应用一种适应微流控嗅觉芯片的神经活性成像对雄性线虫神经元的信息素反应
2017年9月7日
在这里描述了使用一个适应的 "嗅觉芯片" 的有效钙显像的C. 线虫男性。还显示了男性接触甘油和信息素的研究。
该程序的总体目标是在暴露于信息素时有效地捕获雄性秀丽隐杆线虫头部神经元中的图像钙瞬时。这种方法可以帮助回答神经生物学领域的关键问题，例如理解性别特异性神经回路调节。该技术的主要优点是雄性秀丽隐杆线虫现在可以在微流体陷阱装置中高效成像。
一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为一开始加载动物可能很困难，而且生物信息素不会在每只动物身上引起钙的短暂性。要开始组装储液槽，请准备三组管路，将针头插入一端，将金属管插入另一端。然后，对于每个储液槽，取一个三通鲁尔阀，并连接一个 30 毫升注射器（去除柱塞）、一个 3 毫升注射器和管道。
用适当的缓冲液填充每个储液器，刺激 S 基础或含有荧光素的 S 基础。然后，通过轻弹并泵送注射器，去除储液槽和管路上的任何气泡。现在，用 S 基础填充新的 3 毫升注射器和管道，然后插入微流体装置的出口。
轻轻地对注射器施加一点压力，直到缓冲液出现在入口孔的表面。接下来，将流量控制管、缓冲液管和刺激储液管连接到适当的入口孔，确保上样端口孔和要连接的管路上都有液滴。现在，轻轻地对注射器施加一点压力，直到液滴出现在蠕虫装载口入口处，然后将实心阻塞针插入该端口。
接下来，从出口取出注射器，并连接连接到真空室的出口管线。现在，检查设备在显微镜视频馈送中的浮子通道中是否有任何气泡。单击实时，观察实时图像并等待气泡自然消散后再继续。
接下来，打开荧光光源并使用 GFP 过滤器确认正确的流动动力学。当阀门打开时，启动三波阀并观察荧光控制流出现在视频源中。首先，在未播种的 NGM 琼脂平板上挑选一条蠕虫，让蠕虫爬走。
然后，用 S 基底漂浮板。将含有蠕虫的溶液吸入注射器中。现在，在设备上，使用出口鲁尔阀关闭真空以停止流动。
然后，移除阻塞蠕虫装载端口的实心销。将含有蠕虫的管路插入加载端口。打开出口鲁尔阀并观察实时视频源。
现在，轻轻按压注射器，直到蠕虫出现。如果蠕虫先进入尾巴，则将其向后拉，它必须先进入头部才能暴露在刺激下。用户必须在尾部完全进入通道之前将蠕虫拉回，否则，将蠕虫从通道中取出非常困难，通常需要通过通道完全冲洗蠕虫并加载新的蠕虫。
现在，利用注射器的压力，将蠕虫推进通过通道并定位蠕虫的头部，使其暴露在缓冲流中，但不要太深入通道，以便它可以自由移动。预计非瘫痪动物会有少量的轴向或旋转运动。尽管在缓冲液中添加麻痹剂几乎消除了这种影响。
为了减少试验期间移动的可能性，请使用更有效捕获的老年雄性，减少蠕虫加载口的宽度或厚度或增加在麻痹剂中花费的时间。使用该软件使用蓝光激发进行录音。将曝光设置为 100 毫秒，打开图像采集窗口，将时间点设置为 300，间隔为零，然后开始图像采集。
五秒钟后，通过更换控制缓冲液的三通阀来施加刺激。10 秒的刺激是一个很好的起点，刺激的长度可以根据需要进行调整。刺激后，再次按下按钮将流量切换回去，然后继续录制，直到 30 秒的视频完成。
这允许 g camp 荧光返回到基线。现在，让准备工作休息 30 秒，然后再进行下一次试验。在无敏感神经元 ASH 中表达 g camp 3 的蠕虫对一种磨牙甘油做出反应，ASH 神经元内的荧光发生可见变化，表明神经活动。
神经元应在整个视频的分析区域内，否则可能会出现运动伪影。如果是这样，请移动这些时间点的分析区域并合并强度值以创建单个跟踪。在暴露期间受到有吸引力的生物信息素蛔虫苷 3 刺激的男性，在 4 个 CEM 神经元中测量钙瞬变。
从动物到动物，从神经元到神经元，痕迹的形状、符号和大小各不相同。因此，在研究信息素反应时分析许多动物非常重要。看完这个视频后，你应该对如何将雄性秀丽隐杆线虫加载到微流体装置中并分析头部神经元中的钙瞬时有一个很好的了解。
相同的过程可以用于雌雄同体，以识别神经反应中的 sec 特异性差异。一旦掌握，这项技术可以在半小时内为第一个成像的动物完成。第一次记录后，可以在大约 10 分钟内将新动物加载到图像中。
按照此程序，可以将光遗传学等其他方法与该协议相结合，以进一步了解神经回路是如何调节的。
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概述
本文描述了一种适用于秀丽隐杆蚋雄性高效钙成像的改良“嗅觉芯片”，特别是在甘油和信息素的反应中。该方法增强了对神经生物学中性别特异性神经回路调节的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经生物学
- 钙成像
- 行为分析
背景
- 秀丽隐杆蚋作为研究神经元功能的重要模型生物。
- 钙成像允许实时观察神经回路。
- 对刺激的性别特异性反应提供了对神经回路动力学的洞察。
- 高效的捕获技术增强了活体制备的成像能力。
研究目的
- 开发一种成像雄性秀丽隐杆蚋头部神经元钙瞬变的技术。
- 探索雄性如何响应生物信息素和其他刺激。
- 提供对性别特异性神经回路调节的新见解。
所用方法
- 使用微流体装置捕获和成像秀丽隐杆蚋。
- 以雄性秀丽隐杆蚋为生物模型来评估神经反应。
- 使用荧光蛋白进行钙成像以可视化神经元活动。
- 关键步骤包括仔细加载蠕虫和控制成像过程中的流体流动。
- 该过程允许随后在约10分钟内成像新的动物。
主要结果
- 在信息素暴露时观察到ASH神经元和四个CEM神经元的钙瞬变。
- 反应在形状和幅度上存在差异，表明神经反应的个体差异。
- 该方法显示出理解神经回路对信息素反应的潜力。
- 证明了以最小运动伪影成像神经活动的可行性。
结论
- 本研究建立了一种雄性秀丽隐杆蚋神经元活动实时成像的方法。
- 该技术可以适应于研究性别特异性神经机制。
- 这种方法增强了对神经元对化学刺激反应的理解及其对神经回路调节的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
This microfluidic olfactory chip enables efficient calcium imaging in male C. elegans, addressing a key gap in sex-specific neurobiology research. By allowing real-time imaging of neuronal responses to pheromones, the method supports mechanistic de-risking in target validation for neuroactive compounds. The approach provides predictive value in early discovery by clarifying sex-dimorphic neural circuit regulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of sex-specific neural circuits in response to pheromonal stimuli.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for trapping and imaging male C. elegans head neurons.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of sex-dimorphic mechanisms in neuroactive compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated neuronal systems for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables standardized, quantitative calcium transient measurements in defined neuronal populations.
- Assay Readiness: Supports scalable imaging workflows with minimal movement artifacts after initial training.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase neural imaging to preclinical continuity via sex-specific biomarker alignment.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in sex-specific neural responses to chemical stimuli.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by revealing variable response patterns across individuals.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for neuroactive compounds requiring sex-specific efficacy profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of sex-specific neural circuit regulation through controlled pheromone exposure.
- Screening: Delivers assay-ready neuronal preparations with reproducible stimulus delivery and calcium readouts.
- Analytics: Enables quantitative analysis of calcium transients in ASH and CEM neurons using ImageJ for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by providing sex-stratified neural response data relevant to biomarker development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic platform for rapid turnover of male C. elegans imaging, reducing per-animal preparation time after initial training.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving sex-specific neural signaling mechanisms.
- Operational Value: Standardizes worm loading and imaging procedures, improving throughput and reducing variability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing sex-dimorphic neural responses that may predict differential compound efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroactive compounds based on sex-specific neural activity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device assembly, worm handling, and calcium imaging techniques.
- Depends on access to fluorescence microscopy, syringe pumps, and vacuum control systems for fluid regulation.
- Necessitates standardization across teams for consistent worm loading orientation and stimulus timing.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to hermaphrodites or other neuronal strains.
- Includes practical limitations such as variable pheromone response rates and initial learning curve for worm loading efficiency.
