患者胶质母细胞瘤切除组织中细胞微环境的定量免疫组织化学分析

本方案的总体目标是利用显色免疫组织化学法和ImageJ对胶质母细胞瘤患者切除样本中的肿瘤微环境组分进行定量鉴定。该方法有助于回答肿瘤微环境研究领域中的关键问题，例如这些组分在患者样本中的形态特征以及如何确定具有生理相关性的细胞比例。该技术的主要优势在于其对患者样本的分析操作简便。该技术的应用意义在于有助于阐明目前尚未充分表征的复杂胶质母细胞瘤肿瘤微环境。

通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为显色反应的时间需要密切监控，以防止组织过度显色和信号饱和。首先按照随附文本方案中指定的步骤进行洗涤操作。根据生产商的建议，用蒸馏水稀释基于Tris的高pH抗原修复液。

继续进行热介导抗原修复，将稀释的抗原修复液加入一个非密封的可微波容器中。将切片放入容器内，然后将装有切片的容器放入微波炉中。

接下来，将容器在高功率下煮沸20分钟。监测液体蒸发情况，并根据需要补充蒸馏水。让样品在溶液中于室温下冷却1小时。

使用疏水笔勾画组织样本轮廓，以尽量减少覆盖样本所需的试剂体积。然后加入足够的通透化溶液，用量为 100 至 200 微升，以覆盖组织样本。移除并弃去溶液，再用通透化溶液重新覆盖组织样本。

将样本在室温下用封闭液孵育一小时。然后，在4 °C下用封闭液稀释的一抗溶液对样本孵育过夜。次日，使用与一抗宿主动物对应的辣根过氧化物酶聚合物试剂检测一抗。

加入足量的通透化溶液以完全覆盖组织样本，孵育5分钟。移除并弃去溶液，再次用通透化溶液覆盖组织样本，继续孵育5分钟。将载玻片置于0.3%过氧化氢和1× TBS中，孵育15分钟。

使用过氧化物酶二氨基联苯胺（DAB）底物显色2至10分钟，直至达到理想的染色强度。用核染色剂（如苏木精）对样本进行复染，以识别细胞核，具体操作遵循制造商说明书。使用100%乙醇和二甲苯对样本进行脱水。

最后，使用封片介质对样本进行永久封片。经合作神经病理学家对苏木精-伊红染色的患者样本进行评估，确定了肿瘤切除组织中的两个感兴趣区域：主肿瘤区（Bulk）和邻近区域（Adjacent），后者主要由健康组织构成，并含有弥散性浸润的癌细胞。通过显色免疫组织化学染色，在每位患者的样本中均检测到星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞呈阳性染色。

我们进行了不加一抗的染色作为阴性对照。根据制造商建议，经过进一步稀释后，最终确定抗 ALDH1L1 抗体以 1:200 的比例稀释，可实现细胞体和突起的最佳阳性染色，同时将背景信号降至最低。使用 Image J 对 OSP-1 阳性少突胶质细胞染色的覆盖百分比进行定量，以最终比较我们感兴趣区域之间的差异。

对图像应用适当的阈值后，可测量并比较多位患者的阈值覆盖百分比。比较了五例相邻区域和大体区域的胶质母细胞瘤（GBM）患者样本以及健康脑组织中少突胶质细胞特异性蛋白1（OSP1）的覆盖百分比。掌握该染色技术后，若操作得当，第一天可在四小时内完成，第二天则需两小时。

进行该操作时，需密切注意组织染色强度与水合状态。