来自新生儿和成年鼠皮肤的原代小鼠角化细胞的分离和培养

该程序的总体目标是从新生或成年小鼠皮肤中分离原代小鼠角质形成细胞，使其免受体外分化，或研究它们对 UVB 暴露的先天免疫反应。这种方法可以帮助回答表皮生物学领域关于角质形成细胞分化如何调节或表皮角质形成细胞如何对外部刺激做出反应的关键问题。该技术的主要优点是，角质形成细胞可以常规地从小鼠、新生儿和成年小鼠皮肤中分离出来，并且可以与我们的血清一起培养。

与我一起演示该程序的是我实验室的一名研究助理 Fengwu Li。首先去除野生型 C57 BL6 的四肢，出生后第 0 天到两只小鼠新生儿，刚好在手腕上方缠住关节，并完全切断尾巴，留下一个小球。将锋利的剪刀插入尾孔，沿着身体背侧中线剪开皮肤，直到脖子上的开口。

使用一把镊子抓住裸露的身体，然后用另一把镊子抓住皮肤。然后以一个连续的动作轻轻地将整个皮肤从身体和腿部残端上剥离，注意不要将皮肤碎成碎片。在 10 厘米培养皿中用 50 毫米无菌 PBS 冲洗脱皮的皮肤，然后将皮肤放入含有冰冷分散酶消化缓冲液的 2 毫升管中，注意皮肤不要折叠。

收集完所有新生儿皮肤片后，将管子放在 4 摄氏度的旋转器上过夜。第二天早上，将试管内容物分配到新的培养皿中。然后，将每块组织转移到含有 50 毫升无菌 PBS 的新培养皿中，以去除任何多余的分散酶。

使用两个镊子，将皮肤样品放入单个培养皿中，表皮面朝下，小心拉伸皮肤褶皱，使碎片在培养皿底部完全伸展。向每个培养皿中加入 500 微升基于胰蛋白酶的消化溶液，并使用一个镊子慢慢将每个真皮向上提起并远离表皮，同时用第二个镊子将表皮固定到位。将分离的表皮漂浮在胰蛋白酶溶液中，基础水平朝下并覆盖培养皿。

然后在室温下在水平摇床上孵育皮肤块，轻轻搅拌 20 分钟。在孵育结束时，向每个培养皿的每个表皮中加入 2 毫升补充的角质形成细胞生长培养基，并使用镊子用力摩擦表皮片，从皮肤组织中释放出单个细胞。当培养基变得浑浊时，倾斜培养皿，以便收集细胞悬液并将其转移到新试管中。

将剩余的表皮组织留在培养皿中。第三轮细胞收集后，轻轻研磨混合的细胞悬液几次以打碎任何细胞团块，然后通过 100 微米过滤器将细胞过滤到新的 50 毫升锥形管中。通过离心收集细胞，并将沉淀轻轻地重悬于冰上的一毫升冷角质形成细胞生长培养基中，用于计数。

将细胞以 5x10 至 4 平方厘米的密度接种在培养皿中的角质形成细胞生长培养基中，预涂有促进细胞附着的细胞外基质产物。然后在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞，每天用新鲜培养基更换上清液，直到细胞达到适当的汇合度。要从成年小鼠中分离角质形成细胞，首先去除其底部的尾巴。

然后去除大约 2 毫米的尾尖，以便有可见的孔。用锋利的刀片沿着尾皮从底部到尖端切割。然后，用一个镊子抓住暴露的尾骨，用另一个镊子抓住皮肤，以一个连续的动作轻轻地从骨头上剥下皮肤组织。

在中线切开去皮的皮肤，使每块长度小于 2 到 3 厘米，然后在 10 厘米的培养皿中用 15 毫升无菌 PBS 冲洗碎片。将最多 5 个尾巴的果皮放入含有最多 12 毫升冰冷的 12 毫升冰块、分散酶消化缓冲液的 15 毫升管中，并在 4 摄氏度下旋转孵育果皮过夜。第二天早上，从部分消化的皮肤片中分离表皮细胞，就像刚刚对新生儿皮肤样本所示。

然后将分离的成体角质形成细胞以 1x10 的密度接种至五次方厘米平方密度的角化细胞生长培养基中，在预涂有胶原蛋白的培养皿中。每天更换上清液，直到细胞达到适当的汇合度。为了诱导任一类型角质形成细胞培养物的终末分化，为细胞添加 2 纳摩尔浓度的氯化钙。

对于 UVB 照射诱导的死亡，用 500 微升 PBS 替换来自汇合角质形成细胞培养物的生长培养基，并将细胞短暂暴露于每平方厘米 15 毫焦耳的 UVB。用新鲜生长培养基替换 PBS，并将细胞放回细胞培养箱中 6 小时。在每个实验时间点收集条件培养基后，根据制造商的说明，通过细胞计数试剂盒辅助活力测定法定量细胞活力。

然后根据标准方案测量 TNL 以由辐照的角质形成细胞释放到条件培养基中。Primary 模式的表皮角质形成细胞接种并保持在 06 纳摩尔氯化钙中，以单层形式生长，单个细胞呈现多边形形状，具有不同的细胞间空间，并在汇合时表现出整体鹅卵石外观。将氯化钙升高到 2 毫摩尔，诱导细胞的快速形态变化。

随着细胞变平，明显的细胞间隙在 8 小时内变得不那么明显。并且紧密连接之间的细胞间粘附在 24 小时内变得更加明显。到 48 到 72 小时，角质化细胞包膜的形成和垂直细胞分层变得明显。

高钙处理的角质形成细胞的鬼笔环肽染色揭示了早在钙转换后三小时，相邻细胞之间就形成了富含肌动蛋白纤维的丝状细胞突起。在 6 到 24 小时之间，肌动蛋白纤维的进一步重塑变得明显。在高钙暴露后 48 小时明显可见细胞分层。

UVb 照射触发角质形成细胞培养物的时间依赖性细胞死亡，相差成像和细胞活力测定都证明了这一点。事实上，到 24 小时时，几乎所有细胞都变得圆润和分离，并通过细胞活力测定法测量为不可存活。很可能是由于高水平的 TNF α，角质形成细胞在 UVB 暴露后缓解。

在尝试此过程时，重要的是要记住，要始终将解离的角质形成细胞保持在冰上，并尽快将细胞铺板，以避免分离细胞的终末分化。发展后，这项技术为表皮生物学领域的研究人员探索角质形成细胞在皮肤发育和皮肤先天免疫防御中的作用铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何从新生或成年小鼠皮肤中分离和培养原代表皮角质形成细胞有很好的了解。