Name: 肝细胞部分肝切除术后脾移植。小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学习小鼠部分肝切除术后经脾脏移植肝细胞的技术方法。该方案使用NOD.SCID免疫缺陷小鼠模型，为急性肝衰竭的细胞治疗研究提供标准化手术流程和细胞定植评估手段。

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本工作获得了印度政府生物技术部向新德里国家免疫学研究所提供的核心资助。Bhattacharjee 博士目前的单位是洛杉矶儿童医院胃肠病学、肝病学和营养科。

本方案中所述的实验操作已获得印度新德里国家免疫学研究所机构动物伦理委员会的批准，批准文件的序列编号为 IAEC#319/13。
注意：有关普通外科手术的优秀资源20以及啮齿类动物手术的具体操作方案21已有详细记载。对于首次进行动物手术的研究人员，建议在动物实验前先在模型上广泛练习外科操作技术。
1. 准备
<ol>
	<li>实验前准备好无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水。</li>
	<li>准备一套手术器械，包括剪刀、锯齿镊、组织镊、棉球、棉签、尼龙线和不同类型的微针持针器，并对器械进行高压灭菌。若实验方案中涉及免疫缺陷型 NOD.SCID 小鼠，应特别小心。</li>
	<li>从术前准备到手术结束的整个实验过程均应在生物安全一级柜中进行。</li>
	<li>手术前称量一只 6–8 周龄的 NOD.SCID 小鼠体重。本研究使用体重在 14–18 g 之间的小鼠。</li>
	<li>使用毛发修剪器剃除小鼠上腹部中央及季肋区的毛发。用刮刀将脱毛膏均匀涂抹于该区域，彻底清除已剪短的毛发。2–5 分钟后，用一块湿润的无菌棉球轻轻擦去残留毛发。</li>
	<li>将小鼠放入异氟烷麻醉舱，打开氧气瓶阀门。维持氧气流速为 4 L/min，异氟烷挥发浓度为 4%，以诱导麻醉。
	<ol>
		<li>通过轻捏脚趾确认小鼠已充分麻醉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在生物安全柜内放置手术板。将动物置于手术板上，使其腹部朝上，头部前端插入连接异氟烷和氧气供应系统的鼻罩中。</li>
	<li>将异氟烷挥发浓度降至 2%，并在整个手术过程中维持此浓度。</li>
	<li>用浸有 70% 乙醇的无菌棉球擦拭小鼠皮肤，进行皮肤消毒和灭菌。</li>
</ol>
2. 手术步骤
<ol>
	<li>部分肝切除术
	<ol>
		<li>使用直头手术剪在胸骨下方约1 cm处的皮肤上做一横向切口，切口方向垂直于剑突，与肋骨平行。</li>
		<li>用镊子或无菌湿润棉签轻轻分离切口附近与腹肌层相连的皮肤，以区分皮肤与腹肌层。使用无菌棉签将PBS滴加至皮下区域，防止干燥。</li>
		<li>在剑突下方的腹膜层做一横向切口，充分暴露左肝叶。使用两个湿润棉签暴露并轻轻抬起肝脏左叶。</li>
		<li>将一根棉签置于切口腹侧，另一根置于膈肌侧。轻压朝向膈肌的棉签，同时用另一根棉签向滑动方向推动，以抬起肝脏左叶。</li>
		<li>将带环的尼龙线从抬起的左肝叶中穿过，并借助显微镊或棉签将线环滑向靠近肝门的左叶基部。轻轻将尼龙线环推至左叶基部。</li>
		<li>使用显微外科持针器和显微镊在左叶上方打结固定尼龙线两端，并在另一侧再打两个结加固。</li>
		<li>使用剪刀将已结扎的肝叶切除。注意不要紧贴结扎线剪切。若手术操作时间超过5分钟，需定期用无菌PBS湿润腹腔及器官，防止因液体流失导致组织干燥。</li>
		<li>使用4-0肠线连续缝合腹膜。随后尽快使用间断缝合法缝合皮肤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞移植 
	注：表达GFP的肝细胞根据Lee et al.22 和Shen et al.23 描述的方法，从转基因GFP小鼠（C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J）中分离获得。此外，也使用了来源于单核细胞分化的人源肝样细胞（NeoHep）24 进行移植。然而，本方案中也可使用其他来源的细胞。
	<ol>
		<li>将约0.2×10⁶个活细胞悬浮于约50 µL的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）中，吸入配有30G针头的1 mL胰岛素注射器内。将注射器置于冰上保持低温。</li>
		<li>将小鼠摆放成左侧朝上，便于术者操作。确定脾区位置，在季肋区附近横向切开皮肤，随后在腹膜层做一小切口，以暴露脾脏。</li>
		<li>轻轻抬起脾脏，并用两根PBS湿润的棉签将其固定于腹腔外。</li>
		<li>一手用两根棉签小心固定脾脏，另一手持注射器，使针头与脾脏表面完全垂直。轻柔穿刺脾脏，并缓慢将针头推入，深度不得超过2 mm。</li>
		<li>缓慢推动注射器活塞，将细胞注入脾脏。移植完成后，保持针头静止，缓慢拔出，以避免出血或细胞流失。</li>
		<li>用棉签将脾脏放回腹腔后，使用4-0肠线连续缝合腹膜层，并用相同缝线间断缝合皮肤。避免使用伤口夹闭合皮肤，应采用4-0缝线缝合。伤口夹会限制小鼠的自然活动，且常因松动而脱落。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 术后护理
<ol>
	<li>缝合皮肤后，使用无菌棉签蘸取碘溶液（聚维酮碘）擦拭缝合部位周围的区域。</li>
	<li>使用1 mL注射器，按600 mg/kg体重剂量（通常为每只小鼠100 µL生理盐水中含12 mg头孢噻肟）经腹腔注射抗生素头孢噻肟。</li>
	<li>术后最多连续三天，每天经腹腔给予镇痛剂美洛昔康，剂量为1 mg/kg体重（通常为每只小鼠100 µL生理盐水中含12 µg美洛昔康）。</li>
	<li>手术完成后，停止异氟烷气体的供应，并将小鼠放回独立通风的笼具中。</li>
</ol>
4. 安乐死与表征
<ol>
	<li>在实验终点（术后1天和10天），根据机构动物伦理指南对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>通过眼球终末丛穿刺，对动物进行终末放血以采集血液。</li>
	<li>从血液中分离血清。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

部分肝切除术是研究肝脏再生的成熟技术，而大范围肝切除被报道可模拟急性肝衰竭（AHF）模型。在AHF的动物模型中，啮齿类动物尤其是小鼠是最常用的研究模型。为建立小鼠肝损伤模型，已有报道称实施高达70%的肝切除可获得较高的存活率25,26。然而，在裸鼠及其他免疫缺陷小鼠中，70%肝切除被报道具有致死性，动物在24小时内死亡27。
Mitchell 和 Willenbring28 报道了一种在小鼠中可重复且耐受性良好的三分之二部分肝切除方法。对于 NOD.SCID 小鼠，当肝切除范围限制在左肝叶切除（约占总肝质量的 30%）时，我们获得了 100% 的存活率。与裸鼠的观察结果一致27，我们发现，在 NOD.SCID 小鼠中，若肝切除比例进一步增加，将导致存活率显著下降。此外，在 30% 部分肝切除术后 1 天，残余肝叶肝细胞的增殖...

目前，肝细胞移植被认为是一种治疗严重肝病患者的全器官移植替代方案。人们认为，它可作为患者等待全器官移植的过渡手段1。除了同种异体肝细胞2外，异种肝细胞3以及来源于干细胞的肝细胞4也正在动物模型中进行研究。在此背景下，移植细胞在受体体内的归巢能力及植入潜能，是细胞治疗急性肝衰竭（AHF）的重要评价标准。
用于研究肝细胞或类肝细胞的移植5，AHF 在动物模型中通过手术方式建立6 或药理学的7 操作步骤，随后进行细胞移植。通过药理学试剂建立急性肝衰竭（AHF）动物模型时，可使用多种肝毒素，例如d-氨基半乳糖胺8，对乙酰氨基酚9四氯化碳10，硫代乙酰胺11，刀豆蛋白A12脂多糖13, 等等已使用多种试剂。从该列表中，每种试剂均可为急性肝衰竭（AHF）产生一组独特的特征，但遗憾的是，尚无单一试剂能够模拟人类的AHF。此外，由肝毒素诱导的AHF所需时间较长，会使动物长期处于应激状态，且难以获得可重复的结果。
另一方面，部分肝切除术（PHx）的操作依赖于手术技巧，只有在掌握所需技能后才能获得可重复的结果。若仅通过手术干预诱导急性肝功能衰竭（AHF），则需要切除超过70%的肝脏组织；然而，即使肝切除比例低于70%，仍可用于研究移植细胞在肝脏中的植入和增殖情况，以分析其在肝损伤期间的治疗潜力14。肝细胞移植已在肝切除术后通过腹膜15、尾静脉16、肝静脉17或脾脏18等途径进行。目前，肝静脉输注和脾内移植肝细胞是首选方法，因其更易于重复操作。
本文描述了一种在 NOD.SCID（NOD.CB17-Prkdcscid/J）小鼠中进行30%部分肝切除的手术步骤，即切除肝脏左叶。随后，在脾脏中移植 0.2 × 10⁶ 个表达 GFP 的小鼠肝细胞（C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J）以及人源 NeoHep19 细胞。该操作可实现移植细胞在肝脏中的定植。该方法是一种创伤最小、疼痛程度最低的技术。

<table><tbody><tr><td>气体麻醉系统</td><td>Ugo Basile；意大利</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>体重秤</td><td>Goldtech；印度</td><td></td><td>本地采购</td></tr><tr><td>生物安全柜（I级）</td><td>Kartos国际；&amp;nbsp; 印度</td><td></td><td>本地采购</td></tr><tr><td>理发剪</td><td>松下&amp;nbsp; 日本&amp;nbsp;</td><td>ER-GY10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>直柄手术剪，刃口锋利/双锋</td><td>Major Surgicals；印度</td><td></td><td>本地采购</td></tr><tr><td>带锯齿的镊子</td><td>Major Surgicals；印度</td><td></td><td>本地采购</td></tr><tr><td>微针持针器&amp;nbsp; 直的 &amp;和弯曲的&amp;nbsp;</td><td>麦西亚人&amp;nbsp; 英格兰&amp;nbsp;</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 胰岛素注射器，配 30G × 5/16 针头&amp;nbsp;</td><td>一次性运输车；印度</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器配 26 G × 1/2 针头</td><td>BD；美国&amp;nbsp;</td><td>REF 303060</td><td></td></tr><tr><td>尼龙线&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>强大；印度</td><td></td><td>(1-0) 本地采购</td></tr><tr><td>MERSUTURES 4-0 无菌手术缝合针线</td><td>Ethicon, Johnson &amp;amp; Johnson，印度</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>TRUGUT 76 厘米 4-0 可吸收外科缝线</td><td>Sutures India Pvt. Ltd；印度</td><td>SN 5048</td><td>无菌外科缝合针，铬制肠线</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Pure Swabs Pvt Ltd&amp;nbsp; 印度</td><td></td><td>本地采购</td></tr><tr><td>手术胶带</td><td>3M 印度；印度</td><td>1530-1</td><td>微孔手术胶带</td></tr><tr><td>切片机</td><td>意大利 Histo-Line Laboratories</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E 冷冻切片机</td><td>Thermo Electron Corporation；美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>卡尔·蔡司；德国&amp;nbsp;</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>明场显微镜</td><td>日本 Olympus</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>自动分析仪</td><td>郁金香，阿尔托桑特拉克鲁斯，印度</td><td>Screen Maaster 3000</td><td>用于肝功能检测的生化分析仪</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD；美国&amp;nbsp;</td><td>BD FACSverse</td><td>移植后细胞存留情况的评估</td></tr><tr><td>Veet 脱毛膏&amp;nbsp;</td><td>Reckitt Benckiser，印度</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FORANE</td><td>雅培；美国</td><td></td><td>异氟烷 USP 99.9%&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Taxim</td><td>AlKem；印度</td><td></td><td>头孢噻肟钠注射液</td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液&amp;nbsp;</td><td>Win-Medicare&amp;nbsp; 印度</td><td></td><td>聚维酮碘</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Himedia；印度</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）</td><td>Life technologies，Thermo Fisher scientific；美国</td><td>12200-036</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma；美国</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura；美国</td><td>25608-930</td><td>O.C.T. 化合物</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Himedia；印度</td><td>MB 097</td><td></td></tr><tr><td>抗白蛋白山羊多克隆抗体</td><td>赛默飞世尔科技，Pierce，美国</td><td>PA126081</td><td></td></tr><tr><td>抗连接蛋白32/GJB1多克隆抗体</td><td>abcam，英国</td><td>ab64609-500</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP兔多克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz 生物技术公司；美国</td><td>SC 8334</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 驴抗山羊</td><td>&amp;nbsp;Molecular Probes，Thermo Fisher Scientific；&amp;nbsp; 美国</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗羊</td><td>&amp;nbsp;Molecular Probes，Thermo Fisher Scientific；&amp;nbsp; 美国</td><td>A11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 鸡抗兔</td><td>&amp;nbsp;Molecular Probes，Thermo Fisher Scientific；&amp;nbsp; 美国</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG</td><td>Invitrogen，Thermo Fisher Scientific；美国&amp;nbsp;</td><td>65-6120</td><td></td></tr><tr><td>抗Ki67抗体</td><td>abcam，英国</td><td>ab15580</td><td></td></tr><tr><td>抗原修复液，柠檬酸基</td><td>Vector Laboratories，美国</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life technologies，Thermo Fisher scientific；美国</td><td>P36966</td><td></td></tr><tr><td>SGOT（ASAT）试剂盒</td><td>印度珊瑚临床系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGPT（ALAT）试剂盒</td><td>印度珊瑚临床系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶检测试剂盒（DEA）</td><td>印度珊瑚临床系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>迈耶氏苏木精溶液</td><td>Sigma；美国</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>伊红Y醇溶液</td><td>Sigma；美国</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>DPX封片剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma；美国</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>美洛昔（止痛药）</td><td>Intas Pharmaceuticals Ltd；印度</td><td></td><td>美洛昔康注射液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAB增强型液体底物系统四盐酸盐</td><td>Sigma；美国</td><td>D3939</td><td></td></tr></tbody></table>

nod.scid 小鼠部分肝切除术后肝细胞脾内移植

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

部分肝切除术是一种多功能且可重复的方法，可用于研究肝脏再生以及细胞治疗在各种病理条件下的作用。部分肝切除还可通过加速新生血管形成和细胞向肝脏迁移，促进移植细胞的定植和增殖。本文中，我们描述了一种在非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷 NOD.SCID（NOD.CB17-Prkdcscid/J）小鼠脾脏中进行30%肝切除及细胞移植的简单操作方案。
在本操作中，需制作两个小切口。第一个切口用于暴露并切除肝脏左叶，另一个小切口用于暴露脾脏，以便进行细胞的脾内移植。该操作无需特殊的外科手术技能，可在5至7分钟内完成，具有应激和疼痛更小、恢复更快、存活率更高的优点。我们已成功在部分肝切除的NOD.SCID小鼠中，移植了来源于表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠（转基因C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J）的肝细胞，以及人源类肝细胞（NeoHep）。

30% 肝部分切除术后肝细胞增殖：通过细胞增殖标志物 Ki-67 的免疫组织化学（IHC）染色，检测小鼠 30% 肝部分切除术后残余肝脏中肝细胞的增殖情况。术后第 1 天处死小鼠，切除残余肝叶并制备石蜡切片。切片经 Ki-67 抗体孵育后，使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗进行显色，以二氨基联苯胺（DAB）作为 HRP 的底物产生棕色信号以识别阳性染色细胞。细胞核使用苏木精复染，并在 20X 物镜下观察。图 1 显示了肝脏切片的代表性 IHC 图像。约 13% 的细胞（13.66 ± 0.317，N=3）呈 Ki-67 阳性，证实 30% 肝部分切除可促进小鼠肝脏中肝细胞的增殖。
解剖学研究：显示了NOD.SCID小鼠肝切除术后10天的肝脏代表性图像（见图2）。该图像证实，残留肝脏健康，无可见异常。
手术后第一小时内移植细...

我们描述了一种在NOD.SCID（NOD.CB17-Prkdcscid/J）小鼠中进行部分肝切除术（PHx）并通过脾脏移植细胞的实验方案。该方案中，首先进行切口以暴露并切除肝脏左叶，随后另作切口，用于将细胞移植至脾脏内。

NOD.SCID 小鼠部分肝切除术后肝细胞脾内移植

部分肝切除术是一种多功能且可重复的方法，用于研究肝脏再生以及细胞治疗在多种病理条件下的作用……

对于急性肝功能衰竭患者，肝细胞移植是全器官移植的一种替代治疗方案。部分肝切除术被用作建立急性肝功能衰竭（AHF）的实验技术，此外，该方法也用于研究基于细胞治疗过程中的细胞植入与增殖情况。小鼠是实现上述目标的肝切除研究中最常用的模型之一。在本视频中，我们将展示一种部分肝切除术的操作流程，随后在NOD.SCID小鼠的脾脏中进行肝细胞移植。开始实验前，请确保已获得相关动物伦理委员会的必要批准。在本操作中，我们将进行两个小切口。第一个切口用于部分肝切除术，切口长度约为一厘米，位于剑突下方，以暴露肝脏。移植细胞时，需在动物左侧腹部另做一个较小的切口，以暴露脾脏。该方法的优点在于对动物造成的创伤和疼痛更小，恢复更快，且存活率接近百分之百。此外，该手术无需特殊的外科操作技能，可在5至7分钟内快速完成。在本视频中，我们将演示将类肝细胞（称为 NeoHep）以及从转基因 GFP 小鼠中分离的肝细胞移植到部分肝切除的 NOD.SCID 小鼠体内的过程。该操作不限制移植细胞的类型。所有手术器械和 PBS 均已进行高压灭菌处理，并在手术前准备就绪。称量小鼠。本实验选用 6 至 8 周龄、体重在 14 至 18 克之间的 NOD. SCID 小鼠。剃除小鼠腹部中央、上部及左侧区域的毛发。为清除剪下的毛发，在剃毛区域涂抹脱毛膏，等待四到五分钟，然后轻轻去除毛发。打开氧气钢瓶阀门。将小鼠放入异氟烷麻醉室。调节氧气流速至每分钟4升。将异氟烷蒸发器调节至4%以诱导麻醉。通过轻捏小鼠脚趾确认其已充分麻醉。在生物安全柜内放置手术板。将动物置于手术板上，使小鼠腹面朝上，头部前端置于连接异氟烷和氧气供应的鼻罩内。将异氟烷挥发浓度降至2%以维持麻醉状态。用浸有70%乙醇的无菌棉球擦拭皮肤进行消毒。在胸骨下方、剑突下方约一厘米处，沿与肋骨平行的方向做一横向切口，切开皮肤。轻轻分离切口附近的皮肤和腹膜。在剑突下方的腹膜层做一横向切口，以暴露肝脏左叶。使用两个湿润的棉签。将其中一个棉签置于切口的腹侧，另一个棉签置于膈肌侧。然后轻轻按压朝向膈肌侧的棉签，并用另一棉签轻轻滑动推压，以抬起肝脏左叶。用显微解剖镊子将一段丝线环置于左外侧肝叶基部靠近肝门的位置。轻轻收紧结后，尽可能将丝线向肝叶基部滑动。拉紧结扎线，并在另一侧再打两个附加结。使用显微手术剪剪断结扎的肺叶。此图像显示切除后左侧肺叶的剩余部分。用4-0可吸收肠线连续缝合腹膜。使用同一种4-0号可吸收肠线，通过间断缝合方式缝合皮肤。在缝合处周围涂抹碘伏。将肝细胞或NeoHep悬浮于已准备好的1 mL胰岛素注射器中的50 µL IMDM培养基中，注射器配备29号针头。将小鼠放置，使其左侧朝上。确定脾脏区域，横向切开皮肤。在腹膜层做2至3毫米的切口，以暴露脾脏。将脾脏置于两根湿润的棉签之间并轻轻抬起。用针头轻轻刺入脾脏皮质，将细胞悬液注入脾脏内。使用4-0缝线连续缝合腹膜，并用间断缝合关闭皮肤。在缝线上涂抹碘伏。腹腔内注射含有12毫克抗生素头孢噻肟的100微升生理盐水。腹腔内注射含有12微克镇痛药美洛昔康的100微升生理盐水。术后每日给药一次，连续三天。关闭异氟烷挥发罐，将小鼠放入笼中。动物将在数秒内恢复意识。通过 Ki-67 免疫组织化学染色检测肝脏在切除 30% 后 24 小时内肝细胞的增殖情况，Ki-67 是一种细胞增殖标志物。染色时使用抗 Ki-67 辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测，并以二氨基联苯胺作为底物显色，产生棕色信号。细胞核采用苏木精复染。在此图像中，呈棕色的细胞为 Ki-67 阳性的增殖性肝细胞。移植后第10天，处死小鼠并检查肝脏。此处显示一幅代表性图像。从再生肝脏中切除右外侧叶、右内侧叶和左内侧叶，并制备5微米切片。这些切片使用兔多克隆抗GFP一抗和Alexa Fluor 594标记的抗兔二抗进行染色。细胞核用DAPI复染。此图像显示表达绿色荧光蛋白的肝细胞的归巢现象，该蛋白在图像中呈现为红色。当将一种名为NeoHep的人源类肝细胞移植后，我们在受体肝切除小鼠的肝组织切片中检测到人白蛋白（human Albumin）和人连接蛋白32（human Connexin 32）的表达。术后十天，对血清中肝脏分泌的酶进行生化分析，结果证实天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase）以及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）的水平已恢复至正常范围。同样，通过苏木精和伊红染色对肝脏切片进行组织学检查，术后十天未发现异常，表明肝脏恢复良好。需要注意采取一些预防措施。尽量将尼龙线的结置于肝叶基部。切勿忘记在对侧再打两个牢固的结，且不要试图将线头剪得过于靠近结处。将细胞移植到脾脏时，应将针头垂直刺入，深度不得超过两毫米。缝合皮肤时应避免使用伤口夹。改为使用4-0缝线进行缝合。伤口夹会限制小鼠的自然活动，且常常很快松动脱落。将动物放回笼子后，可在笼内放置几片无菌玉米片，并提供含有5%葡萄糖的无菌水。如果您此前无动物手术经验，应先在免疫功能正常的正常小鼠中单独练习部分肝脏肝切除术和移植术，然后在同一只动物中同时进行这两项操作。只有在免疫功能正常小鼠中达到100%存活率后，才可在免疫缺陷型NOD.SCID小鼠中实施这些操作。

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肝细胞部分肝切除术后脾移植。小鼠

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NOD.SCID 小鼠部分肝切除术后肝细胞脾内移植

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