高分辨率融合PCR用于补体受体1长度多态性基因分型:阿尔茨海默病基因易感性评估的创新工具

该方法的总体目标是对补体受体 1 长度多态性进行基因分型，用于评估对疾病（如阿尔茨海默病）的易感性，以更好地了解 CR1 亚型在疾病发病机制中的作用。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如阿尔茨海默病的发病机制。该技术的主要优点是不需要新鲜血液样本，并且更容易、更便宜、更快速，因此适用于更大的人群。

当我们认识到进行蛋白质印迹分析时对新鲜血液样本的必要时间和需求存在挑战时，我们首先想到了这种方法。将 20 μL 蛋白酶 K 移液到 1.5 mL试管的底部。然后，向试管中加入 200 微升样品。

向样品中加入 200 μL 裂解缓冲液。通过脉冲涡旋混合 15 秒。混合后，在 56 摄氏度下在水浴中孵育 10 分钟。

短暂离心 1.5 毫升试管，以去除盖子内侧的液滴。然后，向样品中加入 100 微升乙醇。通过脉冲涡旋再次混匀 15 秒，然后像以前一样短暂离心试管。

接下来，小心地将混合物涂抹在 2 毫升收集管中的膜柱上。在不弄湿边缘的情况下，盖上盖子并以 6， 000 倍 G 离心 1 分钟。将膜柱放入干净的 2 mL 收集管中，丢弃含有滤液的收集管。

小心打开膜柱，加入 500 微升洗涤缓冲液 1，不要弄湿边缘。盖上盖子，以 6， 000 倍 G 离心 1 分钟。然后，将膜柱放入干净的 2 ml 收集管中，丢弃含有滤液的收集管。

小心打开膜柱后，加入 500 μL 洗涤缓冲液 2，不要弄湿边缘。盖上盖子，以 20， 000 倍 G 离心 3 分钟。然后，将膜柱放入新的 2 mL 收集管中并再次离心。

离心后，将膜柱放入干净的 1.5 mL 试管中，弃去含有滤液的收集管。小心打开膜柱并加入 200 微升蒸馏水。将色谱柱在室温下孵育 5 分钟，然后以 6， 000 倍 G 离心 1 分钟。

要执行 HRM-PCR 方案，首先用水将 DNA 样品在 1.5 毫升试管中稀释至浓度为 10 ng/μL。接下来，用水在 1.5 毫升试管中将解冻的引物溶液稀释至相同浓度的 6 微摩尔。解冻 HRM-PCR 试剂盒溶液，并通过涡旋小心混合，以确保回收所有内容物。

在打开小瓶之前，在微量离心机中短暂旋转三个小瓶，这些小瓶含有 DNA 结合染料、氯化镁和水的酶混合物。在室温下的 1.5 mL 试管中，按照文本方案中的说明，使用组分制备用于 120 μL 反应的 PCR 混合物。涡旋小心混合。

分子生物学的良好实践，全神贯注地工作和应用至关重要。将 19 μL PCR 混合物移液到白色多孔板的每个孔中。加入 1 μL 浓度调整的 DNA 模板，然后用密封膜密封白色多孔板。

在标准水平吊篮离心机中以 1， 500 倍 G 的速度离心白色多孔板 1 分钟，该离心机包含用于多孔板的转子和合适的适配器。将白色多孔板加载到 HRM-PCR 仪器中。使用文本方案中的 PCR 条件启动 HRM-PCR 程序。

在 HRM-PCR 反应之后，进行 HRM 分析以确定 CR1 长度多态性，如文本方案中所述。在对具有不同 CR1 亚型的受试者的基因组 DNA 的 PCR 衍生扩增子进行高分辨率熔解后，使用软件分析融合曲线。结果是根据受试者的同种异体 CR1 表达表型区分受试者的曲线。

如归一化和偏移熔炼曲线以及归一化和温度偏移差值图两种表示模式所示，曲线剖面按照 CR1 星 3、CR1 星 1 组、CR1 星 1、CR1 星 2 组、CR1 星 2 组、CR1 星 2 组、 CR1 星 2 组、 CR1 星 2 星分布， CR1 星四组。这些曲线对应于 CR1 长度多态性等位基因。看完这个视频，你应该对如何根据 HRM-PCR 获得的完美曲线轻松地对 CR1 长度多态性进行基因分型有了很好的了解。

通常，由于需要已知 CR1 长度基因型的参考样本，新接触这种方法的个体会很挣扎。掌握后，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住为每个 DNA 样品使用相同的浓度。

按照此程序，可以执行其他方法，如锥形 DNA 测序，以回答其他问题，例如发现新的已知私有 SNP。在此发展之后，该技术为群体遗传学领域的研究铺平了一条道路，以探索 CR1 长度多态性中病原体的选择压力。虽然这种方法可以深入了解阿尔茨海默病发病机制的易感性，但它也可以应用于其他疾病研究，例如系统性红斑狼疮和疟疾。