Name: 用荧光显微镜监测对称和非对称溶液条件下带电泡的相行为 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 了解如何利用荧光显微镜定量评估高盐度和跨膜溶液不对称性对巨型单层囊泡相行为的影响。该方法可在生理缓冲条件下制备囊泡，并通过微流控装置创建不对称环境，为膜生物学研究提供重要工具。

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本工作属于 MaxSynBio 联盟的一部分，该联盟由德国联邦教育与研究部和马克斯·普朗克学会共同资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

在对称和非对称高盐条件下成功制备用于相态观察的GUVs
本文介绍的方案提出了一种策略，用于评估高盐缓冲液和溶液不对称性在广泛组分范围内对带电GUVs膜相态的影响。实现这一目标的主要挑战之一是在高盐缓冲液中制备带电GUVs。
我们通过一种简单的自发溶胀法，在蔗糖溶液和高盐缓冲液中成功制备了大单层囊泡（GUVs），该方法包括脂质膜的预水合步骤以及过夜的最终水合生长步骤。需要注意的是，脂质沉积应于经粗糙化处理的聚四氟乙烯（PTFE）板上进行，以确保脂质均匀铺展，从而形成单层囊泡。此外，囊泡制备过程中的每一步操作都必须在脂质膜处于均一且流动相态的温度下进行；否则，囊泡群体可能在组成上呈现多分散性，进而影响最终群体相态分析的准确性。该自发溶胀法的具体方案所获得的囊泡呈团块状，一方面可将其重悬于小体积溶液中以获得高浓度的囊泡分散液，另一方面可在膜两侧形成不对称的溶液环境，同时最大限度减少囊泡的稀释8,28。在进行囊泡稀释或外部溶液置换时，必须确保内外渗透压保持一致，因为渗透压失衡所引起的形态变化可能诱导或抑制Lo与Ld相的分离41，或在低渗条件下导致囊泡破裂。
在此，尝试在高盐溶液中优化电形成方案未能生成任何GUVs，而采用PVA辅助溶胀法则产生了多层囊泡。尽管自发溶胀法制备带电囊泡所需时间较长，且所得囊泡批次质量较低10,17，但其成功制备仍具额外优势。该方法操作简便，即可获得足够用于统计批次分析的产量；与电形成法不同，无需复杂设备或优化过程。此外，未观察到脂质氧化污染现象42,43。根据文献报道，囊泡与其来源脂质储备液之间的脂质组成无差异7,17。此外，在PTFE基底上形成囊泡不会引入任何污染物，而凝胶辅助溶胀法可能因基底引入外来分子23。电形成法还存在其他缺陷，例如在建立不对称溶液条件时会导致囊泡过度稀释。通过电形成法制备的GUVs通常呈均匀分散状态（与自发溶胀过程中形成的高浓度团状囊泡悬浮液相反）。对外部溶液的任何稀释均会显著降低囊泡数量。此外，在本研究过程中观察到，通过电形成法在蔗糖溶液中制备的DOPG/eSM/Chol GUVs，若稀释于高盐缓冲液中则变得不稳定。显微镜载玻片上脂质斑块的荧光表明，囊泡在被观察前即已破裂。此类不稳定性可归因于电形成法制备的囊泡膜张力高于自发溶胀法制得的囊泡10。
尽管通过囊泡稀释来创建不对称的大单层囊泡（GUV）溶液条件是一种简便快速的方法，但该方法仅能实现部分外部溶液的置换，尽管置换比例较高（此处为95%，图2），因为在稀释过程中，仍会残留少量溶胀溶液。外部溶液置换程度的选择需在以下两者之间权衡：一是将囊泡团块连同溶胀溶液一并吸起（第2节），二是避免过度稀释。因此，我们引入了一种替代性的微流控方法，该方法在其他地方已有详细讨论37，可在观察GUV相态时实现快速且完全的外部溶液置换，以验证在稀释囊泡中所获得的相态观察结果。实验确实观察到，从对称到不对称溶液条件转变时的相态变化结果一致。此外，本文所示的两种生成不对称溶液条件的方法均同样快速（参见文献8），且均无已知的局部组成改变风险（参见文献30,31）、膜张力升高风险（参见文献32）或局部加热风险（参见文献33），而这些风险存在于引言中讨论的其他替代方法。在微流控捕获过程中，囊泡内外的渗透平衡不仅对于避免上述相态伪影至关重要，而且由高渗溶液条件引起的脱水可能导致囊泡在外部溶液置换后从捕获柱间滑脱。
尽管自发溶胀法已成功用于从DOPC/eSM/Chol体系生长出不带电荷的囊泡，但在其他情况下，由于缺乏各双分子层之间的排斥作用，无电荷可能导致GUV溶胀效果不佳44。延长预溶胀时间或引入体积较大的脂质头基可能有助于缓解这一问题45。此外，囊泡在不同于溶胀所用溶液的介质中稀释后的稳定性，可能因脂质组成和稀释介质的不同而有所差异，这一点我们尚未研究。我们亦未探索通过本研究中所介绍的制备方法调节GUV平均直径的可能性。但囊泡组成和溶胀溶液等参数可能会影响实验结果。采用其他替代方法46可能在本研究使用的脂质和溶液条件下产生更大的囊泡，但这些方法可能伴随其他与技术本身相关的问题。上述在对称和非对称高盐条件下制备GUV的方法，为研究由不同脂质组成构成并分散于不同介质中的囊泡提供了潜在工具。由于我们尚未探索这些可能性，未来实验将揭示该GUV制备与稀释方法的普适性程度。
在不同温度下观察相分离现象
存在多种适用于在不同温度下研究GUV的实验装置。尽管这些装置在文献中通常未被详细描述，但本研究介绍了一种适用于此类研究的基础组装方案。
对照测量结果表明，该自行设计和搭建的腔室温度由恒温器精确控制，腔室内部的温度梯度在实验温度分辨率范围内。这确保了实验热条件与恒温器读数一致。
在对 GUV 相态进行宽温度范围评估时，重要的是在温度改变后，所观察的囊泡应达到充分的平衡状态。确保这一点的一种可行方法是检测滞后现象。如果存在滞后现象，应减小温度变化步长和/或延长平衡时间。由于本研究中的温度控制是通过水浴恒温系统实现的，因此工作温度范围理想情况下应限制在 0 - 100 °C该范围可通过使用其他温控液体（如油）或采用其他装置进一步扩展， 例如 一个帕尔帖装置。实际上，工作温度还受限于可能发生的冷凝或蒸发现象。此外，当温度远离室温时，观测腔内出现稳定的温度梯度的可能性增加。同时，成像设备在极端温度下可能受到损害。对于脂质囊泡研究通常适用的温度范围（~10 - 50 °C7,9) 应考虑对观测设备造成损坏的可能性，但通常情况下并不预期会发生。
囊泡结构域观察中的伪影
使用宽场荧光显微镜时，存在多种可能导致观察伪影的来源。首先，应认识到用于囊泡相态目视检测的物体其最大分辨率 r 决定了脂质结构域的检测极限，其关系如下： 
<img alt="分辨率极限公式：r=0.61λ/NA，用于显微镜中确定光学分辨能力。" src="/files/ftp_upload/56034/56034eq2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
其中 λ 为发射波长，NA 为物镜的数值孔径。一个典型的 40 倍放大、NA 为 0.6 的物镜，在检测波长约为 560 nm 的绿色发射光时，其光学分辨率约为 0.6 µm。因此，在不同条件下比较由特定脂质混合物制备的囊泡相态的研究中，应针对同一种脂质混合物使用相同的物镜。
另一种伪影是由于长时间暴露于激发光下导致脂质发生光氧化，从而形成脂质区域41。光损伤优先发生在不饱和的脂质烃链部分。事实上，对于某些脂质组成，在长时间激发光照射后（约30秒），原本均一的囊泡中出现了相分离区域。为避免这一问题，在评估相态时，激发光仅在同一视野内聚焦数秒。因此，DiIC18适用于本研究目的。然而，其他染料可能对光更为敏感，需在更低的激发光强度下操作，并缩短激发光照射时间。
移液器转移囊泡时产生的机械剪切应力可能会暂时混合相区，从而扭曲囊泡相行为的真实表观。在某些批次中，不同囊泡在移液转移至显微镜盖玻片后0分钟和5分钟时表现出不同的相行为。此外，微流控装置中流体流动所诱导的剪切应力也已被证明会导致相区混合47。在观察前，应让囊泡保持静置足够长的时间以达到平衡状态。在本研究中，囊泡加载并完成溶液置换后，微流控装置上被捕获的囊泡在观察前保持静置1小时。
为避免上述部分困难以及光衍射极限所带来的限制，可采用核磁共振波谱法48或超分辨率显微成像技术49等替代方法。
结论与展望
本研究展示了一系列方法，可用于分析高盐对称与不对称溶液条件对膜相分离的影响。所有所述方法均适用于其他应用场景。例如，微流控装置提供了一个平台，可用于研究在诱导溶液不对称性后，相区形成与消失的动力学过程。此外，也可通过该方法考察相区出现与盐浓度之间的关系。所有这些方法还可用于研究其他感兴趣溶液对相行为的影响。

自从通过荧光显微镜观察到液-液相分离的巨型单层囊泡（GUVs）中存在微米尺度的结构域以来，GUVs 便被&#160;用作研究脂筏假说的模型体系1,2,3。由于其游离双分子层的面积范围与生物细胞相近，因此它们是模拟含有假定脂筏结构的细胞质膜的合适模型。已有大量针对此类 GUVs 的研究在纯水、蔗糖溶液或低盐溶液中分散的囊泡上开展4,5,6,7,8。然而，这些条件并不能反映生物膜在生理条件下所处的高盐环境以及跨膜溶液不对称性，而这正是细胞所处的真实环境。
在本研究及本课题组此前发表的一篇文献9中，研究了盐的存在以及膜两侧溶液不对称性对带电多组分大单层囊泡（GUV）相态的影响。GUV由不同比例的二油酰基磷脂酰甘油（DOPG）、蛋鞘磷脂（eSM）和胆固醇（Chol）混合制备，脂质膜分别置于蔗糖溶液（渗透压为210 mOsm/kg）或高盐缓冲液（100 mM NaCl，10 mM Tris，pH 7.5，210 mOsm/kg）中。选择这些脂质是基于已有研究对该混合物相图所获得的数据6,8。
文献中报道了多种制备GUVs的方法10,11,12（需注意，本文不讨论涉及将脂质从油相转移至水相的方法13,14，因为膜中残留的油分可能影响相行为，存在固有风险）。在高盐缓冲液中制备GUVs面临特定挑战。对于低离子强度溶液，电形成法15,16是一种快速、高产且缺陷较少的GUVs制备方法10,17。该方法基于将脂质层沉积在导电表面（电极）上，干燥后在施加交流电场的同时用水性溶液进行水合。然而，若水溶液中含有盐，则该方法需要进行相应调整18,19。通常认为，电形成过程中囊泡生长的驱动力是电渗作用16，而高电导率会抑制电渗效应20。因此，在高盐溶液中通过电膨胀法制备GUVs并非直接可行，需针对溶胀液中不同的盐浓度进行优化。凝胶辅助囊泡溶胀法21,22是电形成法的一种潜在替代方案，且形成速度更快。该方法利用凝胶（如琼脂糖或聚乙烯醇（PVA））作为基底，增强脂质膜的水合效率。然而，该方法也存在风险，例如基于琼脂糖的溶胀可能导致膜污染23，而基于PVA的溶胀则受限于温度条件。类似地，近期已建立一种在纤维素滤纸基底上生长GUVs的方案24。该方法的普遍问题在于难以控制基底纯度，且需要使用大量脂质。在本研究中，我们将介绍并阐述最传统的GUVs制备方法——即自发溶胀法25,26的优势。该方法包括将脂质层干燥于疏脂性基底上，在水蒸气环境中进行水合，随后在目标溶胀溶液中进行溶胀（见图1及“实验方案”部分的详细说明）。该方法无法控制囊泡的尺寸分布，所得囊泡总体上比使用电场、聚合物基底或微流控辅助方法制备的囊泡更小。然而，其囊泡质量和尺寸适用于本研究中所探讨的膜相态分析。
在囊泡膜两侧形成溶液不对称性也面临某些挑战。一种常用的方法是将囊泡悬浮液直接稀释到目标外部溶液中27,28。然而，这种方法也会降低囊泡的分布密度。另一种策略是缓慢置换沉降在流动池底部的GUVs周围的外部溶液，以实现溶液的流入与流出。为了避免流动干扰甚至丢失囊泡，需采用低流速8，这使得该方法效率较低。此外，上述两种方法均不能保证完全更换外部溶液。一个显而易见的解决方案是固定囊泡，以避免在更换外部溶液时丢失。例如，可将生物素化的GUVs锚定在链霉亲和素包被的表面29。但这种方法可能导致附着区域与非附着区域的膜组成出现差异30,31。利用磁场或电场捕获囊泡会导致膜张力的施加32。使用光镊捕获囊泡需要连接一个手柄（i.e. 微珠），而使用光拉伸器则可能引起局部加热33。GUVs的捕获还可通过在铂丝上生长而不最终分离来实现34。然而，这种方法得到的囊泡并非孤立存在，通常通过细小的脂质管（tethers）与铂丝或其他囊泡相连。
本文介绍了解决上述局限性的策略。我们首先详细描述了一种经过改进和优化的自发溶胀法，该方法适用于在高盐缓冲液中高效制备大单层囊泡（GUVs）。随后，我们提出了两种通过简单稀释或使用微流控装置来有效建立不对称溶液条件的方法。由于我们的目标是在不同溶液条件下分析GUV膜的相态，后续部分阐述了成功进行统计分析的标准，并提供了避免错误分类的建议。
实验在等温条件以及不同温度条件下进行。尽管温度控制在实验中被广泛使用，但关于实验温控腔的详细描述却鲜有报道。本文介绍了一种自行搭建的装置，可用于在不同温度条件下观察GUVs。

<table><tbody><tr><td>1,2-二油酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)，钠盐</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475C</td><td>文中简称为 DOPG</td></tr><tr><td>鸡卵鞘磷脂</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td>简称为 eSM</td></tr><tr><td>胆固醇（绵羊毛，&gt; 98%）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>简称为 Chol</td></tr><tr><td>1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐</td><td>Molecular Probes</td><td>D-282</td><td>简称为 DiIC&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>氯仿，HPLC 级（&amp;ge; 99.8%）</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl（&gt; 99.8%）</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl（37%）</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris（&amp;ge; 99.9%）</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖（&amp;ge; 99.5%）</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>螺纹瓶，45×27 mm，15 mL</td><td>Kimble</td><td></td><td>平底苏打玻璃瓶，白色螺旋盖</td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Mettler Toledo</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td>渗透压仪</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat030</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer D1</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>40倍物镜，0.6 数值孔径</td><td>Zeiss</td><td>LD Achroplan</td><td></td></tr><tr><td>40倍物镜，0.75 数值孔径</td><td>Leica</td><td>506174</td><td></td></tr><tr><td>63倍物镜，0.9 数值孔径</td><td>Leica</td><td>506148</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片，56×26 mm，0.17 &amp;plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，22×22 mm，0.17 &amp;plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Bremix Flexible Packaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器，5 mL，10 mL</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>GVS North America</td><td>Cameo 25AS, 1213723</td><td>醋酸纤维，无菌</td></tr></tbody></table>

对称与非对称溶液条件下带电囊泡相行为的荧光显微镜监测

Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

由二油酰基磷脂酰甘油、蛋鞘磷脂和胆固醇形成的带电巨大单层囊泡（GUVs），表现出共存的液相有序和液相无序区域，是研究脂筏假说的常用生物物理工具。然而，许多研究忽略了生理溶液条件的影响。因此，本研究展示了高盐缓冲液以及跨膜溶液不对称性对这类带电GUVs中液-液相分离的影响。这些效应在等温及变温条件下均进行了研究。
我们介绍了适用于在对称和非对称高盐溶液条件下监测带电囊泡中共存液相区域稳定性的设备与实验策略。其中包括在高温条件下于高盐缓冲液中制备带电多组分大单层囊泡（GUV）的方法。该方案提供了一种通过简单稀释步骤部分置换外部溶液的选择，同时最大限度地减少囊泡的稀释。此外，还提出了一种替代方法，利用微流控装置实现外部溶液的完全置换。我们还在不同温度条件下研究了溶液对相分离的影响。为此，我们展示了自行构建的温度控制腔室的基本设计及其应用。此外，我们还讨论了GUV相态评估的方法、相关潜在问题及其规避策略。

关于相分离巨型单层囊泡（GUVs）的实验常常忽略了生理溶液条件。本研究提出了一种方法，用于探究高盐缓冲液对带电多组分GUVs中液-液相分离的影响，该影响随跨膜溶液不对称性和温度的变化而变化。

相分离的巨大单层囊泡（GUVs）表现出共存的液态有序和液态无序区域，是一种常用的生物物理工具，用于……

本实验方案的总体目标是定量评估生理条件下高盐环境及跨膜溶液不对称性对膜相态的影响。细胞内和细胞外的溶液存在显著差异。我们的方法有助于理解溶液不对称性对膜特性及相行为的影响。本方法的主要优势在于，可在生理缓冲条件下制备囊泡，并可利用微流控装置创建不对称的缓冲环境。开始实验前，先用细砂纸打磨聚四氟乙烯（PTFE）板的一侧表面。随后，用商用洗洁精、乙醇和氯仿清洗该板材、一个15毫升玻璃小瓶以及一个可密封的玻璃容器。使用25微升玻璃注射器将10至15微升溶于氯仿的脂质储备液滴加到洁净干燥的聚四氟乙烯（PTFE）板的粗糙面上。用注射器针头将脂质储备液铺展，形成均匀的脂质膜。使用镊子将板转移至15毫升小瓶中。将平板在60摄氏度下加热，并干燥两小时以蒸发溶剂。然后，向玻璃容器中加入去离子水，水位高度约为一厘米。将装有平板的小瓶放入容器中，确保其保持稳定且直立，并密封容器。将脂质双层在60摄氏度下预溶胀四小时。然后，将小瓶从容器中取出。用塑料注射器吸取五毫升溶胀溶液，并在注射器尖端安装一个0.45微米的过滤器。将过滤后的溶胀溶液加入小瓶中，以水合脂质膜。盖紧瓶盖，并用塑料石蜡膜密封小瓶。将小瓶于60 °C下孵育过夜，以获得GUV聚集体。从加热环境中取出后一小时内将囊泡冷却至室温。剪掉一个200微升塑料微量移液枪头的末端，以便将GUV聚集体吸入枪头中。用修剪过的枪头将聚集体及50微升溶胀溶液转移至一个洁净、干燥的2毫升小瓶中。向小瓶中加入950微升新鲜溶胀溶液或等渗溶液，分别以获得对称或不对称溶液条件。用移液器将混合液上下吹打，然后轻轻翻转小瓶数次，以重悬GUVs。开始检测时，取一份GUV悬液置于载玻片的硅胶隔离腔中。用盖玻片密封样品室。让样品重新平衡五分钟。然后将载玻片置于荧光显微镜的样品台上，每批次采集至少30个GUVs的图像。观察图像以确定巨型单层囊泡（GUV）的相态。处于单一液相状态的GUV呈球形且表面光滑，荧光标记在膜中均匀分布。处于液相有序与无序双相状态的GUV呈球形，荧光标记在膜内部分布成具有平滑边界的结构域。验证这些相区域能否在囊泡表面自由扩散并发生融合。处于两相或三相固-液相态的GUVs会呈现圆形，但具有一些棱角状边界。在固相背景上的液相区域不应表现出扩散现象，而固相区域则应在液相背景上自由扩散。确定每张图像中GUV的相态后，判断该批次的主要相态。若主要相态仅占微弱多数，则需使用独立样品重复该过程。在使用微流控装置之前，需分别准备至少五毫升的蔗糖和盐类溶胀溶液。将每种溶液通过0.45微米滤膜过滤。接着，剪去200微升塑料移液枪头的末端，并在装置的每个通道中放入一个移液枪头。向装置的储液池中加入100微升新鲜过滤的溶胀溶液，该溶液应与制备GUVs时所用的溶液类型相同。向每个移液枪头中加入五微升溶胀溶液。以900 × g离心10分钟，使装置通道充满溶液。然后，用同一过滤的溶胀溶液填充一支1毫升玻璃注射器。将一段管路连接到注射器上。推动溶胀溶液通过管路，直至活塞完全压下且管路内充满溶液。然后，将管路连接至出口通道，并将注射器安装在注射泵上。接下来，将压力控制单元连接到微流控通道的入口。确保阀门处于关闭状态，然后将压力设定为3 bar。将微流控装置放置在倒置共聚焦显微镜的样品台上。使用移液器从装置储液池中移除溶胀溶液，直至仅剩25至50微升溶液。向储液池中加入150微升GUV悬液，并用移液器轻轻吹打混合悬液。以10微升/分钟的速度运行注射泵的回抽模式，持续20分钟，或直至装置中超过90%的捕获陷阱被占据。然后，打开压力控制单元的阀门，以关闭微流控装置中的环形阀门。停止注射泵，并让装置静置一小时，随后采集装置内大单层脂质体（GUVs）的共聚焦图像。接下来，使用移液器从储液池中移除GUV悬液，仅保留25至50微升。向储液池中加入150微升另一种类型的过滤膨胀溶液，轻轻吹打混合液。重复此操作至少五次，以彻底置换储液池中的溶液。将注射泵设置为回抽模式，以每分钟10微升的速度运行10分钟，以置换微通道中的溶液。然后，将流速降低至每分钟1微升。关闭压力控制单元的阀门2秒，随后打开阀门并停止注射泵。让装置静置1小时，然后记录共聚焦图像。开始准备温度控制室时，首先将带凸缘的管接头连接到带有两毫米厚盖玻片窗口的铝制热流组件上。将橡胶垫片固定在其中一个盖玻片上，以形成观察室。向观察室内加入100微升GUV悬浮液，并用盖玻片密封观察室。缓慢翻转装置组件。将铝制腔室连接至外部水浴。将组件安装在显微镜载物台上。将外部水浴设置为最低目标温度，使系统平衡10至15分钟。采集GUVs的图像，并确定其在不同温度下的相态。GUVs由不同比例的DOPG、卵鞘磷脂和胆固醇在对称的蔗糖或盐溶液中制备而成。通过荧光显微镜确定其主要相态。随后通过稀释将选定组分转移至不对称条件下，以评估溶液条件对相行为的影响。为进一步研究不对称溶液中GUV的相行为，将GUV捕获于微流控装置中，以实现外部溶液的完全置换。通过共聚焦显微镜在流体交换前后对捕获的GUVs进行评估。通过监测一系列温度下均相GUVs与相分离GUVs的比例，以评估温度对GUVs相行为的影响。实验数据呈现出S形曲线，并进一步拟合至Boltzmann模型。从拟合曲线中确定相分离GUVs比例为0.5时的温度。尽管该方法可提供关于膜相行为的信息，但其应用也可拓展至其他实验，例如在生理条件下研究生物分子间膜的相互作用。

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