激光多普勒：一种用于体内测量胰岛微血管血管运动的工具 In Vivo

本实验的总体目标是确定胰岛微血管舒缩功能的体内状态，以评估其对相关疾病的影响。该方法有助于回答医学循环领域中的关键问题，例如胰岛微血管舒缩功能在病理状态下是否发生变化。当我们首次证实糖尿病发展过程中存在功能性机械循环变化时，便提出了该方法的构想。

该技术的主要优势在于，能够在临床和实验室环境中评估组织和器官微血管舒缩功能的状态。该方法可为胰岛相关疾病提供深入认识，还可应用于其他系统，例如肾脏和视网膜相关的微血管疾病。

该技术的应用还可拓展至理解微血管舒缩功能状态变化趋势的本质。通常，刚接触此方法的研究人员会面临困难，因为在实验过程中会从激光多普勒设备获得大量微血管学术数据。务必进行该方法的示范操作，因为多种因素可能对微循环数据的准确采集产生不利影响。

本方案首先在连续五天内每天给予小鼠一次STZ注射。将STZ溶解于柠檬酸钠缓冲液中，配制成5 mg/mL的工作浓度。随后使用1 mL注射器和25号针头进行腹腔注射。

小鼠在注射前需禁食4小时，但不应限制其饮水。对照组小鼠注射等体积的纯柠檬酸钠缓冲液。注射后，为小鼠提供常规食物和10%蔗糖水。

注射STZ后的第五天，将10%蔗糖水更换为普通水。九天后检测小鼠血糖水平。首先让小鼠禁食六小时，但可自由饮水。

然后，从尾静脉采血，并使用标准手持式血糖仪测量血液。若小鼠的血糖水平超过200毫克/分升，则视为糖尿病小鼠。使用激光多普勒仪器前，应先用柔软、无磨损的布清洁探头尖端和探头连接器的光学表面，然后将电缆插入仪器的端口中。

接下来，组装校准支架。首先让储存的通量标准品升至室温，这大约需要半小时。

然后，轻轻摇动通量标准品10秒，并将其静置于校准底座上2分钟。接着，将夹具升至最高位置，并将探头固定于夹具中。随后，缓慢将探头浸入通量标准品中，并使用探头固定装置固定探头。

继续操作时，调暗房间灯光，然后按下激光多普勒仪器上的校准按钮。选择探头所连接的工作通道，并运行校准程序。将一只麻醉小鼠仰卧位放置于操作平台上，并使用手术胶带固定。

接着，用75%乙醇从颈部区域至尾部对腹部皮肤进行消毒，然后用一块中央有3厘米宽孔洞的干燥纱布块覆盖该区域的周围部分。接着，用镊子提起腹部皮肤，使用手术刀或皮肤剪沿腹部中线做初始的纵向切口。然后用镊子夹住下方的肌肉并切开，以进入腹腔。

避免损伤任何器官。为暴露腹腔，将皮肤及下方肌肉向胸部折叠，然后使用一对钝头镊子轻轻暴露胰体和脾脏。接下来，在激光多普勒仪器的控制软件中创建一个新的测量文件，然后配置已连接的监测器。

在常规选项卡中，将监测时长设置为自由运行，并在LDF监测选项卡中使用出厂默认设置。接下来，打开显示设置对话框并选择相应的通道。然后，切换以下参数：通道的数据源和标签、单位以及颜色，然后单击下一步。

接下来，在文件信息对话框中输入受试者和测量的相关识别信息，然后再次点击“下一步”继续。此时，配置已完成，测量窗口将弹出。随后，手动推进电极至距胰腺一毫米范围内。

测量的准确性与探头和胰岛组织之间的距离相关。除非严格保持组织与探头之间一毫米的间距，否则血流读数将不准确。开始记录时，点击启动图标，微血管血流PU数据即开始保存。

持续操作一整分钟，使用压缩和展开显示按钮以及增加或减少图谱高度的按钮，在记录过程中调整显示效果，然后停止记录。接着，使用合适的名称保存文件。现在，手动重新定位探头，以避免叠加效应以及局部收缩和舒张能力的耗竭。

总共从每只小鼠胰腺的三个随机位点收集PU数据。在实验过程中的某个时间点，测量非反射板的PU数据以获得基线对照值。完成三次测量后，使用3-0缝线缝合肌肉层，然后使用4-0缝线缝合皮肤层。

现在将小鼠置于恢复笼中进行监测，直至其可以转移到干净的饲养笼中。通常情况下，胰岛微循环状态表现为周期性的收缩和舒张阶段。整体血流动力学现象形成了一种血液灌注流动的模式。

使用激光多普勒仪器采集了PU数据，以显示非糖尿病小鼠和糖尿病小鼠微血管血流灌注的分布模式。结果截然不同。链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠胰岛微血管血管舒缩的收缩与舒张节律混乱且不规则，而非糖尿病对照组则呈现规律性振荡。

接下来，使用PU谱对血管舒缩运动进行定量分析。与对照组相比，链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠胰岛微循环的平均血流灌注量降低。这些小鼠的血管舒缩运动振幅和频率均显著下降，胰岛血流灌注的相对速度也显著降低。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在30分钟内完成。在实施该操作时，需特别注意确保探头与胰腺组织之间的距离保持在1毫米以内。距离不当会导致血流量读数出现人为的升高或降低。

在完成该操作后，还可进行其他方法，如激光散斑和氧转运，以回答更多问题，例如缺血可视化、血流评估以及微血管舒缩功能状态的评价。该技术建立后，为内分泌学与代谢领域内的研究人员和临床医生探索胰岛相关疾病背后隐藏的微循环机制提供了途径。请注意，由于辐射暴露的危险性，使用激光仪器可能具有极高风险，因此在进行该操作时，必须始终采取预防措施，例如确保环境侧面距离眼睛至少200毫米。