使用改良的微流控嗅觉芯片对雄性 C. Elegans 头部神经元中信息素诱导的神经元活动进行成像

本实验的总体目标是，在暴露于信息素后，高效捕获雄性秀丽隐杆线虫（C. Elegans）头部神经元中的钙离子瞬时成像信号。该方法有助于解答神经生物学领域的一些关键问题，例如理解性别特异性的神经回路调控机制。该技术的主要优势在于，现在可以利用微流控捕获装置高效地对雄性秀丽隐杆线虫进行成像。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为最初装载动物较为困难，且生物信息素并非在每只动物中都能引发钙瞬变。开始组装储液槽时，通过在一端插入针头、另一端插入金属管的方式，制备三套导管。然后，对于每个储液槽，取一个三通鲁尔阀，连接一支已移除活塞的30毫升注射器、一支3毫升注射器以及导管。

向每个储液池中加入适当的缓冲液，可以是刺激剂S基础液，也可以是含有荧光素的S基础液。然后通过轻弹和推动注射器的方式，去除储液池和管路中的任何气泡。接着，用新的三毫升注射器和管路吸入S基础液，并将其插入微流控装置的出口端口。

轻轻按压注射器，直至缓冲液出现在入口孔的表面。接下来，将流体控制管、缓冲液管和刺激液储液管连接到相应的入口孔，确保加样口孔和待连接的管路末端均存在液滴。然后，再次轻轻增加注射器的压力，直至线虫加样口入口处出现液滴，随即在此端口插入一根实心阻塞针。

接下来，将注射器从出口端口取下，并连接一条通向真空系统的出口管路。现在，通过显微镜的视频画面检查装置中浮子通道是否存在任何气泡。点击“实时”按钮，观察实时图像，并等待气泡自然消散后再继续操作。

接下来，打开荧光光源，使用 GFP 滤光片确认流动状态是否正常。启动三波阀，并在阀门打开时，通过视频画面观察荧光控制流的出现情况。实验开始时，挑选一条线虫转移到未接种的 NGM 琼脂平板上，让线虫爬行离开。

然后，用 S 基础培养基漂洗平板。将含有线虫的溶液吸入注射器中。接着，在装置上关闭真空，通过出口鲁尔阀停止液体流动。

然后，移除阻塞线虫加载口的固体针。将含有线虫的管子插入加载口。打开出口鲁尔阀，并观察实时视频画面。

现在，轻轻按压注射器，直到线虫出现。如果线虫尾部先进入通道，需将其拉回，必须确保线虫头部先进入，才能使其受到刺激。操作者必须在尾部完全进入通道前将其拉回，否则将线虫从通道中取出会极为困难，通常需要将线虫完全冲出通道，并重新装入一条新的线虫。

现在，利用注射器的压力将线虫推过通道，并调整线虫头部位置，使其暴露于缓冲液流中，但不可深入通道内，以免其自由移动。在未麻痹的动物中，可观察到少量的轴向或旋转运动。尽管在缓冲液中加入麻痹剂可几乎完全消除这种效应。

为了降低实验过程中发生移动的可能性，应使用更易被捕获的成年雄性线虫，或减小线虫加样口的宽度或厚度，或延长麻痹处理的时间。使用软件进行蓝光激发下的图像记录。将曝光时间设为100毫秒，打开图像采集窗口，设置时间点为300个，时间间隔为0，然后开始图像采集。

五秒后，通过切换控制缓冲液的三通阀施加刺激。建议初始刺激时长为10秒，可根据需要调整刺激持续时间。刺激结束后，再次按下按钮切换回原流路，并继续记录，直至30秒视频采集完成。

这使得g camp荧光恢复至基线水平。现在，让标本静置30秒后再进行下一次试验。在AS希神经元（ASH）中表达g camp 3的线虫，对1摩尔甘油产生反应，在ASH神经元内出现荧光的明显变化，表明神经活动的发生。

神经元应在整个视频中保持在分析区域内，否则可能会产生运动伪影。如果发生此情况，应移动这些时间点的分析区域，并合并强度值以生成单条轨迹。在暴露期间用具有吸引力的生物源性信息素ascaroside three刺激雄性个体后，测量了其四个CEM神经元中的钙瞬变。

从动物到动物、从神经元到神经元，信号轨迹在形态、方向和幅度上各不相同。因此，在研究信息素反应时，分析大量动物样本非常重要。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将雄性秀丽隐杆线虫装入微流控装置，并分析其头部神经元中的钙瞬变。

该方法同样可用于雌雄同体生物，以鉴定 sec 特异性的神经反应差异。掌握该技术后，首只成像动物的实验可在半小时内完成。首次记录完成后，每更换一只新动物并进行成像约需 10 分钟。

通过该操作步骤，可将光遗传学等其他方法与本方案相结合，以进一步理解神经回路的调控机制。