患者胶质母细胞瘤切除中细胞微环境的定量免疫组织化学
2017年7月31日
该方案被开发用于使用显色免疫组织化学和ImageJ定量鉴定成胶质细胞瘤患者切除中的肿瘤微环境成分。
该方案的总体目标是使用显色免疫组织化学和图像 J 定量鉴定胶质母细胞瘤患者切除中的肿瘤微环境成分，该方法可以帮助回答肿瘤微环境领域的关键问题，例如这些成分在患者样本中的外观以及我们如何确定生理相关的细胞比例。该技术的主要优点是它可以直接分析患者样本。这项技术的影响延伸到阐明表征不足的复杂胶质母细胞瘤肿瘤微环境。
一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为需要密切监测显色的时间，以防止组织过度发育和饱和。通过执行随附文本 protocol 中指定的洗涤来开始实验方案。使用制造商的建议稀释基于 tris 的高 pH 抗原修复溶液和蒸馏水。
通过将稀释的揭开掩蔽溶液添加到非密封的可微波容器中，继续进行热介导的抗原修复。将玻片放入容器中。然后将容器玻片放入微波炉中。
接下来，将容器以高功率煮沸 20 分钟。监测液位是否蒸发，并根据需要向容器中补充蒸馏水。让样品在室温下在溶液中冷却 1 小时。
用疏水剂勾勒出组织样品的轮廓，以尽量减少覆盖样品所需的试剂体积。然后，加入足够的透化溶液，100 至 200 μL 以覆盖组织样品。取出并丢弃溶液，并再次用透化溶液覆盖组织样品。
将样品在室温下与封闭溶液一起孵育 1 小时。然后，将样品在 4 摄氏度下与用封闭溶液稀释的一抗一起孵育过夜。第二天，使用与一抗宿主动物对应的辣根过氧化物酶聚合物试剂检测一抗。
加入足够的透化溶液以覆盖组织样品，并将样品孵育 5 分钟。取出并丢弃溶液，在透化溶液中再覆盖组织样品一次，持续 5 分钟。将玻片在 0.3% 过氧化氢和 IX TBS 中孵育 15 分钟。
使用过氧化物酶二氨基联苯胺或 dab 底物显影样品 2 至 10 分钟，直至达到所需的染色强度。对样品进行复染以识别细胞核，例如按照制造商方案使用苏木精。用 100% 乙醇和二甲苯脱水样品。
最后，使用封固剂永久封固样品。我们的肿瘤切除中两个感兴趣的区域，原发肿瘤块和相邻区域，主要由健康组织和弥漫性侵袭癌细胞组成，由合作的神经病理学家在苏木精和伊红染色的患者样本上确定。显色免疫组化发现每个患者样本中星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞呈阳性染色。
我们对阴性对照进行了无一抗的染色。制造商建议在确定 1 到 200 稀释之前进一步稀释，因为细胞体和工艺的阳性染色效果最佳，抗 ALDH 1l1 抗体的背景最小。使用图像 J，量化 OSP-1 阳性少突胶质细胞染色的覆盖率百分比，以最终比较我们感兴趣区域的差异。
一旦将适当的阈值应用于图像，就可以测量和比较多个患者的阈值覆盖率。比较胶质母细胞瘤或 GBM 患者样本的 5 个相邻和大部分区域以及健康脑组织的少突胶质细胞特异性蛋白 1 或 OSP1% 覆盖率。一旦掌握了染色技术，如果作得当，第一天可以在四个小时内完成，第二天可以在第二天两个小时内完成。
在尝试此程序时，请务必记住密切监测组织染色强度和水合作用。
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概览
该协议描述了一种方法，用于使用显色免疫组化和ImageJ定量识别脑胶质瘤患者切除组织中的肿瘤微环境成分。该技术旨在提供对复杂的脑胶质瘤肿瘤微环境的洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 组织学
背景
- 脑胶质瘤是一种高度侵袭性的脑肿瘤。
- 肿瘤微环境在肿瘤进展中起着至关重要的作用。
- 了解这种环境的组成对于开发靶向治疗至关重要。
- 显色免疫组化允许详细可视化组织成分。
研究目的
- 定量评估脑胶质瘤样本中的肿瘤微环境。
- 确定不同细胞类型的生理学相关比例。
- 为患者样本提供一种简单的分析方法。
使用的方法
- 用于组织染色的显色免疫组化。
- 用于定量分析的ImageJ软件。
- 根据制造商建议的洗涤和抗原解掩剂协议。
- 仔细监测显色发展的时间。
主要结果
- 成功识别了各种肿瘤微环境成分。
- 建立了确定脑胶质瘤样本中细胞比例的方法。
- 对脑胶质瘤微环境的复杂性有了深入了解。
- 证明了该方法适用于患者样本。
结论
- 该协议提供了一种研究脑胶质瘤微环境的可靠方法。
- 它有助于理解肿瘤微环境内的相互作用。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上改进脑胶质瘤的治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of the tumor microenvironment in patient-derived glioblastoma samples enables mechanistic de-risking of glial cell targets in neuro-oncology drug discovery. By providing reproducible, region-specific measurements of astrocytes, microglia, and oligodendrocytes, this method supports target validation and phenotypic screening in disease-relevant systems. It enhances predictive confidence in preclinical models by linking microenvironment composition to therapeutic response and resistance mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glial cell phenotypes and their functional states within heterogeneous tumor regions.
- Operational Value: Provides quantitative, image-based readouts for assessing target engagement and microenvironment modulation.
- Predictive Value: Supports biomarker-aligned target selection by correlating glial abundance with pathological gradients in patient samples.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized immunohistochemistry protocols compatible with high-throughput imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Delivers percent coverage metrics via ImageJ that enable inter-sample and inter-region comparisons.
- Reproducibility: Defines critical timing controls for chromogenic development to ensure signal specificity and minimize background noise.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses actual patient resection samples to maintain pathophysiological fidelity in target validation studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical models by defining quantitative benchmarks for glial cell composition.
- Risk Mitigation: Reduces biological de-risking uncertainty in glial-targeted therapies by characterizing microenvironmental context.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for neuro-oncology programs focused on microenvironment modulation.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by enabling spatial and quantitative profiling of glial populations in human tissue.
- Screening: Generates standardized, quantifiable staining patterns that can be used to evaluate compound effects on microenvironmental composition.
- Analytics: Provides threshold-based percent coverage measurements that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by linking glial cell densities to histopathological regions of interest.
- Enterprise Reuse: Establishes a transferable IHC/ImageJ workflow applicable across glioma and other CNS tumor models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence through quantitative, spatially resolved glial cell analysis in patient samples.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized antigen retrieval, blocking, and development timing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing ambiguity in target microenvironment interactions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of glial-modulating therapeutics based on microenvironmental engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry and neuropathological sample handling.
- Dependent on optimized chromogenic development timing to avoid signal saturation.
- Necessitates standardized ImageJ thresholding protocols for consistent quantification.
- Requires access to patient-derived glioblastoma resection samples with annotated regions of interest.
- Limited by tissue heterogeneity and the need for region-specific analysis to avoid confounding signals.
