Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

这些程序的总体目标是研究正常发育过程中胚胎和围产期主动脉壁的形成，以及疾病期间这一过程中的扰动。这种方法可以帮助回答血管发育领域的关键问题，例如，有助于胚胎和围产期血管培养基的细胞来源是什么。这些技术的主要优点是它们可以评估胚胎和围产期发育期间发生的平滑肌发病机制和形态发生。

这些技术的影响源于血管疾病的治疗，例如导致相扑细胞产生过多的周期性疾病的瓣上主动脉瓣狭窄。微型泵放置程序将由指导显微外科核心和耶鲁大学的研究科学家 Jiasheng Zhang 博士执行。首先在具有 Cre ER 的 2 至 6 个月大的小鼠和具有 cre 报告基因的小鼠之间建立交配对。

每天早上使用金属探针检查阴道塞，当检测到塞子时将女性与男性分开。对于早期胚胎诱导，将他莫昔芬腹膜内注射到怀孕的湿气中。为了标记妊娠中期到晚期的细胞并追踪它们在出生后小鼠中的命运或克隆性，将黄体酮注射到妊娠湿的腹膜腔中，与他莫昔芬以 1 比 2 的剂量比例无能。

要在适当的胚胎日期收获胚胎，请用 70% 乙醇清洁怀孕湿布的腹部，然后用剪刀打开腹部以去除子宫。使用镊子和立体显微镜从子宫中收集胚胎，小心地将它们与胎盘和卵黄囊分开。将胚胎在 4 摄氏度的 4% 多聚甲醛中固定 2 小时。

然后在 PBS 中洗涤 3 次以去除多余的固定剂。第三次洗涤后，将胚胎在 PBS 中的 30% 蔗糖中，在单独的 15 毫升试管中孵育，直到胚胎下沉。接下来，用最佳切割温度化合物填充塑料冷冻模具，最高可达最大体积的三分之二，并将一个胚胎垂直放置在每个模具中。

在室温下放置 10 分钟后，将组织直立置于 70% 乙醇干冰浴中冷冻，并将低温恒温器温度设置为 22 摄氏度。将组织块切片，在整个每个主动脉中生成 10 至 20 微米厚的横向组织切片，并在获得时在玻璃显微镜载玻片上捕获每个切片。采集完所有样品后，在室温下干燥载玻片 30 分钟，然后储存在 80 摄氏度下。

要对组织样品进行染色，请在室温下解冻载玻片，避光以避免荧光团漂白，并在 0.1%PBS twin 20 中洗涤载玻片。对于克隆分析，用适当的核染料对组织进行染色，并在荧光显微镜上直接对彩虹cre报告基因的其他荧光团进行成像。对于命运映射，使用 mTmG cre 报告基因，通过直接成像（有或没有免疫染色）可视化 GFP 表达。

要培养和移植胚胎主动脉，请将胚胎置于仰卧位，并在立体显微镜下将伸展的肢体固定在解剖板上。用剪刀从腹部穿过胸骨到上胸部做一个垂直切口。解剖出最细小的气管肺、食道、肝脏和肠道。

使用镊子轻轻地将心脏向腹侧拉动，用剪刀将主动脉从胸腔和腹腔的背侧解剖。在近端根部和腹部远端位置切开主动脉以释放它，并将收获的主动脉置于细胞培养罩中的无菌冰冷 PBS 中。短暂洗涤后，将主动脉转移到 24 孔板的一个孔中，该板含有补充有 0.5% PBS 的 DMEM 培养基，并将板置于细胞培养箱中长达 24 小时。

孵育结束时，用 PBS 洗涤主动脉 2 次，并将组织在 4% 多聚甲醛中固定 20 分钟。再洗涤 3 次 PBS 后，将主动脉转移到含有 30% 蔗糖碱 PBS 的 1.5 毫升试管中，直到组织下沉。对于围产期主动脉平滑肌细胞分离，使用 23 号针头刺穿出生后第 0.5 天小鼠的左心室，并使用塑料管将针头连接到含有 PBS 的无菌注射器，垂直保持在升高的位置，因此 PBS 通过重力流入左心室。

当肝脏变白时，使用镊子去除主动脉外膜组织并收获主动脉，就像刚刚演示的那样。在 500 微升消化液中解离主动脉组织，每 5 至 10 分钟手动摇动一次。45 分钟后，将试管转移至无菌细胞培养罩中，并使用 200 μL 移液器研磨组织浆液，直至获得单细胞悬液。

将细胞转移到 15 mL 锥形管中，然后加入 2 mL DMEM 并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于 3 mL 平滑肌细胞培养基中，并将细胞接种到 35 mm 培养板上。然后，将板放入 37 摄氏度的培养箱中，每三天刷新一次细胞培养基。

要放置皮下渗透微型泵，首先用剪刀剃掉麻醉小鼠的下背部，然后将鼠标置于加热手术板上的俯卧位。用 betadine 和异丙醇擦洗背部，然后将鼠标置于立体显微镜下。然后，用手术刀在距离尾巴根部约 3 到 5 厘米的嘴部做一个 0.5 到 1 厘米的水平皮肤切口，而不会损伤下面的肌肉。

将止血钳插入切口，打开和关闭止血钳钳口以形成皮下袋。将装满目标试剂的渗透微型泵插入口袋中，并使用 6 o 不可吸收缝合线闭合切口。然后，让鼠标通过监测恢复，直到达到胸骨卧位。

胚胎突变的基因编码细胞外基质蛋白，弹性蛋白，在胚胎第 15.5 天后开始，在主动脉内层积累过量的平滑肌细胞。在此过程中使用多色 cre 报告基因对平滑肌细胞进行克隆分析，表明细胞具有多种颜色，因此是多克隆的。免疫染色外植主动脉切片显示，弹性蛋白突变胚胎第 15.5 天主动脉在培养后 18 小时内变得肌肉发达和狭窄，这一过程因添加抗 antegrin β 3 阻断抗体而减弱。

从出生后 0.5 天从野生型小鼠的主动脉中分离的平滑肌细胞表达平滑肌细胞标志物，但不表达 CD31。从胚胎第 13.5 天开始，将整合素 β 3 抑制剂连续输注到妊娠湿液中，可显着减轻细胞外基质蛋白弹性蛋白突变小鼠的主动脉瓣狭窄和肌肉化过度。但不要改变野生型小鼠的主动脉。

一旦掌握，如果作得当，渗透微型泵放置技术可以在不到 10 分钟的时间内完成。遵循这些程序，这些方法也可以外推到研究平滑肌编码的、非血管的，例如胃肠道或肺部区域的组织。看完这个视频，你应该对如何进行体内胚胎拟合定位和克隆分析，培养外植胚胎主动脉、围产期主动脉平滑肌细胞和外植体皮下渗透微型泵有很好的了解。

不要忘记，与小鼠、他莫昔芬和固定减能剂一起工作可能很危险，并且在执行这些程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和穿实验服并格外小心。