Name: 使用体内和组织和细胞外植体方法研究胚胎和围产期主动脉的形态和发病机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 了解小鼠胚胎及围产期主动脉形态发生与发病机制的研究方法，包括体内克隆分析、命运图谱和主动脉外植体技术。这些方法有助于评估血管发育过程中的平滑肌病理发生，为血管疾病治疗提供理论基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢Dean Li分享其实验室关于主动脉平滑肌细胞分离的实验方案。本研究获得美国国立卫生研究院（R21NS088854、R01HL125815和R01HL133016，授予D.M.G.）、美国心脏协会（资助号14GRNT19990019，授予D.M.G.）以及耶鲁大学（A.M.获得Brown-Coxe博士后奖学金，D.M.G.获得启动资金）的经费支持。

所有小鼠实验方案均经耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 在体 内 胚胎命运图谱绘制与克隆分析
注意：我们已广泛使用这些方法来评估发育和疾病模型中细胞的起源及其克隆结构7,8,9,10。
<ol>
	<li>在携带 CreER 的小鼠与携带 Cre 报告基因的小鼠之间建立交配。 
	注意：使用 CreER 标记平滑肌细胞；Myh11-CreERT2 或 Acta2-CreERT2 小鼠11,12 常用于此目的。我们使用了ROSA26R-CreERT2小鼠13 用于广泛标记胚胎组织。
	<ol>
		<li>用于克隆分析时，使用多色Cre报告基因系统（例如， 彩虹（Rainbow [Rb]）小鼠8,14,15 用于命运图谱分析时，使用单色Cre报告基因（例如， ROSA26R-YFP 小鼠16或双色Cre报告基因ROSA26R-mTomato-mGFP（mTmG）17. 
		注意：本繁育方案使用 2 - 6 个月龄的成年小鼠（通常约 30 g），可获得携带 CreER 和 Cre 报告基因的胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用金属探针于早晨检查阴道栓，以检测到阴道栓的当天中午定为胚胎发育第 (E) 0.5 天。</li>
	<li>当检测到阴栓时，将雌性与雄性分开。</li>
	<li>配制4-羟基他莫昔芬和他莫昔芬工作液。
	<ol>
		<li>对于4-羟基他莫昔芬，将5 mg溶于50 µL 100%乙醇中，涡旋2分钟，然后加入450 µL玉米油。置于冰上，以输出功率2进行超声处理，每次10秒，循环间歇冷却，直至样品冷却。待样品完全溶解后（通常需超声4–5个循环），取200 µL超声处理后的溶液溶于1,800 µL玉米油中，配制成终工作液（4-羟基他莫昔芬，1 mg/mL）。</li>
		<li>对于他莫昔芬，用100%乙醇稀释至50 mg/mL，涡旋至完全溶解。再用玉米油稀释，配制成终工作液（他莫昔芬，10 mg/mL），于45 °C搅拌以确保完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于早期胚胎诱导，将4-OH-三苯氧胺经腹腔注射至妊娠母鼠体内。
	<ol>
		<li>在E5.5及之后使用4-OH-他莫昔芬注射（每只妊娠小鼠最多约150 µg，或约5 mg/kg体重），可获得存活的母鼠、胚胎和仔鼠。</li>
		<li>对妊娠约 E9 天及之后的胚胎母鼠，使用他莫昔芬，剂量为 0.5 - 1.5 mg（或 17 - 50 mg/kg）。所有注射均使用 30G 针头。 
		&#160;注意：通常在注射前通过 0.22 µm 滤膜过滤以对所有混合物进行灭菌。 &#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于克隆分析时，采用腹腔注射高剂量4-OH-三苯氧胺例如，5 mg/kg）或他莫昔芬（例如，50 mg/kg）以标记多种细胞。
	<ol>
		<li>为了标记单个细胞，需梯度降低4-OH-他莫昔芬或他莫昔芬的剂量，使其在目标组织中（即， 主动脉），几乎所有经分析的胚胎（如下所述，本节末尾）均未标记细胞或仅标记单一颜色的细胞；此为阈值剂量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了标记中期至晚期妊娠阶段的细胞，并追踪其在出生后小鼠中的命运或克隆性，可将孕酮与他莫昔芬按1:2（孕酮：他莫昔芬）的剂量比例同时注射至妊娠母鼠的腹腔内。 
	注意：他莫昔芬剂量为 17 - 50 mg/kg，孕酮剂量为 8.5 - 25 mg/kg（即，一半的他莫昔芬剂量）。黄体酮注射可使分娩延迟约1-2天。</li>
	<li>采用开放滴注法处死怀有目标日龄胚胎的母鼠，即将母鼠置于含有浸透未稀释异氟烷的棉球或纱布的容器中。通过打开胸腔诱发气胸、摘除重要器官 和/或颈椎脱位来确认死亡。</li>
	<li>用70%乙醇清洁腹部。使用剪刀切开腹部并取出子宫。从子宫中取出胚胎，并用镊子小心地将胚胎与胎盘和卵黄囊分离。</li>
	<li>在E15或更晚阶段通过颈椎脱位或使用手术剪刀或锋利刀片进行断头处死胚胎。 
	注意：胎龄小于E15的胚胎在母体安乐死后和/或从母体取出后会迅速死亡。</li>
	<li>将胚胎置于冰上预冷的PBS中，用剪刀剪取少量尾尖组织，用于CreER和Cre报告基因的基因型鉴定。</li>
	<li>在4 °C下用4%多聚甲醛固定胚胎2小时。用PBS洗涤胚胎三次，然后将胚胎置于15 mL离心管中，加入含30%蔗糖的PBS溶液进行孵育，直至胚胎沉底，此过程可能需要长达两天时间。</li>
	<li>将塑料冷冻模具用最佳切割温度（OCT）包埋剂填充至最大容量的2/3。将每个胚胎垂直放入模具中，完全浸没于OCT包埋剂内。室温（RT）孵育10分钟，以尽量减少气泡产生。</li>
	<li>将冷冻组织块直立置于干冰和70%乙醇混合液中速冻，随后于-80 °C保存。</li>
	<li>将冷冻切片机温度设置为 -22 °C，对组织块进行切片，获得贯穿整个主动脉的横切面，厚度为 10–20 µm。切片在室温下干燥 30 分钟，然后于 -80 °C 保存。</li>
	<li>室温避光解冻载玻片，以防止荧光染料淬灭。用含0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤载玻片。
	<ol>
		<li>用于克隆分析时，用DAPI（5 mg/mL）对载玻片进行细胞核染色，并直接成像彩虹Cre报告系统中的其他荧光素（Cerulean：最大激发波长433 nm，最大发射波长475 nm；mOrange：548 nm，562 nm；mCherry：587 nm，610 nm）。
		<ol>
			<li>使用正置荧光显微镜检测荧光染料时，采用以下滤光片：DAPI（激发波长最大值/带宽 350/50 nm，发射波长最大值/带宽 460/50 nm）、Cerulean（激发 436/20 nm，发射 480/40 nm）、Texas Red（激发 560/40 nm，发射 630/75 nm），以及用于区分 mCherry 与 mOrange 的定制滤光片（激发 577/10 nm，发射 630/50 nm）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用mTmG Cre报告系统进行命运图谱分析时，通过直接成像或免疫染色检测GFP（484 nm，510 nm）。若使用正置荧光显微镜成像，请采用GFP滤光片（激发光470/40 nm，发射光525/50 nm）。</li>
		<li>进行免疫染色时，将切片于4 °C与一抗孵育过夜，用含0.1% Triton X-100的PBS洗涤，随后与二抗孵育1小时。使用抗CD31抗体（终浓度0.0016 mg/mL）、抗GFP抗体（终浓度0.006 mg/mL）以及Cy3直接偶联的抗SMA抗体（终稀释度1:500）作为一抗，二抗选用直接偶联荧光染料的抗体（终稀释度1:500）（参见 材料表).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用直立荧光显微镜（放大倍数：4X - 20X）或共聚焦显微镜（10X - 63X）拍摄图像。高倍放大时，采用63倍油镜共聚焦物镜，数值孔径为1.4-0.6，帧尺寸为1,024 x 1,024像素。</li>
</ol>
2. 外植胚胎主动脉培养
注意：该方法此前曾用于评估整合素 β3 在离体 Eln(-/-) 胚胎主动脉狭窄中的作用9,18。
<ol>
	<li>按照上述步骤 1.8，通过过量吸入异氟烷处死 E15.5 的孕鼠。</li>
	<li>按照上述步骤 1.9 - 1.10，取出并处死胚胎。</li>
	<li>将胚胎仰卧位放置，并用大头针将伸展的四肢固定在解剖板上。在解剖体视显微镜下观察，使用剪刀从腹部经胸骨向上胸部做垂直切口。解剖去除胸腺、气管、肺、食管、肝脏和肠。</li>
	<li>用镊子轻轻将心脏向前腹侧牵拉，使用剪刀从胸腔和腹腔背侧分离主动脉。为释放主动脉，分别在近端根部和远端腹部位置剪断。</li>
	<li>将主动脉置于细胞培养超净台中预冷的无菌 PBS 中。将主动脉转移至 24 孔板，加入含 0.5% FBS 的 DMEM，在 37 °C 下培养最多 24 小时。 
	注意：培养基中可添加阻断抗体（例如，抗整合素 αvβ3 抗体，0.02 mg/mL9；参见材料表）或药理学试剂。</li>
	<li>用 PBS 清洗主动脉两次，然后用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤三次，将主动脉转移至含有 PBS 中 30% 蔗糖的 1.5 mL 离心管中。待主动脉沉底后，制备冷冻组织块，切片并进行免疫染色，具体操作如上述步骤 1.13 - 1.15 所述。</li>
</ol>
3. 从围产期主动脉中分离 SMC
注意：该方法目前正用于比较从Eln(-/-)和野生型围产期小鼠中分离的主动脉平滑肌细胞的生物学特性。
<ol>
	<li>在出生后第（P）0.5天处死一只小鼠幼崽，可通过颈椎脱位或使用手术剪或锋利刀片进行断头，具体操作如上文步骤1.10所述。</li>
	<li>执行步骤2.3，然后打开胸腔和腹腔，用23G针头穿刺左心室。使用塑料管将针头连接至装有无菌PBS的注射器，注射器垂直置于较高位置，使PBS依靠重力流入左心室。持续灌注无菌PBS直至肝脏变苍白。
	<ol>
		<li>用镊子去除主动脉外膜组织，并按照步骤2.4所述方法解剖主动脉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将主动脉置于含DMEM（500 µL）的单一消化液中，其中添加225 U/mL胶原酶、2.25 U/mL弹性蛋白酶和1×抗生素-抗真菌剂，在37 °C下消化45分钟。每5–10分钟手动振荡试管一次。</li>
	<li>在无菌细胞培养操作台中，使用200 µL移液器反复吹打消化后的组织，制备单细胞悬液。将单细胞悬液转移至15 mL离心管中，加入2 mL DMEM，于25°C下以920 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液。将细胞沉淀重悬于3 mL平滑肌细胞（SMC）培养基中（DMEM含10% FBS，并补充1 µg/mL重组人FGF、10 µg/mL重组人EGF、100 U/mL青霉素/链霉素和2.5 µg/mL两性霉素B），转移至35 mm培养皿。 
	注意：初次分离时，单根P0.5野生型主动脉可获得约400,000个细胞，其中约300,000个为SMC。</li>
	<li>在37 °C条件下培养细胞，每3天更换一次新鲜SMC培养基。当细胞达到融合状态时，采用胰酶消化等标准技术进行传代。实验中使用第3至第7代的细胞。</li>
</ol>
4. 在妊娠（或非妊娠）小鼠中植入皮下渗透压微型泵
注意：该方法先前已被用于持续递送药理学试剂（例如， 整合素β3和β5抑制剂cilengitide处理胚胎 在子宫内9泵于E13.5植入妊娠母鼠体内，并维持至分娩。
<ol>
	<li>使用氧气（流速为1 L/min）中2 - 5%的异氟烷进行诱导麻醉，维持麻醉时使用1 - 3%的异氟烷。通过脚趾夹捏反射监测麻醉深度，并根据需要调整麻醉剂用量。皮下注射布托啡诺（0.05 - 0.1 mg/kg）以提供镇痛。</li>
	<li>使用电动剃毛器剃除小鼠下背部毛发。手术过程中使用无菌铺巾、手套和器械，并将小鼠置于加热手术板上以维持体温。</li>
	<li>将每只小鼠置于俯卧位，用聚维酮碘擦拭背部，随后使用异丙醇脱碘。在尾根部上方下背部约3 - 5 cm处，使用手术刀做一长度为0.5 - 1.0 cm的横向皮肤切口，注意避免损伤下方肌肉组织。</li>
	<li>将止血钳插入切口，通过开合钳头在头侧方向分离形成一个皮下囊袋，用于植入泵体。</li>
	<li>根据制造商说明（见材料表），用所需试剂充满渗透压微型泵。将充满试剂的泵植入皮下囊袋中，并使用钉合器或6-0不可吸收缝线关闭切口。确保总手术时间少于10分钟。</li>
	<li>术后每15分钟监测小鼠一次，直至其从胸卧位恢复。在术后48小时内，每6 - 12小时皮下注射布托啡诺（0.05 - 0.1 mg/kg）一次。当小鼠完全从全身麻醉中恢复后，改为每日观察。术后7 - 10天拆除钉合器或缝线。</li>
</ol>

<ol><li>Shankman, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLF4-dependent+phenotypic+modulation+of+smooth+muscle+cells+has+a+key+role+in+atherosclerotic+plaque+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis.</a> Nat Med. 21, 628-637 (2015).</li>
<li>Rowe, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+in+aneurysmal%2C+occlusive%2C+and+normal+human+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas.</a> J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).</li>
<li>Rodella, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+aortic+aneurysm+and+histological%2C+clinical%2C+radiological+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation.</a> Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).</li>
<li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).</li>
<li>Lakso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+oncogene+activation+by+site-specific+recombination+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).</li>
<li>Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+site-specific+recombination+in+mammalian+cells+using+a+ligand-dependent+chimeric+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).</li>
<li>Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+developing+artery+muscularization+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension.</a> Cell Rep. 6, 809-817 (2014).</li>
<li>Greif, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+construction+of+an+arterial+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Radial construction of an arterial wall.</a> Dev Cell. 23, 482-493 (2012).</li>
<li>Misra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+beta3+inhibition+is+a+therapeutic+strategy+for+supravalvular+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis.</a> J Exp Med. 213, 451-463 (2016).</li>
<li>Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cell+progenitors+are+primed+to+muscularize+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 7, (2015).</li>
<li>Wirth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G12-G13-LARG-mediated+signaling+in+vascular+smooth+muscle+is+required+for+salt-induced+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension.</a> Nat Med. 14, 64-68 (2008).</li>
<li>Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+temporally-controlled+targeted+mutagenesis+in+smooth+muscle+cells+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse.</a> Genesis. 47, 14-18 (2009).</li>
<li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+genetic%2Fpharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li>
<li>Kumar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells.+Defining+a+mesenchymal+progenitor+niche+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution.</a> Science. 346, 1258810(2014).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev Biol. 1, 4(2001).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+is+an+essential+determinant+of+arterial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis.</a> Nature. 393, 276-280 (1998).</li>
<li>Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+myosin+heavy+chain+exclusively+marks+the+smooth+muscle+lineage+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis.</a> Circ Res. 75, 803-812 (1994).</li>
<li>Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elastin+gene+is+disrupted+by+a+translocation+associated+with+supravalvular+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis.</a> Cell. 73, 159-168 (1993).</li>
<li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+arterial+pathology+in+mice+and+humans+hemizygous+for+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin.</a> J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).</li>
<li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+point+mutations+cause+an+obstructive+vascular+disease%2C+supravalvular+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis.</a> Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).</li>
<li>Pober, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Williams-Beuren+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Williams-Beuren syndrome.</a> N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).</li>
<li>Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+treatment+of+cardiovascular+disease+in+Williams-Beuren+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome.</a> J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).</li>
<li>Holtwick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle-selective+deletion+of+guanylyl+cyclase-A+prevents+the+acute+but+not+chronic+effects+of+ANP+on+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).</li>
<li>Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP%3A+role+in+vascular+wall+integrity+and+protection+from+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis.</a> Science. 300, 329-332 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+adult+smooth+muscle+cell-targeted+Cre+recombinase+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).</li>
<li>Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bacterial+artificial+chromosome+transgenic+mice+expressing+mCherry+fluorescent+protein+substituted+for+the+murine+smooth+muscle+alpha-actin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene.</a> Genesis. 48, 457-463 (2010).</li>
<li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li>
<li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+lacks+a+transplantable+progenitor+for+smooth+muscle+type+alpha-actin-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells.</a> Stem Cells. 24, 13-22 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与成年小鼠主动脉及其主要分支在动脉粥样硬化等病理条件下的广泛研究相比，关于胚胎期和围产期主动脉的形态发生及发病机制的研究仍较为有限。本文聚焦于胚胎期/围产期主动脉，特别是其中的平滑肌细胞（SMCs），并提供了一系列研究主动脉的实验方案 体内、组织外植块及SMC分离方法。这些互补的方法为研究者提供了多种途径来研究胚胎期/围产期主动脉。
克隆分析是一种非常强大的方法，可用于研究单个细胞的行为。我们最近利用该方法帮助鉴定了肺血管中特化的平滑肌细胞10。必须认识到，在携带多色Cre报告基因的小鼠个体中，相同颜色的细胞可能来源于多个独立的重组事件。因此，使用多色报告系统进行克隆分析时，必须对大量小鼠进行评估。由于在妊娠中晚期给予他莫昔芬可能干扰分娩过程，因此对于在妊娠中晚期标记细胞并进行出生后谱系示踪的实验，应同时注射孕酮和他莫昔芬。类似于胚胎实验方案，成年小鼠体内细胞的命运图谱绘制和克隆分析也可通过向成年小鼠腹腔注射他莫昔芬来实现。
平滑肌细胞的克隆分析与命运图谱研究利...

多细胞生物的循环系统负责向未与外界环境直接接触的细胞输送营养物质和氧气，并从这些细胞中清除代谢废物和二氧化碳。在脊椎动物中，主要的循环系统由心脏构成，心脏通过一系列血管泵送血液。大血管（如动脉和静脉）的管壁由三层结构组成：i）内膜，即内层的内皮细胞层；ii）中膜，即中层，由环向排列的平滑肌细胞（SMCs）和弹性板层交替构成；iii）外膜，即外层，由结缔组织和成纤维细胞组成。血管生物学领域的绝大多数研究集中于内皮细胞，重点探讨通过血管生成形成新的内皮细胞衬里的管道过程。相比之下，对平滑肌细胞（SMCs）的关注相对较少。然而，平滑肌细胞是构建正常动脉壁以及参与血管病理过程的关键细胞类型。
主动脉是人体内管径最大的动脉，接收来自心脏左心室的血液输出。主动脉会受到多种人类疾病的影响，包括动脉粥样硬化、动脉瘤和主动脉夹层。在成年生物体中，主动脉及其主要分支在血管疾病模型中被广泛研究。例如，缺乏编码低密度脂蛋白受体或载脂蛋白E基因的小鼠在高脂饮食喂养下会发展出动脉粥样硬化，而近期的谱系追踪研究表明，已存在的平滑肌细胞（SMCs）可衍生为动脉粥样硬化斑块中的多种细胞类型1。在主动脉瘤中，病理变化包括平滑肌细胞凋亡和细胞外基质重塑2,3。
关于胚胎期和围产期平滑肌细胞的形态发生及发病机制，目前所知甚少。本文提供了研究胚胎期和围产期主动脉平滑肌细胞的实验方案 体内在组织外植体和分离细胞中。例如，本方案的第一部分阐述了在胚胎小鼠中进行命运图谱绘制和克隆分析。在细胞特异性启动子调控下表达的Cre重组酶可实现对特定细胞及其子代细胞的标记4,5,6；然而，在小鼠胚胎发育过程中，实现细胞特异性标记的时间控制具有挑战性。在此背景下，利用在平滑肌细胞（SMCs）中特异性启动子驱动下表达条件性 CreER 的胚胎（例如，Myh11 或 Acta2）以及一种Cre报告基因，我们提供了向妊娠母鼠注射他莫昔芬或其活性代谢产物4-OH-他莫昔芬的方法，并介绍了在胚胎或出生后子代中分析标记细胞的技术。此外，与主要使用单一荧光报告蛋白的细胞命运图谱研究相比1,7，使用多色Cre报告系统可显著增强克隆分析。
方案的第二和第三部分分别描述了分离和培养胚胎期主动脉外植体以及新生小鼠主动脉平滑肌细胞（SMCs）的方法。这些方法可针对主动脉外植体或平滑肌细胞中的信号通路进行调控，并用于分析药理学试剂的直接作用效果。因此，相较于传统的小鼠遗传操作，该方法能够更快速地筛选特定基因在目标组织中的功能。此外，分离后的平滑肌细胞研究有助于分析细胞迁移与黏附行为，而这些实验在技术上具有一定的局限性 体内.
最后，第四部分实验方案详细说明了在妊娠（或非妊娠）小鼠体内植入装载药理学试剂的皮下渗透性微型泵的方法。该方法有助于分析因药物代谢迅速而需要持续输注的试剂对胚胎发育造成的影响。频繁注射是另一种替代方式，但对许多试剂而言并不实用，且应尽量避免，因为它可能给妊娠母鼠带来显著不适。

<table><tbody><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>玉米油</td><td>Sigma</td><td>C-8267</td><td>他莫昔芬的溶剂</td></tr><tr><td>4-羟基他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>他莫昔芬的活性代谢产物</td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma</td><td>P8783-5G</td><td>使用浓度为他莫昔芬的一半</td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Sakura tissue tek</td><td>4583</td><td>用于制备冷冻切片块</td></tr><tr><td>冷冻模具</td><td>Polysciences inc</td><td>18986</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>细胞核免疫组化染色，终浓度为 5 mg/mL</td></tr><tr><td>直接偶联 Cy3 的抗-SMA 抗体</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>SMA 免疫组化染色，终稀释比例为 1:500</td></tr><tr><td>抗-CD31 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>GFP 免疫组化染色，终浓度为 0.006 mg/mL</td></tr><tr><td>抗-GFP 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11121</td><td>CD31 免疫组化染色，终浓度为 0.0016 mg/mL</td></tr><tr><td>二抗山羊抗兔，Alexa 647 标记</td><td>Life Technologies</td><td>a21244</td><td>免疫组化染色，终浓度为 0.004 mg/mL</td></tr><tr><td>二抗山羊抗兔，Alexa 488 标记</td><td>Life Technologies</td><td>a11008</td><td>免疫组化染色，终浓度为 0.004 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>抗整合素 β3 封阻抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553343</td><td>克隆号 2C9.G2，终浓度为 0.02 mg/mL</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>44H14977A</td><td>用于主动脉消化</td></tr><tr><td>弹性蛋白酶</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>34K15139</td><td>用于主动脉消化</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂（100 倍浓缩液）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>重组人 FGF</td><td>Promega</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>重组人 EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>组织培养板</td><td>Corning</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>Alzet 渗透压微型泵</td><td>Durect Corporation</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE 80i 直立荧光显微镜</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;TCS&amp;nbsp;SP5</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson Sonifier 450</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myh11-CreERT2 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>19079</td><td></td></tr><tr><td>Acta2-CreERT2 小鼠</td><td></td><td></td><td>由 Pierre Chambon 博士和 Daniel Metzger 实验室提供</td></tr><tr><td>ROSA26R-CreERT2 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>8463</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(mTmG/mTmG) 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;026862</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(EYFP/EYFP) 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;006148&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(Confetti/Confetti) 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>13731</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(Rb/Rb) 小鼠</td><td>Dr. Irv Weissman 实验室</td><td></td><td>由 Dr. Irv Weissman 实验室提供</td></tr></tbody></table>

使用 在体 内 研究胚胎期和围产期主动脉形态发生与发病机制的组织与细胞外植体方法

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

主动脉是人体最大的动脉。主动脉壁由内层的内皮细胞、中层交替排列的弹性膜层和血管平滑肌细胞（SMCs），以及外层的成纤维细胞和细胞外基质构成。与广泛研究的病理模型相比例如， 动脉粥样硬化）在成人主动脉中的研究已较为深入，但关于胚胎期和围产期主动脉的研究则相对较少。本文聚焦于平滑肌细胞（SMCs），提供了在正常发育及疾病状态下分析胚胎期和围产期主动脉SMCs形态发生与病理发生过程的实验方案。具体包括以下四个方案：i） 体内 胚胎命运图谱绘制与克隆分析；ii）胚胎主动脉外植体培养；iii）围产期主动脉平滑肌细胞的分离；以及iv）在妊娠（或非妊娠）小鼠中皮下植入渗透压微型泵。因此，这些方法有助于研究主动脉中平滑肌细胞的来源、命运及其克隆结构 体内它们能够调节胚胎主动脉的形态发生 在子宫内 通过持续暴露于药理学试剂来进行研究。此外，可利用分离的主动脉组织外植体或主动脉平滑肌细胞（SMCs），以深入了解特定基因靶点在肌化、增殖和迁移等基本过程中的作用。这些针对分离的SMCs和主动脉外植体开展的假设生成实验，可进一步在体内模型中进行验证。 体内 通过药理学和遗传学方法阐明其背景机制。

在对平滑肌细胞进行代表性克隆分析时，所用胚胎为突变型 Eln （编码细胞外基质蛋白elastin的基因）， Eln(+/-)，Acta2-CreERT2 小鼠被交配以 Eln(+/-) 携带多色 ROSA26R 的小鼠(Rb/Rb) 报告基因。如步骤1所述，检查栓塞后，对妊娠母鼠在E12.5时通过单次注射他莫昔芬（1.5 mg）进行诱导，并于E18.5处死。收集胚胎，固定、冷冻并进行基因分型。制备降主动脉横断面冷冻切片。获取切片后 Eln(+/-)，Acta2-CreERT2, ROSA26R(Rb/+) 胚胎结果表明，积聚在内层的过量平滑肌细胞 Eln-null 小鼠（从 E15.5 开始）以多种颜色标记（图1）因此来源于多种α-平滑肌肌动蛋白（SMA）...

利用小鼠胚胎期及围产期主动脉进行研究的实验方案 体内 克隆分析与命运图谱、主动脉外植体以及分离的平滑肌细胞在本文中被详细描述。这些不同的方法有助于研究胚胎期和围产期主动脉在正常发育过程中的形态发生，以及疾病状态下的发病机制。

主动脉是人体最大的动脉。主动脉壁由内层的内皮细胞、中层交替排列的弹性...

这些实验方案的总体目标是研究胚胎期和围产期主动脉壁在正常发育过程中的形成机制，以及疾病状态下该过程发生的异常变化。该方法有助于回答血管发育领域的一些关键问题，例如，参与胚胎期和围产期血管中膜形成的细胞来源是什么。这些技术的主要优势在于，能够对发育的胚胎期和围产期阶段中平滑肌的发病机制及形态发生过程进行评估。这些技术的应用意义在于治疗血管疾病，例如周期性疾病的上瓣膜主动脉狭窄，该疾病会导致 SUMO 细胞过度产生。微型泵植入手术将由张佳生博士进行，他是一位指导耶鲁大学显微手术核心实验室的研究科学家。首先，在携带 Cre ER 的 2 至 6 月龄小鼠与携带 Cre 报告基因的小鼠之间建立交配组合。使用金属探针每天早晨检查阴道栓，一旦发现阴道栓，立即将雌鼠与雄鼠分离。对于早期胚胎诱导，需向妊娠雌鼠腹腔内注射他莫昔芬。为了标记妊娠中期至晚期的细胞，并追踪其在出生后小鼠中的命运或克隆性，可将孕酮与他莫昔芬以1至2次剂量比例联合，不同时地注入妊娠雌鼠的腹腔内。为了在合适的胚胎发育日期收获胚胎，先用70%乙醇清洁怀孕母鼠的腹部，然后使用剪刀切开腹腔以取出子宫。用镊子和体视显微镜从子宫中收集胚胎，并小心地将其与胎盘和卵黄囊分离。将胚胎在4%多聚甲醛中于4摄氏度固定2小时。随后用 PBS 洗涤三次，以去除多余的固定剂。第三次洗涤后，将胚胎置于含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中，分别放入 15 毫升离心管，直至胚胎沉底。接着，将塑料冷冻模具填充至最大体积的三分之二，加入最佳切割温度化合物（OCT），并在每个模具中垂直放置一个胚胎。室温下放置10分钟后，将组织直立置于干冰与70%乙醇混合物中冷冻，并将冷冻切片机温度设定为22摄氏度。对组织块进行切片，沿每根主动脉全长获取厚度为10至20微米的横截面组织切片，并在切片获得时立即用玻璃载玻片收集。所有样品采集完毕后，将载玻片在室温下干燥30分钟，然后于80摄氏度保存。为了染色组织样本，将切片在室温下解冻，避免光照以防止荧光染料淬灭，并用0.1% PBS Tween 20洗涤切片。进行克隆分析时，使用适当的细胞核染料对组织进行染色，并直接在荧光显微镜下成像彩虹报告基因（rainbow cre reporter）的其他荧光信号。进行命运图谱分析时，对于mTmG cre报告系统，可通过直接成像（无论是否进行免疫染色）观察GFP的表达情况。为了培养和分离胚胎主动脉，将胚胎置于仰卧位，并在体视显微镜下将其伸展的四肢固定于解剖板上。使用剪刀从腹部经胸骨向上至胸腔上部做一纵向切口。分离并去除气管、肺、食管、肝脏和肠等细微组织。用镊子轻轻将心脏向腹侧牵拉，同时使用剪刀从胸腔和腹腔背侧分离主动脉。在主动脉近端根部和远端腹部位置切断，取下主动脉，并将其置于细胞培养超净台中无菌的冰上冷 PBS 中。短暂洗涤后，将主动脉转移至24孔板的一个孔中，孔内含有添加了0.5% PBS的DMEM培养基，并将培养板置于细胞培养箱中孵育最多24小时。孵育结束后，用 PBS 洗涤主动脉两次，并将组织置于 4% 多聚甲醛中固定 20 分钟。再经三次 PBS 洗涤后，将主动脉转移至含有 30% 蔗糖 PBS 溶液的 1.5 毫升离心管中，直至组织沉底。对于围产期主动脉平滑肌细胞的分离，使用 23 号针头穿刺出生后 0.5 天小鼠的左心室，并用塑料管将针头连接至装有无菌 PBS 的注射器，注射器垂直置于较高位置，使 PBS 借重力流入左心室。当肝脏变白时，用镊子去除主动脉外的外膜组织，并按照前述方法取下主动脉。将主动脉组织置于500微升消化液中，每5至10分钟手动振荡一次以进行解离。45分钟后，将试管转移至无菌细胞培养操作台，使用200微升移液器反复吹打组织悬液，直至获得单细胞悬液。将细胞转移至15毫升锥形管中，加入2毫升DMEM，通过离心收集细胞。将沉淀重悬于3毫升平滑肌细胞培养基中，接种至35毫米培养皿。然后将培养皿置于37摄氏度培养箱中，每三天更换一次细胞培养基。植入皮下渗透压微型泵时，首先使用剃毛器剃除麻醉小鼠下背部的毛发，并将小鼠俯卧于加热的手术板上。用聚维酮碘和异丙醇擦拭背部消毒，然后将小鼠置于体视显微镜下。接着，使用手术刀在尾根部前方约3至5厘米处做一道0.5至1厘米长的水平皮肤切口，注意勿损伤下方肌肉组织。将止血钳插入切口，张开并闭合止血钳钳口以形成皮下囊袋。将装有所需试剂的渗透压微型泵插入囊袋中，并使用6个不可吸收缝线缝合切口。随后，在监测下让小鼠恢复，直至其达到胸骨卧位。编码细胞外基质蛋白弹性蛋白（elastin）的基因发生突变的胚胎，从胚胎发育第15.5天开始，在主动脉内层积聚过多的平滑肌细胞。在此过程中，利用多色cre报告系统对平滑肌细胞进行克隆分析，结果显示这些细胞呈现多种颜色，表明其为多克隆来源。对离体主动脉组织切片进行免疫染色显示，弹性蛋白突变型胚胎在发育第15.5天的主动脉在培养18小时内即出现肌层增厚和管腔狭窄，而加入抗整合素β3阻断抗体可减弱这一过程。从出生后第0.5天的野生型小鼠主动脉中分离出的平滑肌细胞表达平滑肌细胞标志物，但不表达CD31。从胚胎第13.5天开始，对妊娠母鼠持续输注整合素β3抑制剂，可显著减轻细胞外基质蛋白elastin突变小鼠的主动脉狭窄和过度肌化，但对野生型小鼠的主动脉无影响。熟练掌握后，若操作得当，渗透压微型泵植入技术可在10分钟内完成。遵循这些操作步骤，该方法还可推广应用于研究编码非血管平滑肌的组织，例如胃肠道或肺部组织。观看本视频后，您应能充分理解如何开展体内胚胎谱系示踪与克隆分析、原代培养胚胎主动脉组织、围产期主动脉平滑肌细胞，以及皮下植入渗透压微型泵。请注意，操作小鼠、他莫昔芬和固定还原剂时可能存在危险，因此在进行这些实验操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴手套和实验服，并格外小心谨慎。

using-vivo-tissue-cell-explant-approaches-to-study-morphogenesis

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用体内和组织和细胞外植体方法研究胚胎和围产期主动脉的形态和发病机制

我们介绍了一种用于分析小鼠胚胎肢部皮肤中复杂血管网络形成的全胚免疫组织化学结合多重标记激光扫描共聚焦显微镜技术。...

胚胎肢皮肤血管系统的整体免疫组织化学分析：研究胚胎血管分支形态发生的一种模型系统

新生小鼠视网膜为血管生成提供了一个特征明确的生理学模型，可在体内环境中研究不同基因或药物对血管生成的调控作用。准确可视化血管丛的免疫荧光染色对于此类研究的成功至关重要。...

对新生小鼠视网膜进行整体免疫荧光染色以研究血管生成 在体内的

我们描述了一系列方法，用于在小鼠胚胎发育第9.5天（E9.5）及之后阶段，向胚胎内注射染料、DNA载体、病毒和细胞，以监测来源于胚胎或 pluripotent...

发育中胚胎小鼠心脏的细胞标记与注射

主动脉的病理变化可导致严重的发病率和死亡率，因此有必要对疾病进展及潜在治疗方法进行研究。本文介绍一种用于分离和切除小鼠主动脉的实验方案，以协助研究人员开展心血管疾病的相关研究。...

小鼠主动脉的分离与切除：心血管疾病研究中的一种多用途技术

本文描述了一种用于可视化发育中血管系统的技术。我们对小鼠胚胎进行了子宫内心脏内显微注射荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记的番茄凝集素。利用该技术，我们可清晰区分胚胎肾脏中已被灌注和未被灌注的血管结构。...

在子宫内 对小鼠胚胎进行心脏内番茄凝集素注射以评估肾脏血流

首次在此提出一种可重复的带束法，用于改变发育中心脏的血流动力学 体外通过部分缩窄流出道（OFT）来实现。...

一种新型的 ex ovo 胚外结扎技术用于改变鸡胚系统中的心内血流动力学

我们介绍一种利用标准免疫染色方法结合光学透明化和共聚焦显微镜技术，对发育至E15.5阶段的完整胚胎小鼠心脏中冠状血管进行分析的实验方案。该技术可实现对整个心脏内血管系统的可视化观察，无需耗时的连续切片分析。...

透明化胚胎心脏中冠状血管的分析

本方案展示了一种基于荧光的方法，用于可视化血管系统并量化其复杂性 Xenopus tropicalis在对胚胎进行遗传学和/或药理学干预后，将荧光染料注入跳动的心脏，数分钟后即可对血管系统进行成像，以研究心血管发育过程。 体内.

胚胎血管生成的可视化与定量分析 Xenopus tropicalis

该方法中，胚胎心脏组织经过显微手术分离、解离、荧光标记后，植入宿主胚胎组织。这为研究异位血流动力学条件下和/或改变的旁分泌/邻近分泌环境下的细胞或组织水平发育调控提供了平台。...

基于显微注射的禽类胚胎体内植入胚胎心肌细胞系统

传统上，小鼠胚胎瓣膜原基的内皮细胞层通常通过横断面、冠状面或矢状面切片进行分析。我们提出了一种新的方法，可在瓣膜形成区域对内皮细胞层进行en...

En Face 小鼠胚胎心内膜垫平面形态发生分析的制备

了解小鼠胚胎及围产期主动脉形态发生与发病机制的研究方法，包括体内克隆分析、命运图谱和主动脉外植体技术。这些方法有助于评估血管发育过程中的平滑肌病理发生，为血管疾病治疗提供理论基础。

使用在体内研究胚胎期和围产期主动脉形态发生与发病机制的组织与细胞外植体方法

探索更多视频

使用 在体 内 研究胚胎期和围产期主动脉形态发生与发病机制的组织与细胞外植体方法

探索更多视频

使用在体内研究胚胎期和围产期主动脉形态发生与发病机制的组织与细胞外植体方法