Name: 高脂膳食喂养和高通量三测定在果蝇中的含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 了解利用高脂膳食喂养和高通量三酰甘油测定在果蝇中诱导肥胖的方法。该技术可在数天内快速积累脂肪并在一小时内完成检测，为代谢疾病和脂毒性研究提供高效工具。

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我们感谢Erika Taylor对本文稿的编辑。本研究由美国国立卫生研究院向R.B.提供的资助（P01 HL098053、P01 AG033561和R01 HL054732）、向S.B.D.提供的博士后研究补充资助（R01 HL085481）和奖学金（AAUW），以及美国心脏协会向S.B.D.和R.T.B.提供的资助支持。

1. 高脂饮食喂养方案
<img alt="发酵装置表格，包含以克和毫升为单位的成分用量，用于科研。" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Table 1"> 
表1. 果蝇食物配方。 
本表格总结了用于制备对照食物的不同成分。配制完成后，将10 mL食物倒入试管中，冷却后于4 °C长期保存。
<ol>
	<li>高脂饮食（HFD）的制备
	<ol>
		<li>配制1 kg高脂食物时，使用分析天平分别称取700 g预制成的普通果蝇食物（见表1）和300 g椰子油，放入两个独立的容器中。</li>
		<li>将每个容器分别放入微波炉中加热，直至内容物完全融化。将融化的椰子油倒入果蝇食物容器中，用打蛋器搅拌，直至椰子油与果蝇食物充分混合。 
		注意：混合物中不应有可见的食物块或油滴。微波加热果蝇食物时，每隔1分钟暂停一次，搅拌食物以防止沸腾溢出。</li>
		<li>重新称量高脂食物的总重量。如果总重量小于1 kg（700 g食物 + 300 g椰子油），则加入约10 mL水，以补偿加热过程中蒸发的水分，并使总重量恢复至1 kg。</li>
		<li>每支试管中倒入约10 mL充分混合的高脂食物（约占试管体积的25%）。随后用纱布覆盖管口，防止果蝇污染。在室温下冷却1小时，然后将试管转移至4 °C保存，可保存长达4周。 
		注意：普通食物（NF）作为对照食物使用，每支试管也倒入10 mL（约占试管体积的25%）NF。对于高脂饮食（HFD）组，用椰子油替代30%的NF食物。在对照和实验条件下，果蝇所给予的NF和HFD食物量相同（每管10 mL食物）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="果蝇甘油三酯检测流程图；饮食实验；果蝇收集、冷冻、检测步骤" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1高脂饮食喂养在 果蝇. 
该示意图展示了果蝇在对照食物（正常饮食，未添加椰子油-NF）或高脂饮食（HFD，添加椰子油）下的不同喂养步骤。整个过程在初次收集成年果蝇后持续10天。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>高脂饮食喂养 D. melanogaster 
	注意：本方案包含适用于任何果蝇品系的对照食物和高脂饮食（HFD）喂养程序。对照组和实验组果蝇分别置于含有相同数量食物（正常食物或HFD）的试管中。
	<ol>
		<li>使用 CO2 使果蝇麻醉。 
		注意：初学者请阅读参考文献21 关于饲养与处理的概述 D. melanogaster.</li>
		<li>从试管中收集0-5天龄的果蝇，通过翻转将果蝇转移至含有NF培养基（预先在室温下温育）的新试管中。将果蝇在25°C、60%湿度条件下继续培养5天 21 °C.</li>
		<li>5天结束后，取出含有HFD和NF的样品管 4 °C. 
		注意：由于低温可能对活体果蝇造成应激，使用前请将试管置于室温下静置30分钟，使其升温。</li>
		<li>使用擦拭纸清洁小瓶侧面并去除多余的液体。</li>
		<li>将一小片约1 cm × 3 cm的滤纸插入高脂肪食物中，以吸收多余的液体。 
		注意：此步骤对于防止果蝇粘附在高脂食物上至关重要。</li>
		<li>接下来，将果蝇转移至高脂食物上（通过翻转）。将试管水平侧放（不要直立），置于21-22 °C 5天。 
		注意：避免较高温度，因为这可能导致高脂肪食物部分融化，使果蝇粘附在食物上而死亡。</li>
		<li>5 天后，将正常饲料（NF）和高脂饲料（HFD）中的果蝇翻转转移到无食物的新离心管中，使其肠道排空 30 分钟。随后，进行果蝇称重。 
		注意：本高脂饮食（HFD）喂养方案的关键步骤之一是制备混合均匀的HFD，确保无果蝇食物块或油相凝聚物。需充分均质混合，并将HFD冷却至45-30 °C 建议在将食物倒入小瓶并储存之前 4 °C对照组与实验组果蝇的年龄匹配非常重要，且在高脂饮食（HFD）喂养前应严格控制营养和环境条件。在喂养阶段，对照组和实验组果蝇必须接受等量的正常饮食（NF）和高脂饮食（HFD）。切勿从过度拥挤的试管或瓶子中收集果蝇（以避免跨代效应）。在NF和HFD喂养期间，每支试管中放置的果蝇数量不得超过25只，以防止饮食限制或其他拥挤效应。HFD由30%椰子油组成，因此温度高于 22 °C 可能会部分融化高脂饮食（HFD），导致果蝇粘附在油性食物上而死亡。在将果蝇转移至HFD之前，应清洗小瓶以去除残留油脂，并插入滤纸以吸收食物中多余的液体。果蝇在HFD上孵育期间，需将小瓶侧放，为果蝇提供一个无脂肪的水平表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称量果蝇
	<ol>
		<li>对于每种待测基因型和性别，使用超敏天平记录预先标记的空1.7 mL离心管的重量。</li>
		<li>使用果蝇麻醉剂或 CO2麻醉后，用毛刷将36只相同基因型、性别和饲喂状态的果蝇收集至一个预先称重的1.7 mL离心管中。</li>
		<li>使用相同的超灵敏天平称量含有果蝇的管子。</li>
		<li>根据以下公式计算果蝇的平均重量： 
		<img alt="果蝇平均体重计算公式；利用管重测量值计算果蝇体重的方程" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
		注意：本方案中果蝇的数量为36只。</li>
		<li>将装有果蝇的1.7 mL离心管浸入液氮中2分钟，进行速冻。收集并放入管盒中。随后将管盒转移至-80 °C （建议储存温度）用于储存，直至进行TAG检测时使用。 
		警告：液氮温度极低，请使用适当的个人防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. TAG 检测
<ol>
	<li>甘油三酯（TAG）标准品浓度的配制
	<ol>
		<li>配制 500 mL 的 PBT 缓冲液（PBS 1×，含 0.05% Triton）。</li>
		<li>使用 0.5 mL 离心管和甘油三酯（TAG）溶液（材料表），用 PBT 缓冲液配制 100 µL 空白对照（仅含 PBT）以及 100 µL 的六种标准 TAG 浓度（2 µg/µL；1 µg/µL；0.5 µg/µL；0.25 µg/µL；0.125 µg/µL；0.0625 µg/µL）。</li>
		<li>将离心管置于冰上，并立即开始研磨果蝇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>果蝇研磨
	<ol>
		<li>从 -80 °C 冰箱中取出冷冻的果蝇（见步骤 1.3），并将装有果蝇的离心管转移至冰上。</li>
		<li>首先，将 2 mm 金属研磨珠放入 96 孔研磨珠分配器中，使用小毛刷去除多余的研磨珠。</li>
		<li>将 96 孔研磨板倒置在研磨珠分配器上方，翻转以使金属珠直接落入研磨板的各孔中，确保每孔含有一颗研磨珠。</li>
		<li>使用多通道移液器，向 96 孔研磨板的每一行各孔中加入 600 µL 的 PBT 缓冲液。</li>
		<li>使用镊子向每孔中加入 3 只果蝇。在 96 孔研磨板的每一行/孔中标注果蝇的基因型、性别及食物处理条件。</li>
		<li>将盖子紧密盖在 96 孔研磨板上，必要时可在顶部用封口膜密封，以防泄漏。</li>
		<li>将 96 孔研磨板正确放入研磨仪中，将仪器调至最高速度，按下“运行”键，研磨 3 分钟。</li>
		<li>研磨 3 分钟后停止，随后进行离心：在 4 °C 条件下，以 4,000 × g 离心 15 分钟。离心后小心操作研磨板，避免上清液与沉淀混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品加样与甘油三酯（TAG）含量测定
	<ol>
		<li>取一个新的 96 孔比色板。使用多通道移液器，向每行各孔中加入 200 µL 的 TAG 试剂。</li>
		<li>向第一行第一孔中加入 20 µL 的 PBT 缓冲液作为空白对照。通过上下吹打混匀，避免产生气泡。</li>
		<li>向第一行其余各孔中分别加入 20 µL 的各标准品稀释液（来自步骤 2.1.2），并通过上下吹打混匀，避免产生气泡。</li>
		<li>使用多通道移液器，将研磨板中每行的上清液各 20 µL 转移至 96 孔比色板的对应行中。通过上下吹打充分混匀，避免产生气泡。</li>
		<li>随后，在 96 孔板上方覆盖一层透气封板膜。</li>
		<li>将 96 孔板在 37 °C 下孵育 10 分钟。 
		注：若孔中有气泡，需以 2,000 × g 离心 2 分钟以去除所有气泡。气泡的存在会影响吸光度读数。</li>
		<li>使用兼容的酶标仪在 550 nm 波长下读取各孔的吸光度值。随后绘制标准曲线，并确定未知样品的浓度 [µg/µL]。</li>
		<li>为计算每只果蝇平均体重中的 TAG 含量，请使用以下公式： 
		<img alt="生物学研究中甘油三酯含量公式，TAG浓度方程示意图。" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2"> 
		注：在本实验方案中，3 只果蝇在 600 µL PBT 中被研磨，因此每只果蝇的平均体积为 200 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bradford 法测定蛋白含量并以蛋白含量归一化 TAG 含量
	<ol>
		<li>使用 PBT 缓冲液配制七种牛血清白蛋白（BSA）标准品稀释液，每种 100 µL（75 µg/mL；100 µg/mL；150 µg/mL；200 µg/mL；250 µg/mL；500 µg/mL；1,000 µg/mL）。</li>
		<li>取一个新的 96 孔板，使用多通道移液器向每行各孔中加入 200 µL 的 1× Bradford 试剂。</li>
		<li>在第一行第一孔中加入 10 µL 的 PBT 缓冲液作为空白对照。通过上下吹打混匀，避免产生气泡。</li>
		<li>向第一行其余各孔中分别加入 10 µL 的各标准品稀释液，并通过上下吹打混匀，避免产生气泡。</li>
		<li>使用多通道移液器，将研磨板中每行的果蝇上清液各 10 µL 转移至 96 孔板的对应行中。通过上下吹打充分混匀，避免产生气泡。</li>
		<li>在 96 孔板上方覆盖一层透气封板膜。</li>
		<li>在室温下孵育 5 分钟。若孔中有气泡，需以 2,000 × g 离心 2 分钟以去除气泡。 
		注：气泡的存在会影响吸光度读数。</li>
		<li>使用分光光度计在 595 nm 波长下读取空白对照、标准品及未知样品的吸光度值。利用标准曲线确定每行样品的浓度 [µg/µL]。</li>
		<li>使用以下公式，以蛋白含量对 TAG 含量进行归一化： 
		<img alt="生化分析中蛋白相对TAG含量的计算公式，[TAG]/[Protein] 比值公式。" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Na, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+model+of+high+sugar+diet-induced+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy.</a> PLoS Genet. 9, 1003175(2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小鼠肥胖诱导可能需要数月时间19,20在果蝇中，该高脂饮食喂养方案可在数天甚至更短时间内诱导脂肪过度积累，仅在18小时后即可观察到脂肪积累增加（参见 图2）。采用所述方案进行HFD喂养可增加葡萄糖含量 12 并减少 Bmm 脂酶和PGC-1表达24。这与成年个体的禁食情况相反 果蝇 导致脂肪和葡萄糖含量迅速下降25,26 且增加 Bmm 表达24。此外，升高 Bmm 或 PGC-1 水平可抵御高脂饮食诱导的肥胖14,<sup class="xref...

我们正处在一个肥胖及其相关经济负担成为全球性问题的时代1。每三个美国人中就有两个超重或肥胖，并伴有相关的心脏病理问题，而心血管疾病是成年人群死亡的首要原因2。为了充分研究代谢综合征调控中涉及的遗传和分子组分，亟需开发高效的新方法，并利用模式生物进行探索。因此，我们选择果蝇 Drosophila 作为模型，因为它与哺乳动物（包括小鼠和人类）共享最基本的生物学过程3,4,5,6。Drosophila 的基因组在进化过程中高度保守，但总体上更小，基因重复较少，代谢也更为简单，这使其成为研究多种人类疾病基本机制的理想模型4,7,8。此外，果蝇体内也存在类似于脂肪组织、肠道和胰腺所执行的特征性生理过程，并在葡萄糖和脂质代谢等调节功能中发挥与人类相似的作用9,10,11。更重要的是，人类肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病调控中涉及的基本分子通路在 Drosophila melanogaster 中功能上是保守的12,13,14,15,16。与高等生物类似，Drosophila 拥有跳动的心脏，其发育过程与哺乳动物心脏的形成过程相似3,17。因此，建立一种可靠的高脂饮食（HFD）喂养方案以及适用于高效筛选的高通量TAG检测方法，并结合 Drosophila 的遗传工具箱，为研究和理解复杂代谢性疾病的遗传基础提供了重要手段。
高脂饮食（HFD）本身由标准的实验室果蝇食物添加椰子油制成，而椰子油主要由已知与代谢综合征相关的饱和脂肪酸组成18。在哺乳动物模型（如啮齿类动物）中诱导肥胖可能需要数月时间19,20，而我们在Drosophila中优化的高脂饮食喂养方案可在数天内有效且可重复地增加个体的脂肪含量12,14。该方案结合高通量TAG检测，可高效地大规模筛选遗传因素、环境影响及药物候选物对脂肪代谢的调节作用，从而发现新的脂肪代谢调控因子。因此，这些方案可能有助于理解及/或防治肥胖及其相关的人类疾病。
喂养方案具有多功能性，可用于研究单一饱和或不饱和脂肪酸的代谢和功能效应。这种高通量TAG检测方法的应用不仅限于 D. melanogaster，但可适用于多种具有角质层或坚韧细胞外基质的小型模式生物（例如，其他 黑腹果蝇 物种， 秀丽隐杆线虫 以及其它新兴无脊椎动物模式生物）在不同环境、遗传或生理条件下，于发育、成年或代谢疾病任一阶段测量脂肪含量。TAG 检测基于比色法测定一系列酶促反应，这些反应将 TAG 降解为游离脂肪酸、甘油、甘油-3-磷酸，最终生成 H2O2 与4-氨基安替比林（4-AAP）和3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠（3,5 DHBS）反应生成红色产物，使用96孔分光光度计测定。

<table><tbody><tr><td>塔尔博伊兹球形滴管/珠子分配器</td><td>Talboys</td><td>#: 930150</td><td></td></tr><tr><td>塔尔博伊兹高通量均质仪</td><td>Talboys</td><td>#: 930145</td><td></td></tr><tr><td>研磨珠，不锈钢&amp;nbsp;</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td># GBSS 156-5000-01</td><td>5000 颗珠子</td></tr><tr><td>96 孔深孔微孔板，Masterblock</td><td>Greiner Bio-One</td><td># T-3058-1</td><td>每箱 80 块板</td></tr><tr><td>Greiner&amp;nbsp; 96 孔平底微孔板</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M4436</td><td>40 块板</td></tr><tr><td>Greiner 多孔板密封盖膜</td><td>Sigma Aldrich</td><td># C3606</td><td>50 片密封膜</td></tr><tr><td>试剂储液槽&amp;nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td># 1192T71</td><td>每包 12 个</td></tr><tr><td>赛默飞世尔 Finnpipette 4661040</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661040</td><td>1-10 µL 多通道移液器</td></tr><tr><td>赛默飞世尔 Finnpipette 4661070</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661070</td><td>30-300 µL 多通道移液器</td></tr><tr><td>赛默飞世尔 Finnpipette 4661020</td><td>Thermo Scientific</td><td>#4661020</td><td>10-100 µL 多通道移液器</td></tr><tr><td>多通道移液器吸头</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3131-S</td><td>适用于 10 µL 移液器</td></tr><tr><td>多通道移液器吸头</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3133-S</td><td>适用于 200 µL 移液器</td></tr><tr><td>多通道移液器吸头</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>#P1125</td><td>适用于 100 µL 移液器</td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td>Roboz Surgical</td><td># 5 Dumonts</td><td>超细镊子</td></tr><tr><td>梅特勒托利多 Excellence XS 分析天平，制造商编号 XS64</td><td>Cole-Parmer 科学专家</td><td># EW-11333-00</td><td></td></tr><tr><td>梅特勒托利多 Excellence XS 顶部加载天平</td><td>Cole-Parmer 科学专家</td><td># EW-11333-49</td><td></td></tr><tr><td>96 孔微孔板离心机</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td># Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td># SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line 台式轨道环境摇床培养箱</td><td>Biostad</td><td># 3527</td><td></td></tr><tr><td>Infinity 甘油三酯试剂</td><td>Thermo Scientific</td><td># TR22421</td><td></td></tr><tr><td>甘油三酯标准品</td><td>Stanbio</td><td>#2103 - 030</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford 蛋白检测试剂盒</td><td>Bio-RAD</td><td># 500-0205</td><td>1 倍染料试剂</td></tr><tr><td>椰子油</td><td>Nutiva</td><td># 692752200014</td><td>15 盎司罐装</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Thermo Scientific</td><td># AM9625</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>透气箔膜</td><td>Macherey-Nagel</td><td># 740675</td><td>50 片</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>VWR</td><td># 28317-241</td><td>每包 100 张</td></tr><tr><td>果蝇培养管</td><td>Genesee Scientific</td><td>货号 #: 32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start 牛血清白蛋白标准品</td><td>Bio-Rad</td><td># 5000206</td><td></td></tr><tr><td>FlyNap 麻醉剂</td><td>Carolina</td><td># 173025</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Kimwipes 低尘擦拭纸</td><td>Uline</td><td># S-8115</td><td>单层，4.4 x 8.4&quot;</td></tr></tbody></table>

高脂饮食喂养及高通量三酰甘油检测在drosophila melanogaster中的应用

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

心脏病是全球人类死亡的首要原因。大量研究表明，肥胖与人类心脏功能障碍之间存在密切关联，但要更深入阐明其中涉及的机制，仍需更多工具和研究投入。一个多世纪以来，遗传上高度可操作的模式生物果蝇（Drosophila）在发现关键基因和分子通路方面发挥了重要作用，这些基因和通路在不同物种间高度保守。许多生物学过程和疾病机制在果蝇中具有功能上的保守性，例如发育（例如，体轴模式、心脏）、癌症以及神经退行性疾病。近年来，对模式生物中肥胖及其继发性病理（如心脏病）的研究，在识别与人类代谢综合征相关的关键调控因子方面发挥了极为关键的作用。
在此，我们建议将该模式生物作为一种有效工具用于诱导肥胖， 即，过量脂肪积累，并建立一种高效监测以甘油三酯（TAGs）形式积累的脂肪含量的方案。果蝇除了具有高度保守但相对简单的基因组外，还具有较短的寿命，便于快速开展实验，且成本低廉。本文提供了一种高脂饮食（HFD）喂养的详细实验方案 果蝇 通过诱导肥胖并采用高通量三酰甘油（TAG）检测方法来测量脂肪含量的相应增加，旨在实现高度可重复性和高效性，适用于大规模的遗传学或化学筛选。这些实验方案为高效研究肥胖相关调控机制提供了新的机会，同时也为药物发现研究提供了标准化平台，可用于快速测试候选药物对肥胖、糖尿病及相关代谢性疾病发生或预防的影响。

在D. melanogaster中，与其他物种一样，雄性和雌性之间存在性二型性22。众所周知，雌性个体体型较大，腹部脂肪含量高于雄性22。为了验证我们实验方案的有效性，我们进行了甘油三酯（TAG）检测，以确定标准实验室野生型（w1118）果蝇雌雄个体之间TAG含量的差异。结果显示，雌性果蝇的整体脂肪含量高于雄性（图2A, B）。数据还表明，该检测方法具有良好的稳定性，在孵育后长达50分钟内TAG定量结果无变化，且不因生物样本数量（3只或5只果蝇）不同而产生差异。
HFD 摄入已被证明可导致人类和小鼠肥胖19,<sup class="xref...

本实验方案是一种高脂饮食喂养方法，用于诱导Drosophila（果蝇）肥胖，以研究与脂毒性相关的基础分子机制。同时，本方案还提供了一种高通量的三酰甘油检测方法，可用于在不同饮食、环境、遗传或生理条件下，测定Drosophila及其他（昆虫）模型中的脂肪积累情况。

高脂饮食喂养及高通量三酰甘油检测在Drosophila melanogaster中的应用

心脏病是全球人类死亡的首要原因。大量研究表明，肥胖与心脏功能障碍之间存在密切关联……

本高脂喂养方案与高通量三酰甘油检测方法的总体目标是在果蝇（drosophila melanogaster）等模式生物中诱导肥胖，并在多种条件下监测其脂肪含量的相应变化。该方法有助于回答代谢领域中的关键问题，包括机体肥胖以及与糖尿病、代谢综合征、肝脏和心脏脂肪变性相关的器官特异性脂毒性。该技术的主要优势在于，可在数天内诱导果蝇体内脂肪过度积累，并在约一小时内同时测定其脂肪含量。该技术的应用意义在于代谢性疾病的诊断及其治疗，因为高通量实验方案可利用此模型系统加速药物发现研究。开始实验时，准备一千克高脂食物：使用分析天平分别称取700克预混果蝇食物和300克椰子油至两个独立容器中。将每个容器分别放入微波炉加热，直至内容物完全融化。将融化的椰子油倒入果蝇食物容器中，使用打蛋器搅拌内容物，直至油均匀混入果蝇食物中。重新称量高脂食物的重量。如果总重量不足一千克，可加入约10毫升水，使总重量恢复至一千克。接下来，将10毫升充分混合的高脂食物倒入每个小瓶中。用纱布覆盖食物，防止污染，并在室温下冷却一小时。冷却后，将小瓶转移至4摄氏度保存，可保存长达四周。使用 CO2 麻醉果蝇。从试管中收集 0 至 5 日龄的果蝇，并将其转移至含有预先温育的正常食物（NF）的新试管中。在 21°C 下继续培养果蝇 5 天。5 天结束后，从 4°C 取出含有高脂饮食（HFD）和正常食物（NF）的试管。使用擦拭纸清洁小瓶壁并去除多余的液体，以防止果蝇粘附在高脂食物上。将一块约一厘米乘三厘米的滤纸条插入高脂食物中，以吸收任何多余的液体。接着，将果蝇转移至高脂食物上。将小瓶水平放置于21至22摄氏度条件下五天。五天后，将正常饮食组（NF）和高脂饮食组（HFD）的果蝇转移至不含食物的新小瓶中，静置30分钟以排空肠道。随后进行果蝇称重。针对每种待检测的基因型和性别，使用超敏电子天平记录预先标记的空的1.7毫升离心管的重量。用毛刷将36只相同基因型、性别和饲喂状态的果蝇麻醉后收集至一个已称重的1.7毫升离心管中。然后，使用同一台超敏电子天平称量装有果蝇的离心管重量。将含有果蝇的1.7毫升离心管浸入液氮中两分钟，进行速冻。取出离心管并放入冻存盒中。随后，将冻存盒转移至-80°C超低温冰箱中保存，直至用于TAG检测。首先，从零下80摄氏度的超低温冰箱中取出冷冻的果蝇，并将试管置于冰上。将直径2毫米的金属研磨珠放入96孔球体分配器中，使用小号画笔移除多余的研磨珠。接着，将96孔研磨板倒置在球体分配器上方，翻转以将金属珠直接转移至研磨板中。确保每个孔中有一个研磨珠。然后，使用多通道移液器，向96孔研磨板的每列中加入600微升PBT。用镊子向每个孔中加入三只果蝇。在96孔研磨板的每一行或每一孔中注明果蝇的基因型、性别和食物状态。将盖子紧密地盖在96孔研磨板上，并在顶部贴上封口膜以确保无泄漏。将96孔研磨板正确放入研磨机中。将机器调至最高速度，按下运行键研磨果蝇3分钟。3分钟后，停止研磨，随后进行离心处理。离心后，小心操作研磨板，避免上清液与沉淀混合。使用多通道移液器，将 200 微升 TAG 试剂加入新的 96 孔分光光度计板的每一行中。向第一行的第一个孔中加入 20 微升 PBT，以制备空白对照。用移液器反复吹打混匀。将每种标准品稀释液各20微升加入第一行剩余的孔中，并用移液器反复吹打混匀。使用多通道移液器，从研磨板的每一行中吸取20微升上清液，转移至96孔光谱仪板中对应的行。用移液器上下吹打充分混匀。接着，将透气膜覆盖在96孔板上。在37摄氏度孵育10分钟。使用兼容的酶标仪在550纳米波长下读取每孔的吸光度。对标准实验室野生型果蝇进行TAG检测的结果显示，雌性个体的全身脂肪含量高于雄性个体。数据还表明，该检测方法具有稳定性，TAG定量结果不随时间变化，也不受生物样本量大小的影响。对高脂饮食（HFD）组和对照饮食组的雌性果蝇进行的TAG检测显示，在果蝇中摄入高脂饮食会导致脂肪含量增加，并随时间推移逐渐累积。仅摄入高脂饮食18小时后，果蝇体内的脂肪含量即出现显著上升。在进行该操作时，务必记住使用清洁彻底的培养瓶进行高脂饮食喂养。将果蝇储存于22摄氏度或更低温度下，在标签检测中移液时切勿将上清液与碎片混合。该技术开发完成后，为研究代谢及其相关疾病的研究人员提供了探索营养过剩影响以及脂肪积累的遗传基础和相关器官功能障碍（如果蝇中的脂毒性心肌病）的途径。

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

高脂膳食喂养和高通量三测定在果蝇中的含量

我们介绍了用于研究Caenorhabditis elegans脂质储存的可靠生化与显微方法。一种快速、简便的固定-染色法可利用亲脂性染料尼罗红（Nile...

秀丽隐杆线虫中脂肪含量的生化与高通量显微评估

本方案描述了一种高通量检测黑腹果蝇（Drosophila...

高通量检测方法用于分析个体产卵偏好 黑腹果蝇

斑马鱼正成为研究膳食脂质代谢和代谢性疾病的一个重要模型。本文介绍了富含脂质的幼体饲料制备、膳食荧光脂质类似物的活体成像以及摄食量定量等实验方案。这些技术可广泛应用于多种筛选、成像及基于假设的探究方法。...

幼年斑马鱼高脂喂养方案：喂养、活体成像及摄食量定量分析

本文介绍一种用于检测黑腹果蝇（Drosophila...

一种基于浮力的体脂含量测定方法 果蝇

我们描述了一种利用果蝇（Drosophila...

一种利用简易方法测量奖赏寻求行为变化的方式 黑腹果蝇

毛细管饲喂（CAFE）实验是一种简单、经济且高度可靠的用于研究摄食机制的方法。该方法结合高度多能的遗传模式生物Drosophila...

毛细管饲喂实验测定食物摄入量 黑腹果蝇

使用染色食物进行定量摄食检测，为评估摄食动机提供了一种可靠且高通量的方法。将食物消耗检测与热遗传学和光遗传学筛选相结合，是研究成年黑腹果蝇（Drosophila...

结合定量摄食检测与神经元强制激活技术研究食欲 果蝇

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本文描述了一种实验方案，可用于对暴露于不同宏量营养素质量食物的黑腹果蝇（Drosophila...

使用 Drosophila 幼虫进行热遗传神经元筛选时宏量营养素摄入量的定量分析

我们介绍一种果蝇的双选进食实验方案。该进食实验操作快速简便，不仅适用于小规模实验室研究，也适用于果蝇的高通量行为筛选。...

一种快速的食物偏好检测方法 果蝇

微孔板喂食实验提供了一种经济、高通量的方法，用于定量果蝇（Drosophila）的液体食物摄入量。该方法使用一个3D打印装置，将饲养果蝇的96孔微孔板与另一个含有含示踪染料喂食溶液的1536孔微孔板连接。通过分光光度法测量溶液的体积减少量。...

一种用于定量摄食行为的高通量微孔板饲喂检测法 果蝇

了解利用高脂膳食喂养和高通量三酰甘油测定在果蝇中诱导肥胖的方法。该技术可在数天内快速积累脂肪并在一小时内完成检测，为代谢疾病和脂毒性研究提供高效工具。

高脂饮食喂养及高通量三酰甘油检测在Drosophila melanogaster中的应用

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