基于CRISPR/Cas9的原始生殖细胞移植实现育种跨越式发展 非洲爪蟾

跳跃式基因突变技术的总体目标是促进胚胎发生必需基因的突变品系的创建。该方法有助于回答发育遗传学及其他领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于，研究者可在 F1 代中获得必需基因的突变体。

开始本实验时，按照文本方案所述，在单细胞阶段向非洲爪蟾胚胎显微注射 Cas9-sgRNA 复合物。当胚胎发育至受精后 4.5 小时，即早期囊胚阶段 IX 时，将其从 25 °C 培养箱中取出，置于室温下继续发育。在受精后 5 小时开始进行移植操作，使用巴斯德移液管将一个未注射的胚胎转移至含有凹槽的 60 mm 琼脂糖培养皿中，作为移植物受体。

同时将一个PGC供体胚胎转移至培养皿中。使用镊子手动去除每个胚胎的卵黄膜。并将两个胚胎旋转，使其植物极朝上，便于手术操作。

接下来，在用毛环固定受体胚胎的同时，将眉刀的尖端插入植物极，位置略低于表面。通过快速向上的切割动作，在未来瓶状细胞将要形成并标记原肠孔的区域内部，做四个呈方形的浅层切口。当方形的四条边划定完成后，使用眉刀以类似的切割动作加深每个切口，深度约为到达囊胚腔底部距离的1/3至1/2。

通过在受体胚胎的深层植物极区域进行一次或多次水平切割，将植物极组织外植体游离出来。随后，迅速对PGC供体胚胎重复此操作，以获得大小相似的植物极组织片段用于移植。一旦含有PGC的组织从供体胚胎中取出，使用睫毛刀和毛环将外植体置于受体胚胎所创建的开口中。

使用眉毛刀的刀杆，将其与移植物表面平行，轻轻将移植物压入受体胚胎植物极表面的切口内。用毛发环轻柔地将供体胚胎的尸体沿琼脂糖表面滑动并移入孔中。确保尸体的开放性伤口朝向主体液体。

将受体胚胎滑入相邻的孔中，同样确保移植物的植物极组织朝向大量液体。对其他胚胎重复进行 PGCs 移植，以创建更多的移植尸体配对，直至胚胎发育至大约早期原肠胚阶段 10，在进行移植时将胚胎转移至空孔中。一旦移植物完全愈合固定，通常在移植后 30 至 45 分钟，使用巴斯德吸管将胚胎从凹槽中极为轻柔地转移至涂有琼脂糖的 24 孔板的各个孔中。

将胚胎旋转至植物极朝上，朝向大量溶液。将供体尸体和移植受体放置在相邻的孔中，以帮助追踪胚胎配对情况，并记录此信息。然后，将含有胚胎的24孔板转移至25°C培养箱中过夜。

次日，将每只移植受体（现处于早期尾芽阶段）转移至新鲜的、琼脂糖包被的六孔板中的单独孔内。继续培养经“跳跃”（leapfrogging）的胚胎，并根据正文方案对从尸体中提取的供体 DNA 进行分析。由于“跳跃”技术能够高效地将受体生殖系替换为突变等位基因，因此可在 F1 代获得突变表型。

如本表所示，Blitz 等人报道，在靶向酪氨酸酶基因座（该基因座对黑素细胞和视网膜色素沉着至关重要）的大多数 F0 动物中，通过与 tyr 缺失的白化动物进行远交测定，可观察到供体来源的突变基因组在生殖系中的传递率达到 100%。观看本视频后，您应能够充分掌握非洲爪蟾原始生殖细胞移植的操作方法。