植物原生质体mRNA相互作用组捕获

优化的 mRNA 相互作用组捕获技术的总体目标是从植物细胞中分离并鉴定与 mRNA 结合的蛋白质组。该方法应用于拟南芥（arabidopsis thaliana）叶片叶肉原生质体，这是一种在多种细胞实验中广泛使用的细胞类型。该技术有助于回答转录后基因调控领域中的关键问题，例如发现并理解植物信使 RNA 结合蛋白的功能。

该技术的主要优势在于，能够直接从生理环境中分离并鉴定与蛋白质组结合的植物信使分子。因此，该方法可深入了解拟南芥叶肉叶绿体原生质体中与信使RNA结合的蛋白质。此外，该方法还可应用于其他系统，如其他植物的原生质体或组织。

当我们注意到该方法已成功应用于酵母和哺乳动物细胞系时，首次产生了采用此方法的想法。按照文本方案所述，分别分离两份不同的拟南芥叶片原生质体样本。将不进行紫外线交联的对照样本，即非交联样本，置于冰上保存。

将待交联的原生质体悬液（即CL样品）转移至一个大培养皿中。加入30毫升预冷的MMG溶液，覆盖皿底表面，并通过轻柔吹打使细胞均匀分散。将培养皿用铝箔纸包裹，然后转移至紫外交联仪中。

立即将打开的培养皿放入紫外交联仪中。确保培养皿与紫外灯之间的距离为八厘米，然后照射样品一分钟。随后，迅速将培养皿中的原生质体悬液等量分装至两个新的50毫升圆底离心管中。

用额外的五毫升冰冻 MMG 溶液冲洗培养皿底部，以收集剩余的原生质体。将悬液均分至两个离心管中。接下来，将非 CL 样品管和两个 CL 样品管在 4°C 条件下以 100 × g 离心 5 分钟。

弃去上清液后，将含有非CL沉淀的离心管放回冰上。向每个CL样品管中加入10毫升预冷的MMG溶液，并轻轻振荡离心管以重悬沉淀。将两个样品合并至一个50毫升圆底离心管中，在4°C条件下以100 × g离心5分钟。

弃去上清液后，将沉淀置于冰上。然后向每个样品的细胞沉淀中加入9 mL预冷的裂解结合缓冲液。通过上下吹打约20次裂解原生质体，直至溶液呈均匀的浅绿色。

进行匀浆时，将原生质体裂解液用带有细针头的 50 毫升玻璃注射器反复通过两次，然后将裂解液置于冰上孵育 10 分钟。将样品在液氮中速冻，并在 -80 °C 下保存不超过三周。将含有冷冻原生质体裂解液的离心管在室温下解冻后，立即置于冰上保存。

将1.8毫升寡聚(dT)磁珠分装至六个新的2毫升圆底微量离心管中，置于冰上。每管中加入600微升裂解结合缓冲液，轻轻吹打混匀，然后在旋转仪上温和旋转2分钟以洗涤磁珠悬液。保持磁珠处于冰上。

接下来，将含有磁珠的全部六个离心管放入磁力架中至少三分钟，以确保磁珠完全被捕获。当磁珠完全被捕获后，悬浮液将变得澄清。随后，弃去六个离心管中的上清液，并立即向每个管中分装九毫升原生质体裂解液。

用移液器将磁珠与裂解液混合，直至悬液呈均匀的棕色。将离心管置于4摄氏度环境中，轻轻旋转孵育一小时。孵育结束后，将离心管重新置于磁力架上静置三分钟。

当所有磁珠都被吸附到管壁一侧后，收集含有原生质体裂解液的上清，分装至六个新的2毫升圆底微量离心管中。接着，向每管含有磁珠的样品中加入1.5毫升预冷的洗涤缓冲液1，通过移液器重悬磁珠。轻柔旋转孵育1分钟后，将离心管重新放回磁力架中静置3分钟。

弃去上清液，并重复此洗涤步骤一次。使用1.5毫升冰冻的洗涤缓冲液二，重复相同的洗涤程序两次。如果mRNP已从原生质体裂解液中有效分离，则CL样品中应在磁珠沉淀周围可见明显的光环。

最后，用1.5毫升冰冻的低盐缓冲液重复洗涤一次。洗涤后，向每根离心管中加入500微升洗脱缓冲液，通过移液轻轻重悬磁珠。在50摄氏度孵育3分钟，以释放带有poly-A尾的RNA。

轻轻吹打一次使磁珠重悬，然后将离心管放回4摄氏度的磁力架中静置5分钟。将全部六个离心管中的洗脱液转移并合并至一个置于冰上的15毫升圆底离心管中。最终可获得约3毫升的洗脱液。

可立即使用分光光度计测定RNA的质量和数量。通过用一毫升冰浴洗脱缓冲液清洗两次，准备可重复使用的寡聚脱氧胸苷酸（oligo-d(T)）磁珠。随后，用一毫升冰浴裂解结合缓冲液清洗，以将盐浓度重新调整至500毫摩尔。

使用这些洗涤后的寡聚脱氧胸苷酸（oligo-d(T)）磁珠，重复结合、洗涤和洗脱步骤，再进行两轮。这将从原生质体裂解液中耗尽带有 poly-A 尾的 RNA，并为每个样本总共获得 9 毫升洗脱液。磁珠可保存并用于其他实验，最多使用三次。

为了检测RNA的质量，根据文本方案使用蛋白酶K溶液消化经紫外线交联的蛋白质。然后，使用RNA纯化试剂盒纯化RNA，以去除任何残留的污染物。纯化后，样品即可用于通过qRT-PCR进行RNA质量检测。

首先，向每个样本的 8 毫升样品中加入含有 RNAse A 和 RNAse T1 的 100 单位 RNA酶混合液。短暂涡旋混匀后，将样品在 37 摄氏度下孵育 1 小时。为富集 mRNA 结合蛋白（mRBP），使用离心过滤装置过滤样品。每个样品将获得 75 微升体积，含 2 微克蛋白质。

长期保存时，将样品在负80摄氏度条件下冷冻保存。进行SDS-PAGE凝胶电泳时，取25微升浓缩样品与15微升2X上样缓冲液混合，于95摄氏度加热5分钟。将样品加载至含有5%浓缩胶和12%分离胶的SDS-PAGE凝胶中，并同时加入蛋白分子量标记物。

接着，用超纯水洗涤凝胶两次，每次五分钟。使用商用银染试剂盒对凝胶进行染色。如果起始原生质体数量足够，蛋白条带将在五分钟内显现。

为进一步验证mRBP，按照文本方案中的说明，从第二块一维凝胶中纯化多肽。这些纯化的多肽现在可通过纳米级反相液相色谱、质谱以及定性和定量蛋白质组学进行分析。在寡聚脱氧胸苷酸（oligo-d(T)）磁珠捕获后，qRT-PCR结果显示，与18S rRNA相比，多聚泛素10参考mRNA的水平显著升高。

由于寡聚脱氧胸苷酸（oligo-d(T)）磁珠仅与带有poly-A尾的RNA结合，这表明洗脱液中富集了mRNA。通过银染SDS-PAGE凝胶进一步评估oligo-d(T)磁珠对mRBP的捕获效果。该凝胶显示，与未交联的非CL样品相比，经UV交联的CL样品中蛋白质含量显著更高。

紫外线照射时间可影响交联效率。该银染SDS-PAGE凝胶结果证实，照射1分钟或3分钟为最佳条件，蛋白条带强度最强。通过定量蛋白质组学分析共鉴定出325种蛋白质。

由于这些蛋白质各自的肽段丰度过低且肽段强度变异性较高，其中225种蛋白质未达到显著性水平。然而，由于它们均仅在CL样本中被定性检出，因此均被视为阳性结果。这325种蛋白质进一步被分为三类：核糖体蛋白质、主要RBP以及候选RBP。

候选的RNA结合蛋白缺乏典型的RNA结合结构域，且它们大多数功能尚未得到验证，提示其可能在RNA调控中具有新的作用。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一周内完成。该技术建立后，为植物分子调控通路领域的研究人员探索双子叶和单子叶植物细胞及组织中全基因组范围的信使RNA结合蛋白质组奠定了基础。