗涤磁珠悬液。保持磁珠处于冰上。接下来，将含有磁珠的全部六个离心管放入磁力架中至少三分钟，以确保磁珠完全被捕获。当磁珠完全被捕获后，悬浮液将变得澄清。随后，弃去六个离心管中的上清液，并立即向每个管中分装九毫升原生质体裂解液。用移液器将磁珠与裂解液混合，直至悬液呈均匀的棕色。将离心管置于4摄氏度环境中，轻轻旋转孵育一小时。孵育结束后，将离心管重新置于磁力架上静置三分钟。当所有磁珠都被吸附到管壁一侧后，收集含有原生质体裂解液的上清，分装至六个新的2毫升圆底微量离心管中。接着，向每管含有磁珠的样品中加入1.5毫升预冷的洗涤缓冲液1，通过移液器重悬磁珠。轻柔旋转孵育1分钟后，将离心管重新放回磁力架中静置3分钟。弃去上清液，并重复此洗涤步骤一次。使用1.5毫升冰冻的洗涤缓冲液二，重复相同的洗涤程序两次。如果mRNP已从原生质体裂解液中有效分离，则CL样品中应在磁珠沉淀周围可见明显的光环。最后，用1.5毫升冰冻的低盐缓冲液重复洗涤一次。洗涤后，向每根离心管中加入500微升洗脱缓冲液，通过移液轻轻重悬磁珠。在50摄氏度孵育3分钟，以释放带有poly-A尾的RNA。轻轻吹打一次使磁珠重悬，然后将离心管放回4摄氏度的磁力架中静置5分钟。将全部六个离心管中的洗脱液转移并合并至一个置于冰上的15毫升圆底离心管中。最终可获得约3毫升的洗脱液。可立即使用分光光度计测定RNA的质量和数量。通过用一毫升冰浴洗脱缓冲液清洗两次，准备可重复使用的寡聚脱氧胸苷酸（oligo-d(T)）磁珠。随后，用一毫升冰浴裂解结合缓冲液清洗，以将盐浓度重新调整至500毫摩尔。使用这些洗涤后的寡聚脱氧胸苷酸（oligo-d(T)）磁珠，重复结合、洗涤和洗脱步骤，再进行两轮。这将从原生质体裂解液中耗尽带有 poly-A 尾的 RNA，并为每个样本总共获得 9 毫升洗脱液。磁珠可保存并用于其他实验，最多使用三次。为了检测RNA的质量，根据文本方案使用蛋白酶K溶液消化经紫外线交联的蛋白质。然后，使用RNA纯化试剂盒纯化RNA，以去除任何残留的污染物。纯化后，样品即可用于通过qRT-PCR进行RNA质量检测。首先，向每个样本的 8 毫升样品中加入含有 RNAse A 和 RNAse T1 的 100 单位 RNA酶混合液。短暂涡旋混匀后，将样品在 37 摄氏度下孵育 1 小时。为富集 mRNA 结合蛋白（mRBP），使用离心过滤装置过滤样品。每个样品将获得 75 微升体积，含 2 微克蛋白质。长期保存时，将样品在负80摄氏度条件下冷冻保存。进行SDS-PAGE凝胶电泳时，取25微升浓缩样品与15微升2X上样缓冲液混合，于95摄氏度加热5分钟。将样品加载至含有5%浓缩胶和12%分离胶的SDS-PAGE凝胶中，并同时加入蛋白分子量标记物。接着，用超纯水洗涤凝胶两次，每次五分钟。使用商用银染试剂盒对凝胶进行染色。如果起始原生质体数量足够，蛋白条带将在五分钟内显现。为进一步验证mRBP，按照文本方案中的说明，从第二块一维凝胶中纯化多肽。这些纯化的多肽现在可通过纳米级反相液相色谱、质谱以及定性和定量蛋白质组学进行分析。在寡聚脱氧胸苷酸（oligo-d(T)）磁珠捕获后，qRT-PCR结果显示，与18S rRNA相比，多聚泛素10参考mRNA的水平显著升高。由于寡聚脱氧胸苷酸（oligo-d(T)）磁珠仅与带有poly-A尾的RNA结合，这表明洗脱液中富集了mRNA。通过银染SDS-PAGE凝胶进一步评估oligo-d(T)磁珠对mRBP的捕获效果。该凝胶显示，与未交联的非CL样品相比，经UV交联的CL样品中蛋白质含量显著更高。紫外线照射时间可影响交联效率。该银染SDS-PAGE凝胶结果证实，照射1分钟或3分钟为最佳条件，蛋白条带强度最强。通过定量蛋白质组学分析共鉴定出325种蛋白质。由于这些蛋白质各自的肽段丰度过低且肽段强度变异性较高，其中225种蛋白质未达到显著性水平。然而，由于它们均仅在CL样本中被定性检出，因此均被视为阳性结果。这325种蛋白质进一步被分为三类：核糖体蛋白质、主要RBP以及候选RBP。候选的RNA结合蛋白缺乏典型的RNA结合结构域，且它们大多数功能尚未得到验证，提示其可能在RNA调控中具有新的作用。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一周内完成。该技术建立后，为植物分子调控通路领域的研究人员探索双子叶和单子叶植物细胞及组织中全基因组范围的信使RNA结合蛋白质组奠定了基础。

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