Name: 应用一种适应微流控嗅觉芯片的神经活性成像对雄性线虫神经元的信息素反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学习利用微流控嗅觉芯片对雄性秀丽隐杆线虫进行钙成像，以研究信息素诱导的神经元活动。该方法可实时观测ASH和CEM神经元的钙信号变化，揭示性别特异性神经环路调控机制。

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我们感谢Manuel Zimmer提供了最初的设计文件，并将其改进用于雄性样本；感谢Frank Schroeder合成了ascr#3并提供该化合物；感谢Ross Lagoy在成像与分析方面的见解和协助；感谢Laura Aurilio完成了主模具的制备，并与Christopher Chute共同参与了本文稿的审阅。本研究的资助来自美国国立卫生研究院基金1R01DC016058-01（J.S.）、美国国家科学基金会基金CBET 1605679（D.R.A.）以及Burroughs Wellcome在科学交叉领域授予的职业奖（D.R.A.）。

1. 器件制备
注意：参见参考文献1。
注意：硅胶母模采用标准的光刻技术制备，用于在硅基底上对 SU-8 光刻胶进行图形化1,7。晶圆图形化的掩膜版以 25,000 dpi 打印。该雄性适配装置采用了 Chronis 嗅觉芯片设计19，并对线虫加载口进行了修改，该设计源自 M. Zimmer（个人通讯，2016 年）。装置中包含一个弯道结构，用于控制动物的旋转方向。线虫加载口通道的宽度收窄至 50 μm。所有通道的高度均为 32 μm。一旦用户获得硅胶母模，即可按照此前所述的后续操作步骤进行实验1。
<ol>
	<li>按重量比10:1混合PDMS基础剂与固化剂。</li>
	<li>使用移液管充分混合。</li>
	<li>将混合物置于真空干燥器中脱气1小时，直至所有可见气泡完全消除。</li>
	<li>将混合物倒入直径为150 mm的培养皿中的硅胶模具母版上，使其厚度达到5 mm（约100 g）。使用巴斯德移液管除去混入混合物中的气泡或灰尘。</li>
	<li>在65 °C下烘烤至少3小时，或过夜。</li>
	<li>使用解剖刀将PDMS从模具上剥离，并用剃刀片将各个器件分离开。</li>
	<li>使用1 mm皮肤打孔器打出入液口和出液口孔。</li>
	<li>依次用dH2O、乙醇、再用dH2O冲洗孔道，以去除打孔过程中产生的颗粒物。用脉冲气流将器件吹干。</li>
	<li>用胶带清洁器件的两个通道面及顶部表面，去除残留的灰尘或碎屑，以确保后续键合成功。</li>
	<li>将器件（通道面朝下）通过等离子体键合至1号盖玻片上。
	<ol>
		<li>将盖玻片和器件（通道面朝上）置于空气中进行等离子体处理，采用可实现良好键合的条件，例如100 W处理30秒，或24 W处理60秒。 
		注意：可调整参数以提高键合效率。在提升键合效率时，等离子体处理条件的重要性低于充分清洁。若器件清洁不充分，即使在理想的等离子体条件下也无法实现键合。</li>
		<li>将盖玻片翻转并贴合至器件的通道面，用拇指按压5秒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 缓冲液的配制
<ol>
	<li>用无菌的10倍浓缩S基础培养基（100 mM NaCl 和 0.05 M KPO4，pH 6.0）稀释配制1倍S基础培养基。</li>
	<li>将1 M 四咪唑储备液稀释至所有缓冲溶液中终浓度为1 mM（溶于1倍S基础培养基）。</li>
	<li>向“流体控制”和“缓冲液”储液池中加入荧光素。
	<ol>
		<li>用1倍S基础培养基配制100 mg/mL的荧光素储备液。</li>
		<li>将储备液稀释至“流体控制”通道中终浓度为1 µg/mL，缓冲液通道中终浓度为0.1 µg/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备刺激物。
	<ol>
		<li>将甘油稀释至1倍S基础培养基中终浓度为1 M。</li>
		<li>将ascaroside #3（ascr#3）稀释至1倍S基础培养基中终浓度为1 µM。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 设备设置
注：参见1。
<img alt="线虫实验用微流控装置设置，包括注射器、阀门和缓冲液流速控制。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 微流控装置设置。（A）储液槽与管路。一个30 mL无活塞的注射器作为“储液槽”，连接至一个具有三种流路选择的鲁尔阀。其中一个出口连接一个带活塞的3 mL注射器，另一个出口连接一根针头（橙色），该针头插入连接至微流控装置的管路中。（B）微流控成像实验的整体设置。该装置放置在倒置落射荧光显微镜的载物台上，位于物镜上方。“流速控制”缓冲液通过一个三通阀，该阀由装置上方架子上的控制单元调节。含有缓冲液的管路随后插入微流控装置相应的端口。（C）微流控装置的端口。“流速控制”端口位于其他入口端口的两侧，即“刺激”端口和“缓冲液”端口。“出口”端口位于最右侧。由于线虫加样区域的位置，“线虫加样”端口位于装置最中央的位置。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>通过将一个30或60 mL注射器连接至三通鲁尔阀，并将一个3 mL注射器和针头也连接至该鲁尔阀，制备三个液体储液装置（如图所示） 图1A）。将针头连接至延伸至微流控装置的管路（如 图1A- B).</li>
	<li>去除储液槽和管路中的气泡。</li>
	<li>用1× S缓冲液填充带有连接管的3 mL注射器，并将其插入出口端口。</li>
	<li>轻轻按压注射器，直至缓冲液出现在进样孔的顶部。</li>
	<li>将流量控制管、缓冲液管和刺激液管连接至相应的进样孔（如 图1B- C），确保加样口孔和待连接的缓冲液管路两端均有液滴存在。</li>
	<li>再次轻轻按压连接在出口端口的注射器，直至蠕虫加样口的入口处出现液滴。</li>
	<li>将实心阻断针插入线虫加样口。</li>
	<li>将注射器从出口端口取下，并连接通往实验室真空系统（-670 Torr）的出口管路。</li>
	<li>通过目视以及使用与相机兼容的软件（如开源软件 Micro-Manager）进行视频确认，检查装置流路中是否存在气泡。有关使用 Micro-Manager 的提示，请参见步骤 6。
	<ol>
		<li>如果存在气泡，在装载任何动物之前，需等待气泡脱离或被PDMS壁吸收；气泡的存在会干扰液体在装置中的正常流动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 GFP 滤光片，通过操作三通阀并观察缓冲液的切换，确认加样前芯片内的流体动力学状态正常。
	<ol>
		<li>确定适当的流体动力学：观察流体控制和缓冲溶液中存在的荧光素图 2D-2E) 当按下灌注控制器软件中对应于三通阀的控制按钮以改变流量控制值时，图1B).</li>
		<li>打开 Micro-Manager 后，点击“Live”以观察设备的实时图像。打开荧光光源以观察缓冲液在设备中的流动情况。图 2D-2E).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="微流控流体控制装置；示意图、显微镜图像、图表；ASHL信号分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：一种适用于雄性线虫的微流控嗅觉芯片。（A）当线虫暴露于缓冲液时，装置内的流体流动模式。缓冲液（B）以棕色表示，流体控制通道（FC）以黄色表示，刺激物（S）以白色表示。线虫加载口经过改造，增加了一个弯曲结构，有助于更好地控制线虫的方向。（B）当线虫暴露于刺激物时，装置内的流体流动模式。缓冲液（B）以棕色表示，流体控制通道（FC）以黄色表示，刺激物（S）以白色表示。（C）实际制备的改进型装置的测量结果。线虫加载口末端为一个42 µm的开口，通道宽度设计为50 µm，以适应雄性线虫的体型。尽管设计目标为25 µm，实测通道高度为32 µm。（D–E）一只被捕获并表达 psra-6::GCaMP3 的雄性线虫。sra-6 启动子并非 ASH 特异性，因此在 ASI 神经元中也可能观察到部分表达，但未在 ASI 中检测到钙瞬变。图像（D）为明场与荧光照明的叠加图像，而（E）仅为荧光图像。比例尺为42 µm。（F）ASH 神经元对1 M甘油刺激产生强烈的神经活动反应。蓝色区域表示施加1 M甘油刺激的时间段。阴影区域表示标准误差范围，数据来自七只线虫的20次刺激脉冲。红色轨迹表示去极化反应。Y轴显示 ΔF/F0。比例尺为5 s。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
4. 动物准备
注意：参见参考文献23。
<ol>
	<li>利用1 M甘油处理成像ASH反应。
	<ol>
		<li>放置约20 C. elegans p 阳性的雄性个体sra-6::GCaMP3 阵列表达于涂布有 OP50 菌苔的线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上 E. coli使用荧光GECI的表达和/或共注射标记物来鉴定含有目的基因阵列的动物。 
		注意：根据所使用的GECI，阵列阳性动物会发出荧光（即， 表达 GCaMP 的动物在蓝光刺激下会发出绿色荧光，而表达 RCaMP 的动物在绿光刺激下会发出红色荧光。共注射标记物可以是其他荧光蛋白（如 GFP 和 RFP），也可以是表型标记物，例如 rol-6，或能够挽救一种显性表型，例如 pha-1 突变28.
		<ol>
			<li>若在检测前立即挑选，应选取年轻成年雄虫；若在检测前一天挑选，则应选取L4期雄虫。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像CEM反应 1 µM ascr#3.
	<ol>
		<li>挑选约20个L4期幼虫 秀丽隐杆线虫 雄性（fkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1] pha-1(e2123ts) him-5(e1490) lite-1(ce314) 中表达 dsRed 共注射标记阳性的个体。 
		注意：与四条CEM神经元中的GCaMP表达相比，雄性尾部射线神经元中的dsRed表达更容易观察和确认。</li>
		<li>将这些雄虫与两性虫分离，置于接种了OP50菌苔的NGM琼脂平板上 E. coli 在进行成像实验前，需孵育5-14小时。 
		注意：未至少隔离 5 h 的雄性对 ascr#3 无行为反应，因此其对ascaroside的钙瞬变可能比此处观察到的更少。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 动物装载
注意：参见参考文献1。
<ol>
	<li>使用标准的线虫培养技术，挑选一只线虫转移到未接种的NGM琼脂平板上。
	<ol>
		<li>用火焰灼烧接种环（由压扁的铂金丝制成），蘸取少量细菌，轻触线虫以将其粘起。将线虫轻轻放置到新培养皿上，使其自行爬离接种环。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向未接种的平板中加入约 5 mL 的 1x S 基础培养基，使平板表面完全被液体覆盖。</li>
	<li>将蠕虫吸入加样注射器中（即， 3 mL 注射器（带连接管），已预装1x S 基础培养液。
	<ol>
		<li>务必仅将蠕虫吸入管路中，而不要完全吸入注射器内。 
		注意：如果线虫进入注射器，几乎不可能将其重新移回导管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭出口鲁尔阀以关闭真空，停止液体流动。</li>
	<li>移除堵塞线虫加样口的固体针状物。</li>
	<li>旋转连接至出口端口的鲁尔阀（图1B）以确保其处于通风状态。 
	注意：在装载线虫时使用实时视频监控，以确认动物的位置和方向（步骤 5.8–5.13）。</li>
	<li>将蠕虫加样管插入蠕虫加样口。</li>
	<li>轻轻按压注射器，直至线虫出现在加样通道中。</li>
	<li>如果线虫开始尾部先进入通道，拉动注射器活塞以阻止线虫进入通道。</li>
	<li>在施加和反向压力之间切换，直至头部首先进入通道。</li>
	<li>通过旋转连接出口端口的三通鲁尔阀，将系统与真空连通，而非与大气相通。</li>
	<li>通过按压注射器活塞手动施加压力，以调整并固定线虫头部位置，使其暴露于缓冲液流动通道中，但不可过度推进导致头部自由移动图2D-2E).</li>
</ol>
6. 刺激与采集
<ol>
	<li>使用开源显微成像软件（如 Micro-Manager），在蓝光激发（470 nm）下以每秒 10 帧的速度连续采集图像，记录持续 30 秒的 TIFF 格式图像序列。</li>
	<li>在主菜单中将曝光时间设置为 100 ms。
	<ol>
		<li>从软件主菜单中打开“Multi-D Acq.”，将“number”设为“300”，“interval”设为“0”，然后点击“Acquire!”开始采集视频。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在开始采集 5 秒后，施加持续 10 秒的刺激；可根据需要调整刺激施加的持续时间。
	<ol>
		<li>采集 5 秒视频后，切换控制灌流缓冲液的三通阀，以向待测动物施加刺激。点击灌流控制软件中最左侧的按钮（图 1B）。</li>
		<li>在刺激暴露 10 秒后（此时间可根据需要由用户调整），再次按下灌流控制软件中最左侧的按钮，以改变缓冲液的流动状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在刺激结束后继续仅用缓冲液灌流，直至完成 30 秒的记录窗口，使 GECI 荧光恢复至基线水平。</li>
	<li>根据需要重复实验；每次采集结束后，需等待 30 秒后再开始下一次试验。</li>
</ol>
7. 图像分析
<ol>
	<li>通过将文件拖入 ImageJ 窗口，使用开源软件 ImageJ 打开 TIFF 图像栈。</li>
	<li>使用光标单击并拖动，在目标神经元周围设置感兴趣区域（ROI）。将区域设置为包含目标神经元的胞体（如 图 3A 所示）。</li>
	<li>点击“文件”-&gt;“图像”-&gt;“图像栈”-&gt;“绘制 Z 轴轮廓”，绘制 ROI 在各图像层中荧光强度的 Z 栈曲线。</li>
	<li>在弹出的窗口中点击“列表”，然后点击“编辑”-&gt;“复制”以复制数值，并将数值粘贴至电子表格程序中。</li>
	<li>通过将 ROI 拖动至线虫中不表达 GCaMP 的区域，分析每个脉冲的背景荧光。</li>
	<li>通过从神经元荧光强度值中减去背景荧光值，对每个脉冲进行背景校正。</li>
	<li>计算每个脉冲每一帧的 ΔF/F0 值。
	<ol>
		<li>将 F0 定义为采集开始后前 1 秒内 ROI 的平均强度值（例如，第 1–10 帧）。</li>
		<li>将目标帧经背景校正后的值除以计算得到的 F0 值，得到 ΔF/F0。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对所有成像的神经元及每个刺激脉冲重复上述步骤。</li>
	<li>对于反应模式一致的神经元（如 ASH），对每个神经元的所有脉冲取平均值，并计算标准误差（SEM）（如 图 2F 所示）。</li>
	<li>绘制每个神经元随时间变化的平均 ΔF/F0 及其 SEM。 
	注意：在此类分析中，通常还应包含各次试验中单个神经元反应的热图。对于在重复刺激或不同个体中钙瞬变对刺激无一致变化的神经元23，更适宜展示单个脉冲的轨迹图（如 图 4 所示）。详见 讨论 部分关于数据展示方式的说明。</li>
</ol>

<ol><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis%2C+Microscopy%2C+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这种适用于雄性个体的嗅觉芯片设计包含一个通向更窄加载口的弯道，可更精确地控制线虫的方向，并高效捕获雄性 C. elegans。该设计使得神经元双侧成对结构中的左侧和右侧成员均可被同时观察，无需进行Z轴层扫成像。对于仅有一对双侧神经元被荧光标记的线虫（例如 ASH 神经元），该弯道可使线虫100%偏离垂直方向（图2D-E）29,30。然而，对于具有四个呈辐射对称排列神经元的神经元类型（如 CEM 神经元），仅有三分之一的线虫能够同时观察到全部四个神经元；另三分之一的线虫仅能观察到其中三个神经元；在剩余三分之一的线虫中，仅能区分背侧与腹侧的细胞体，而无法分辨左右不对称性（数据未显示）。该更窄的入口与较低的微通道高度相结合，可防止线虫在Z轴方向上发生波动。这一设计为未来雄性线虫的研究提供了成像便利，结合日益丰富的雄性连接组知识25,<sup cla...

微流控装置提供了对精确可控环境的更便捷访问，可在其中对线虫 C. elegans 等动物进行实验操作1。这些研究包括行为学检测、钙成像研究，甚至特定表型的筛选，从而实现对实验结果更精确的测量1,2,3,4,5,6。微流控技术可通过小规模液体环境开展细致实验，同时仅需极少量试剂。新型微流控装置设计不断涌现，其用途各异：有的用于行为学检测和神经成像研究中支持 C. elegans 自然正弦运动的实验区域，有的为神经成像和嗅觉研究中使用的捕获装置，还有的适用于遗传筛选中的高通量表型分析4,5,6,7。在制备出主模具后，微流控装置的构建成本低廉——由于主模具可重复使用——且操作简便，可通过高通量研究快速生成数据。采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）等聚合物材料制造装置，可在数小时内完成新装置的制作。
钙成像研究利用在靶细胞中表达的基因编码钙指示剂（GECIs），实时测量这些细胞的神经动态8,9,10,11。C. elegans 的透明特性使得能够在活体动物中记录这些蛋白质的荧光水平。传统上，GECIs 依赖基于绿色荧光蛋白（GFP）的传感器——GFP-钙调蛋白-M13 肽（GCaMP），但近年来的研究已对这些传感器进行了改进，以获得更高的信噪比和红移的激发光谱。继 GCaMP3 开发之后，符合这些特性的蛋白质不断涌现，包括荧光衰减速率分别为慢速和快速的传感器 GCaMP6s 和 GCaMP6f，以及具有红移激活光谱的 RFP-钙调蛋白-M13 肽（RCaMP）。将这些 GECIs 与 C. elegans 细胞特异性基因启动子序列结合，可实现对特定细胞（尤其是感觉神经元）的靶向标记12,13,14,15,16。
尽管秀丽隐杆线虫（C. elegans）在微流控研究中的使用具有明显便利性，但几乎所有研究都集中于雌雄同体个体。尽管雄性个体在野生型种群中仅占0.01–0.02%，但对其表征仍可能带来不可估量的重要发现。虽然雌雄同体神经系统完整的物理连接组（connectome）数十年来已被全面绘制17，雄性个体的连接组仍不完整，尤其是在头部区域18。在雄性个体中应用钙成像技术将有助于理解雄性神经系统及其与雌雄同体之间的差异。成年雄性 C. elegans 体型较小，导致其难以在为体型较大的雌雄同体设计的传统嗅觉装置的加载端口内实现有效且可靠的固定。为解决这一问题，研究人员开发了一种改进版的Chronis嗅觉芯片19，其具有更窄的加载端口、更低的通道高度，以及带有转弯结构的线虫加载端口（可使线虫旋转），从而实现对左右双侧成对神经元的可视化观察。该设计具备以下优势：（1）可有效固定年轻成年雄性个体；（2）更可靠地调整线虫体位，以便同时观察双侧成对神经元的两个成员；（3）实现对雄性神经元神经活动的精确成像。
越来越多的研究表明，秀丽隐杆线虫（C. elegans）雄性对多种ascaroside（ascr，即线虫信息素）的反应与雌雄同体个体不同20,21,22,23,24。因此，深入理解雄性连接组中的神经动态过程及其表征变得愈发重要。雄性 C. elegans 拥有87个雌雄同体所没有的性别特异性神经元25,26，这些神经元以尚未明确的方式改变了连接组的结构。能够成像这些独特的神经动态，将有助于我们更深入地理解性别特异性的神经反应及其表征机制。
本方案描述了使用雄性适配的嗅觉芯片对雄性 C. elegans 化学感应神经活动进行成像的方法。伤害性感觉神经元 ASH 对 1 M 甘油产生可靠反应，这与此前对雌雄同体的研究结果一致27。暴露于ascaroside可能引发个体间差异较大的反应，因此需要检测更多数量的动物。此前通过膜片钳电生理和钙成像研究均已证实，雄性特异性CEM神经元对 ascaroside #3 的反应具有变异性23。

<table><tbody><tr><td>硅片</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2035</td><td>MicroChem</td><td>Y111070-0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>显影液</td><td>MicroChem</td><td>Y020100-4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>晶圆掩模</td><td>Cad/Art Services</td><td>-</td><td>定制订单，打印分辨率为 25,000 dpi。</td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm 皮肤打孔器</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P150</td><td></td></tr><tr><td>软管</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>硬管</td><td>IDEX Health &amp; Science</td><td>1622</td><td></td></tr><tr><td>针脚</td><td>New England Small Tube</td><td>NE-1027-12</td><td></td></tr><tr><td>阻断针</td><td>New England Small Tube</td><td>0.415/0.425&quot; 外径 × 0.500 英寸长</td><td>批次 PB07027</td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>30 mL 注射器</td><td>Vitality Medical</td><td>302832</td><td>用作缓冲液储液槽。</td></tr><tr><td>23 号不锈钢钝头针，聚丙烯鲁尔接头</td><td>Component Supply Company</td><td>NE-231PL-50</td><td></td></tr><tr><td>带鲁尔接头的三通旋塞阀，公端锁紧，5 种流路模式，非无菌</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30600-07</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium 盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Mercator 控制系统 LF-5 等离子体系统</td><td>Mercator</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>Scotch 透明胶带</td><td>Scotch</td><td>BSN43575</td><td></td></tr><tr><td>Series 20 腔室</td><td>Warner Instruments</td><td>P-2</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>420250000</td><td>内径 24 cm。</td></tr><tr><td>称量舟</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-01017-27</td><td></td></tr><tr><td>Classic Plus 天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1501-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-25554-06</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Genesee Scientific</td><td>30-202</td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Sheldon Manufacturing Inc</td><td>9120993</td><td>型号：1500E。</td></tr><tr><td>60 mm，无通气孔，锐边培养皿</td><td>TriTech Research</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.A1</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Hammamatsu Orca Flash 4.0 数字 CMOS 相机</td><td>Hammamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>蓝色荧光灯</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM6-LCR-SA</td><td>24–30 V/7.9 A 直流电。</td></tr><tr><td>照明适配器</td><td>Zeiss</td><td>423302-0000</td><td></td></tr><tr><td>Series 1 和 2 微型惰性聚四氟乙烯隔离阀</td><td>Parker</td><td>001-0017-900</td><td>用于控制流体的三通阀。</td></tr><tr><td>ValveLink8.2&amp;reg;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td>流量开关控制器</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager</td><td>-</td><td>免费软件，可从以下网址下载：https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>-</td><td>免费软件，可从以下网址下载：https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>琼脂，细菌级</td><td>Apex</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Apex</td><td>20-260</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>BDH0224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-1kg</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270741-4L</td><td></td></tr><tr><td>四咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756-10(G)</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>荧光素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S-250mg</td><td>对光敏感。应储存在避光小瓶中。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ascaroside #3</td><td>-</td><td>-</td><td>由康奈尔大学 Schroeder 实验室合成。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-215</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>BDH</td><td>BDH9268.25</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-025</td><td></td></tr><tr><td>ASH GCaMP3 品系</td><td>-</td><td>-</td><td>CX10979（KyEx2865 [p&lt;em&gt;sra&lt;/em&gt;-6::GCAMP3 @ 100 ng/μL]）。由 Bargmann 实验室构建，由 Albrecht 实验室文库提供。</td></tr><tr><td>CEM GCaMP6 品系</td><td>-</td><td>-</td><td>JSR49（FkEx98[p&lt;em&gt;pkd&lt;/em&gt;-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]；&lt;em&gt;pha&lt;/em&gt;-1(e2123ts)；&lt;em&gt;him&lt;/em&gt;-5(e1490)；&lt;em&gt;lite&lt;/em&gt;-1(ce314)）。由 Robyn Lints 构建，由 Srinivasan 实验室文库提供。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; (OP50)</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis&lt;/em&gt; 遗传中心</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>&quot;储液槽&quot;</td><td>-</td><td>-</td><td>制备储液槽的方法：将一个 &quot;30 mL 注射器&quot; 连接到一个 &quot;带鲁尔接头的三通旋塞阀，公端锁紧，5 种流路模式，非无菌&quot;，该旋塞阀再连接一个 &quot;3 mL 注射器&quot; 和一个 &quot;23 号不锈钢钝头针，聚丙烯鲁尔接头&quot;。将 &quot;23 号不锈钢钝头针，聚丙烯鲁尔接头&quot; 插入 &quot;软管&quot;，插入深度约为针头长度的三分之一。</td></tr></tbody></table>

使用改良的微流控嗅觉芯片对雄性 c. elegans 头部神经元中信息素诱导的神经元活动进行成像

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

钙指示剂的使用极大地增进了我们对神经动态及其调控机制的理解。线虫 秀丽隐杆线虫，其神经系统已完全绘图且解剖结构透明，是利用钙指示剂研究实时神经动态的理想模型。结合微流控技术和实验设计，可对自由移动和固定状态的动物均开展基于这些指示剂的钙成像研究。然而，以往大多数研究采用的固定装置（如 Chronis 所描述的嗅觉芯片） 等，已有专为更常见的雌雄同体线虫设计的装置，而较为少见的雄性线虫在形态学和结构上均存在差异。本研究设计并制作了一种改良的嗅觉芯片，以提高对年轻成年雄性个体神经元成像的效率。在蠕虫加载端口处加入了一个转弯结构，用于旋转动物个体，从而在二维成像中实现双侧成对神经元的分离。线虫在微流控装置内暴露于受控的气味流中，具体条件如先前针对雌雄同体研究所述。随后使用开源软件 ImageJ 分析钙瞬变信号。本文所述方法应有助于增加基于雄性线虫的 秀丽隐杆线虫 钙成像研究，加深了我们对性别特异性神经元信号传导机制的理解。

整体装置设置的示例如图1A-B所示。图1A展示了正确的储液池结构与设置方式。图1B显示了储液池与微流控装置之间的连接方式。图1C展示了一个带有各个端口标注以增强清晰度的微流控装置。
男性适应型微流控装置的设计在加样口处包含一个弯曲结构，但其流体动力学特性与Chronis et al.19(图2A-2C)设计的装置相同。通过调节开放的流控阀门，可控制缓冲液的流动（图2A...

本文介绍了一种改良的&#34;嗅觉芯片&#34;，用于高效进行秀丽隐杆线虫（C. elegans）雄虫的钙成像。同时展示了雄虫暴露于甘油和一种信息素的研究结果。

使用改良的微流控嗅觉芯片对雄性 C. Elegans 头部神经元中信息素诱导的神经元活动进行成像

钙指示剂的使用极大地增进了我们对神经动态与调控机制的理解。线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），凭借其……

本实验的总体目标是，在秀丽隐杆线虫雄性个体头部神经元暴露于信息素时，高效捕获其钙离子瞬时变化的图像。该方法有助于回答神经生物学领域的一些关键问题，例如理解性别特异性的神经回路调控机制。该技术的主要优势在于，现在可以利用微流控捕获装置对秀丽隐杆线虫雄性个体进行高效成像。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为最初装载动物较为困难，且生物信息素并非在每只动物中都能引发钙瞬变。开始组装储液器时，通过在一端插入针头、另一端插入金属管的方式，制备三套导管。然后，对于每个储液器，取一个三通鲁尔阀，连接一支已移除活塞的30毫升注射器、一支3毫升注射器以及导管。向每个储液池中加入适当的缓冲液，可以是刺激剂S基础液，也可以是含有荧光素的S基础液。然后通过轻弹和抽吸注射器的方式，去除储液池和管路中的任何气泡。接着，用新的三毫升注射器和管路吸入S基础液，并将其插入微流控装置的出口端口。轻轻对注射器施加一点压力，直至缓冲液出现在入口孔的表面。接着，将流体控制管、缓冲液管和刺激物储液管连接至相应的入口孔，确保加样口孔和待连接的管路末端均存在液滴。随后，再次轻轻增加注射器的压力，直至线虫加样口入口处出现液滴，然后将一根实心阻塞针插入该端口。接下来，将注射器从出口端口取下，并连接一条通向真空系统的出口管路。现在，通过显微镜的视频画面检查装置中浮子通道是否存在任何气泡。点击“实时”按钮，观察实时图像，并等待气泡自然消散后再继续操作。接下来，打开荧光光源，使用 GFP 滤光片确认流动状态是否正常。启动三相波阀，当阀门打开时，在视频画面中观察到荧光控制流的出现。首先，挑选一条线虫转移到未接种的 NGM 琼脂平板上，让线虫爬行离开。然后，用 S 基础培养基漂洗平板。将含有线虫的溶液吸入注射器中。接着，在装置上通过关闭出口鲁尔阀来关闭真空，从而停止液体流动。然后，移除阻塞线虫加载口的固体销钉。将含有线虫的管子插入加载口。打开出口鲁尔阀，并观察实时视频画面。现在，轻轻按压注射器，直到线虫出现。如果线虫尾部先进入通道，需将其拉回，必须确保线虫头部先进入，才能有效接受刺激。操作者必须在尾部完全进入通道前将其拉回，否则将线虫从通道中取出极为困难，通常需要将线虫完全冲出通道，并重新装入新的线虫。现在，利用注射器的压力将线虫推过通道，并调整线虫头部位置，使其暴露于缓冲液流中，但不可深入通道内，以免其自由移动。在未麻痹的动物中，可观察到少量的轴向或旋转运动。尽管在缓冲液中加入麻痹剂可几乎完全消除这种效应。为降低实验过程中发生移动的可能性，应使用较年长的雄性个体（其更易被有效捕获），或减小线虫加样口的宽度或厚度，或延长麻痹处理的时间。使用软件进行蓝光激发下的图像记录。将曝光时间设为100毫秒，打开图像采集窗口，设置时间点为300个，时间间隔为0，然后开始图像采集。五秒后，通过切换控制缓冲液的三通阀施加刺激。建议以10秒刺激作为起始条件，可根据需要调整刺激时长。刺激结束后，再次按下按钮切换回原流路，并继续记录，直至完成30秒的视频采集。这使得g camp荧光恢复至基线水平。现在，让样品在下一次试验前静置30秒。在AS希神经元（ASH）中表达g camp 3的线虫，对1摩尔甘油产生反应，AS希神经元内出现明显的荧光变化，表明神经活动的发生。神经元应在整个视频中保持在分析区域内，否则可能出现运动伪影。若发生此情况，需针对这些时间点调整分析区域，并合并强度值以生成单条轨迹。在暴露期间受到吸引性生物源信息素ascaroside three刺激的雄性个体，其四条CEM神经元中的钙瞬变被测定。在不同动物之间以及不同神经元之间，信号轨迹在形态、方向和幅度上均存在差异。因此，在研究信息素反应时，分析大量动物样本非常重要。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将雄性秀丽隐杆线虫装入微流控装置，并分析其头部神经元中的钙瞬变。该过程同样可用于雌雄同体，以鉴定 sec 特异性神经反应的差异。掌握该技术后，首只动物的成像可在半小时内完成。首次记录完成后，每更换一只新动物并进行成像约需 10 分钟。通过此操作步骤，可将光遗传学等其他方法与本方案相结合，以进一步理解神经回路的调控机制。

using-an-adapted-microfluidic-olfactory-chip-for-imaging-neuronal

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

应用一种适应微流控嗅觉芯片的神经活性成像对雄性线虫神经元的信息素反应

我们介绍一种已建立的技术，用于测量和分析活体黑腹果蝇（Drosophila...

Drosophila 嗅觉中枢对气味刺激反应的钙成像

本文介绍了固有光学信号和黄素蛋白自体荧光信号成像的技术方案，用于绘制小鼠嗅球表面由气味诱发的神经活动图谱。...

利用光学反射和自发荧光信号成像小鼠嗅球中的气味诱发活动

一种无需麻醉的简易微流控装置已被开发出来 体内 成像 秀丽线虫完整 果蝇...

简单的微流控装置 体内 成像 秀丽隐杆线虫, 果蝇 和斑马鱼

本文描述了秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

长期嗅觉适应的分子读出 秀丽隐杆线虫

我们展示了细胞外多单位记录技术的多种变体，用于表征无脊椎动物嗅觉通路前三个阶段中由气味诱发的神经反应。这些技术也可轻松适用于研究其他神经系统中的群体神经活动。...

用于表征蝗虫（Schistocerca americana）嗅觉回路中神经活动的多单元记录方法

黑腹果蝇 幼虫因其半透明的角质层和强大的遗传学工具，成为活体成像的理想模型系统。本方案描述了如何利用一种单层聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置，即“幼虫芯片”，对3龄幼虫神经元中的细胞过程进行活体成像rd 龄期 果蝇...

使用微流控芯片进行活体成像及损伤反应研究 果蝇 幼虫

为了理解机械应力如何激活生化通路并引发生物学反应，机械生物学研究需要新的工具。本文展示了一种新方法，利用微流控捕获装置对固定化的动物进行选择性机械刺激，从而实现对细胞反应的高分辨率成像。...

使用微流控装置进行机械刺激与高分辨率成像 秀丽隐杆线虫

本方案描述了使用基因编码的Ca2+探针记录自由活动的Caenorhabditis...

行为动物中单个神经元的比率钙成像 秀丽隐杆线虫

本方案描述了一种简单的微流控芯片设计及微加工方法，可用于在持续供应食物的条件下培养秀丽隐杆线虫（C.

一种用于长期培养与成像的简易微流控芯片 秀丽隐杆线虫

本方案建立了提取和量化秀丽隐杆线虫（C.

秀丽隐杆线虫中挥发性性信息素的提取与化学吸引测定

本方案描述了基于微流控技术的秀丽隐杆线虫（C.

高分辨率秀丽隐杆线虫（C. elegans）在所有幼虫阶段的成像

学习利用微流控嗅觉芯片对雄性秀丽隐杆线虫进行钙成像，以研究信息素诱导的神经元活动。该方法可实时观测ASH和CEM神经元的钙信号变化，揭示性别特异性神经环路调控机制。

使用改良的微流控嗅觉芯片对雄性 C. Elegans 头部神经元中信息素诱导的神经元活动进行成像

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