用荧光显微镜监测对称和非对称溶液条件下带电泡的相行为

该方案的总体目标是定量评估在生理条件下发现的高盐度环境和跨膜溶液不对称性对膜相状态的影响。细胞内和细胞外的溶液非常不同。我们的方法有助于了解溶液不对称法对膜性质和相行为的影响。

我们方法的主要优点是可以在生理缓冲条件下制备囊泡，并且微流体装置可用于创建不对称缓冲条件。要开始该过程，请用细砂纸将 PTFE 板的一侧弄粗糙。用市售洗洁精、乙醇和氯仿清洗板、15 毫升玻璃瓶和可密封玻璃容器清洗板

使用 25 微升玻璃注射器将 10 至 15 微升氯仿脂质原液沉积到干净、干燥的 PTFE 板的粗糙面上。用注射器针头涂抹脂质原液，以形成均匀的脂质膜。使用镊子将板转移到 15 ml 样品瓶中。

在 60 摄氏度下加热板并干燥 2 小时以蒸发溶剂。然后，将去离子水加入玻璃容器中，高度约为 1 厘米。将装有板的小瓶放在容器中，确保其保持稳定和直立并密封容器。

让脂质双层在 60 摄氏度下预膨胀 4 小时。然后，从容器中取出样品瓶。将 5 毫升溶胀溶液吸入塑料注射器中，并在注射器尖端上安装 0.45 微米过滤器。

将过滤后的溶胀溶液添加到小瓶中以水合脂质膜。盖上样品瓶盖，并用塑料石蜡膜密封样品瓶。将小瓶在 60 摄氏度下储存过夜以获得 GUV 聚集体。

将囊泡从火中移开后一小时内冷却至室温。切掉 200 微升塑料微量移液器吸头的末端，以便将 GUV 聚集体吸入吸头中。使用修剪过的移液器吸头将聚集体和 50 μL 溶胀溶液转移到干净、干燥的 2 mL 样品瓶中。

向小瓶中加入 950 微升新鲜溶胀溶液或等渗溶液，以分别获得对称或不对称溶液条件。上下移液混合物，然后轻轻倒置小瓶数次以重悬 GUV。要开始评估，请将等分试样的 GUV 悬浮液放入显微镜载玻片中的硅胶隔离器中。

用盖玻片密封腔室。让样品重新平衡 5 分钟。然后，将载玻片放在荧光显微镜的样品台上，并采集每批至少 30 个 GUV 的图像。

检查映像以确定映像 GUV 的相位状态。单一液相状态的 GUV 将是球形和光滑的，荧光标记均匀分布在整个膜中。处于液体有序和无序两相状态的 GUV 将是球形的，荧光标记被划分在膜内具有平滑边界的结构域中。

验证结构域是否可以在囊泡表面自由扩散并且可以聚结。两相或三相固液相状态的 GUV 将带有一些角度边界的圆角。固体背景上的液体域不应显示扩散，但固体域应在液体背景上自由扩散。

确定每个图像 GUV 的相位状态后，确定该批次的主要相位状态。如果优势相态是微弱多数，则用独立样品重复该过程。在使用微流体装置之前，请准备至少 5 毫升蔗糖和盐溶胀溶液。

通过 0.45 微米过滤器过滤每种溶液。接下来，修剪 200 微升塑料移液器吸头的末端，并将移液器吸头放入设备的每个通道中。向设备储液器中加入 100 微升用于制备 GUV 的相同类型的新鲜过滤溶胀溶液。

向每个移液器吸头中加入 5 微升溶胀溶液。将装置以 900 倍 G 离心 10 分钟，以填充装置通道。然后，用相同的过滤溶胀溶液填充 1 毫升玻璃注射器。

将一段管路连接到注射器。将溶胀溶液推入管路，直到柱塞完全压下并且管路中充满溶液。然后，将管路连接到出口通道，并将注射器安装在注射泵上。

接下来，将压力控制单元连接到微流体通道入口。确保阀门已关闭，然后将压力设置为 3 巴。将微流体装置放在倒置共聚焦显微镜的样品台上。

使用移液器从设备储液器中取出溶胀溶液，直到只剩下 25 至 50 微升溶液。向储液槽中加入 150 微升 GUV 悬液，并将悬浮液与温和移液混合。以每分钟 10 微升的速度在抽取模式下运行注射泵 20 分钟，或直到超过 90% 的设备捕集阱被占用。

然后，打开压力控制单元阀以关闭微流体装置中的环形阀。停止注射泵并让设备静置一小时，然后再获取设备中 GUV 的共聚焦图像。接下来，使用移液器从储液器中取出 GUV 悬液，只留下 25 至 50 微升。

向储液器中加入 150 微升其他类型的过滤溶胀溶液，然后轻轻上下移液混合物。重复此过程至少五次，以完全更换储液槽中的溶液。以 10 μL/min 的速度在抽出模式下运行注射泵 10 分钟，以更换微通道中的溶液。

然后，将流速降低至每分钟 1 微升。关闭压力控制单元阀 2 秒钟，然后打开阀门并停止注射泵。在记录共聚焦图像之前，让设备静置一小时。

要开始准备温度控制室，首先将带刺的管接头连接到带有两个毫米厚盖玻片窗的铝制热流组件上。将橡胶垫片连接到其中一个盖玻片上以形成观察室。将 100 微升 GUV 悬浮液加载到观察室中，并用盖玻片密封腔室。

慢慢反转组件。将铝制腔室连接到外部水浴。将组件安装在显微镜样品台上。

将外部水浴设置为所需的最低温度，并让系统平衡 10 到 15 分钟。获取 GUV 的图像并确定不同温度下的相态。由不同比例的 DOPG 和鸡蛋鞘磷脂和胆固醇在对称蔗糖或盐溶液中制备 GUV。

通过荧光显微镜确定它们的优势相状态。然后通过稀释将选定的组合物转移到不对称条件下，以评估有效的溶解条件对相行为的影响。为了进一步研究不对称溶液中的 GUV 相行为，将 GUV 捕获在微流体装置中，以允许完全交换外部溶液。

流体交换前后通过共聚焦显微镜评估捕获的 GUV。在一定温度范围内监测均相分离 GUV 的比例，以评估 GUV 相行为的有效温度。在数据中观察到 S 形图案，然后将其拟合到玻尔兹曼模型。

从拟合曲线确定相分离 GUV 分数为 0.5 的温度。虽然这种方法可以深入了解膜相行为，但这些应用也可用于其他实验，例如研究生理条件下生物分子中膜之间的相互作用。