Name: 小鼠第二腭融合的实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学习使用共聚焦显微镜对小鼠胚胎第二腭融合进行实时成像的方法。该技术可直接观察颅面发育过程中的细胞动态，为发育生物学研究提供可靠工具。

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我们感谢 M. Douglas Benson 在关于次级腭成像的初步讨论中提供的帮助。同时感谢 David Castaneda-Castellanos（Leica）和 Chris Rieken（Zeiss）在共聚焦显微镜成像条件调整方面提供的协助。我们感谢 Lynsey Hamilton（Bitplane）在使用 Imaris 软件进行定量图像分析方面的有益建议。本研究由美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所（NIH/NIDCR）R01 DE025887 项目资助。

所有动物实验均按照加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会的方案进行。
1. 活体成像培养基的制备
<ol>
	<li>液体培养基的制备
	<ol>
		<li>在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/F12 培养基中加入 20% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、200 µg/mL L-抗坏血酸和 15 mM HEPES。 
		注意：活细胞成像培养基需在成像前新鲜配制。该培养基含有酚红，长时间活细胞成像过程中可能引起光毒性。改用不含酚红的培养基可能改善长期成像效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>低熔点琼脂糖溶液的制备
	<ol>
		<li>将 350 mg 低熔点琼脂糖溶解于 10 mL 经高压灭菌的蒸馏水中，配制成 3.5% 的储备液。</li>
		<li>充分混匀琼脂糖溶液，并在 70 °C 水浴中孵育，使其完全溶解。</li>
		<li>在加入活细胞成像培养基前，将琼脂糖溶液置于 37 °C 水浴中冷却。</li>
		<li>将 1 mL 琼脂糖储备液加入 5 mL 液体活细胞成像培养基中，得到终浓度为 0.6% 的溶液。</li>
		<li>将含琼脂糖的培养基置于 37 °C 水浴中保温，以防止提前凝固。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 活体成像用腭外植体培养的制备
<ol>
	<li>解剖近期已黏附的 E14.5 次级腭突 
	注：根据我们的经验，成像融合过程需要从略微黏附的一对腭突开始；这种黏附可防止外植体移动，从而避免成像期间融合无法发生。
	<ol>
		<li>在 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中解剖 E14.5 阶段的胚胎，并使用配备荧光灯的体视显微镜挑选表达绿色荧光蛋白（GFP）（来自 K14-cre; ROSA26-mTmGflox）或表达红色荧光蛋白（RFP）（来自 Lifeact-mRFPruby）的阳性胚胎。将组织转移至预热的不含琼脂糖的活细胞成像培养基中。</li>
		<li>使用两把精细的 5 号镊子剪下胚胎头部，并去除大脑上部区域（图 1A-C）。用一把 5 号镊子固定胚胎，另一把 5 号镊子去除腭突外部的多余组织。 
		注：可使用精细剪刀代替其中一把 5 号镊子来剪切胚胎头部（第一步）。然而，使用两把精细的 5 号镊子能更好地控制，实现更精确的切割。</li>
		<li>小心去除下颌，避免损伤腭突，如 图 1D 和 1E 所示。为降低损伤腭部的可能性，在解剖下颌时暂时保留舌体，随后再小心移除舌体。</li>
		<li>去除下颌和舌体后，使用带有荧光功能的体视显微镜检查次级腭的口腔侧，确认中缝上皮（MES）区域有强烈的报告基因信号（图 1M）。</li>
		<li>在去除下颌和舌体后，解剖出包括后脑和脑干在内的后部组织（图 1F）。</li>
		<li>取出带有黏附腭突的双侧上颌骨（图 1G）。</li>
		<li>切割前部上颌组织，保持初级和次级腭结构完整（图 1H 和 I）。</li>
		<li>去除外植体鼻侧的鼻中隔，暴露中缝上皮（MES）。 
		注：这些后续解剖步骤需格外小心，避免破坏两个次级腭突之间的接触。去除鼻中隔有助于减少来自其他区域的背景信号，同时减少组织的垂直移动，从而实现稳定的成像（图 1J-L）。</li>
		<li>解剖完腭突后，再次检查中缝处的报告基因信号，确保组织间上皮层未受损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在含活细胞成像培养基的培养皿中设置腭突外植体
	<ol>
		<li>将活细胞成像培养基加入 35 mm 玻璃底培养皿中。</li>
		<li>将解剖好的腭突以口腔侧朝下放置，尽可能贴近玻璃底部，以便使用倒置共聚焦显微镜进行成像（图 1N）。</li>
		<li>在培养皿附近导电表面上放置干冰颗粒，通过快速降温加速琼脂糖凝固，或直接将培养皿置于 4 °C 环境中。此步骤也可使用冷台（例如石蜡包埋用冷台）完成。 
		注：若使用干冰，需密切监测琼脂糖培养基的变化，防止培养基冻结。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 腭外植体的共聚焦延时成像
<ol>
	<li>成像与数据采集
	<ol>
		<li>待琼脂糖半凝固后，将培养皿置于配备37 °C培养箱的倒置共聚焦显微镜上。使用白光共聚焦显微镜和细胞观察者转盘共聚焦显微镜。 
		注：我们使用含有15 mM HEPES且无需CO2气体的改良培养基。</li>
		<li>用注射器将凡士林涂抹于培养皿与盖片之间，以防止培养基蒸发（图1N）。 
		注：过夜（O/N）培养后，培养皿盖上可能出现少量冷凝水，但培养基体积未发生变化，表明凡士林有效防止了培养基蒸发。</li>
		<li>先用低倍物镜（10x）定位感兴趣区域，再使用高倍物镜（20x物镜配合3倍数字变焦，或40x物镜配合Immersol W）进行延时活细胞成像。 
		注：分离的次级腭板并非平坦结构。次级腭呈弯曲形态，这使得难以在同一焦平面上完整成像整个中缝上皮（MES）。低倍（10x）成像可实现全腭观察，而40x物镜则能提供更高分辨率，便于在较深Z层位置详细观察细胞运动。腭中部区域曲率最高，前部和后部相对较为平坦。我们通常选择次级腭的中前部区域进行成像，以避开曲率最大的区域。</li>
		<li>使用适当的激光激发波长（GFP为488 nm，RFP为532/561 nm），以每步5 µm进行多层Z轴扫描，持续16–24小时（图2）。 
		注：为减少潜在的光毒性，应使用最低必要的激光功率和曝光时间，这在多色成像时尤为重要。膜标记Tomato（mT）使用552 nm激光功率的22%，膜标记GFP（mG）使用495 nm激光功率的30%，膜标记RFP使用561 nm激光功率的25%。平均曝光时间为550 ms。</li>
		<li>使用图像分析软件进行细胞追踪和定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据图像分析
注意：此处使用了 Imaris 软件。类似的数据分析也可通过 ImageJ 或 Volocity 软件完成。
<ol>
	<li>从图像序列中渲染三维（3D）表面 
	注意：本节用于从膜GFP信号生成的视频中创建表面模型。
	<ol>
		<li>点击 编辑 | 显示调整 并使用直方图滑块调整信号强度，使膜信号在整个视频过程中均清晰可见（图3A).</li>
		<li>使用图像校正漂白信号 处理 | 衰减校正调整“前部强度”和“后部强度”参数，使膜信号在整个视频时长中均清晰可见。设置这些参数时可能需要进行多次尝试以达到最佳效果。 
		注意：由于激光穿透能力有限，背面强度（Z轴较深位置）的数值将小于前面强度（Z轴表面位置）的数值。因此，也可调整这两个数值以对Z系列图像的信号强度进行归一化。可同时调节这两个参数以实现漂白校正。衰减校正也称为发射衰减校正。19.</li>
		<li>为了从膜信号生成表面，选择 Surpass | 表面，选择一个源通道和阈值类型（绝对强度），并在算法设置下选择 仅分割感兴趣区域 和 整个图像的最终处理过程，然后点击前进箭头；继续点击前进箭头（使用默认设置，或通过试错法指定表面积细节级别和阈值化方法），并检查生成的表面是否反映了荧光信号。如需指定感兴趣区域，可通过裁剪 X、Y、Z 位置来选择待渲染的区域和时间点。 
		注意：选择 整个图像的最终处理过程 以便在整个视频中应用调整和阈值。</li>
		<li>再次点击前进箭头按钮生成表面，然后通过调整直方图来调节阈值 滤光片 与膜信号相对应。</li>
		<li>表面生成后，选择“Surfaces/Settings”中的表面以可视化表面信号，并通过点击双箭头前进按钮完成表面生成过程图3B).</li>
		<li>前往 表面 | 编辑 并点击 遮蔽全部 在 口罩特性 生成一个掩膜通道图像。</li>
		<li>单击“确定”后，掩膜通道窗口将自动打开；选择 GFP 通道，将表面以外的体素设置为最大信号强度值（位于 编辑 | 显示调节）以及将表面内部的体素设为最小GFP强度值（同样位于 编辑 | 显示调节），在 掩膜设置 生成膜信号的掩膜。</li>
		<li>由于膜信号的掩膜将被显示在 体积 观察，使用生成倒置图像 图像处理 | 对比度调整 | 反相 (图3C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从倒置的表面图像中检测斑点。 
	注意：本节可对每个细胞的中心标记唯一斑点，并在空间和时间上进行追踪。
	<ol>
		<li>选择 超越场景 | 斑点 | 创建；在算法设置中选择 仅分割感兴趣区域, 整个图像的最终处理过程 和 随时间追踪斑点.</li>
		<li>单击前进箭头并指定感兴趣区域；选择需追踪斑点的区域和时间；继续点击前进箭头，选择掩膜通道作为源通道，并确定斑点的估计XY直径。</li>
		<li>单击前进箭头按钮将自动打开过滤窗口；通过调整直方图中的数值来改变斑点检测阈值，以便在每个细胞的中心生成单个斑点图3D).</li>
		<li>再次点击前进箭头按钮将打开 算法 窗口。选择 自回归运动追踪模型20 并指定最大追踪距离和最大间隙大小，以连接在短时间内中断的轨迹。</li>
		<li>再次点击前进箭头按钮将打开“筛选”窗口，通过调整直方图设置轨迹持续时间阈值，确保每个细胞都被追踪。点击双前进箭头按钮将完成斑点检测。</li>
		<li>为了校正组织漂移，请单击 斑点 | 轨迹编辑器 并选择 校正漂移。一个 算法 窗口将自动打开；选择选择 平移漂移，包含完整结果，以及 校正物体位置.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成用于定量分析的vantage图 
	注意：该程序的散点图功能可用于生成包含多个对象的多维（X、Y、Z、颜色和尺寸）图形。此类图表适用于观察随时间变化的大量细胞运动趋势。
	<ol>
		<li>使用细胞追踪数据绘制二维或三维图 Vantage-添加新的 Vantage 绘图菜单（图3E 和 3F).</li>
		<li>选择 体积 或 斑点 并选择 创建/类别 和 图表类型</li>
		<li>调节 绘图数值 生成不同的 Vantage 图表。</li>
		<li>使用以下方法导出图表 快照 功能。 
		注意：单击后，统计 数据也可导出为电子表格，以便进行进一步的定量分析 图号区域 | 保存.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

活体成像结合三维器官外植体培养可提供有关细胞过程的详细信息，这些信息无法通过传统固定组织切片的染色分析获得。利用 体外 小鼠胚胎继发性腭外植体培养中，我们观察到多种有趣的细胞行为，由此提出一种涉及上皮汇聚与细胞挤出的腭融合新机制。
此类研究中的一个常见挑战是长时间连续激光激发导致的荧光漂白。在本研究中，我们使用了白光共聚焦显微镜和转盘共聚焦显微镜。成像软件（LAS-AF）中的漂白校正功能可在一定程度上校正随时间推移出现的信号强度下降（方案4.1）。由于漂白校正能力有限，因此在每种成像系统中仔细优化激光功率和曝光时间至关重要。我们还验证了在活体成像培养基中培养3天后，腭部融合过程仍能正常进行6。
活体成像中的另一个常见问题是组织漂移。在活体成像过程中，最小化漂移至关重要，因为焦平面的变化可能干扰对形态发生动态变化的准确理解。虽然许多共聚焦显微镜可通过控制热漂移来部分解决该问题（例如显微镜中的“定焦系统”），但组织相对于玻璃底的位移无法通过这些方法校正。使用琼脂糖以...

组织融合是多个器官发育过程中的重要步骤。唇裂和腭裂、脊柱裂以及心脏畸形等主要的人类先天性出生缺陷，均可能由组织融合缺陷导致1。小鼠继发性腭融合已被广泛研究，以揭示发育过程中调控组织融合的细胞与分子机制2,3,4。在小鼠中，继发性腭的发育始于约E11.5时期，此时两侧上颌突分别向外生长形成继发性腭突。腭突最初沿舌侧垂直生长，直至约E14.0时期，此时腭突发生抬升并转为水平方向位于舌上方。随后向内侧方向的生长导致两侧腭突的上皮相互接触，在E14.5时期形成中线表皮缝（MES）。在继发性腭突之间存在的MES必须被清除，以便在E15.5时期实现间充质的融合，从而形成完整且完全闭合的继发性腭3。
两个独立的腭突之间如何形成共有的上皮MES细胞层，随后又如何将其去除以实现间充质的融合，一直是腭发育研究中的核心问题。根据小鼠组织学和电子显微镜（EM）研究、外植体培养研究以及功能性小鼠遗传学实验，该过程涉及多种基本的细胞行为。每个腭突内侧边缘上皮（MEE）伸出的类似丝状伪足的突起有助于初始接触5,6，随后这些上皮细胞嵌入到一个共同的单层间充质层中6,7. 已提出的去除所形成的共享MES的机制包括三种非互斥的途径。早期研究采用组织学观察和 离体 使用活体染料进行谱系示踪表明，MES可能通过MES细胞的上皮-间质转化（EMT）被清除8,9尽管如此，近年来对上皮细胞的遗传谱系示踪研究对上皮细胞长期贡献于腭突间充质的能力提出了质疑10,11,12大量凋亡细胞的存在，以及在某些未能正常完成腭融合的突变体中这些细胞数量的减少，提示细胞凋亡可能是介导中缝上皮细胞层（MES）解体的主要驱动因素。2,3最后，基于最初对上皮标记物的连续时间点静态观察研究，提出MES细胞在口鼻方向和前后方向上迁移11,13但此类动态的细胞行为最初因无法在活体腭组织中观察而未得到证实。近期，我们通过开发一种新的活体成像方法，将小鼠遗传性荧光标记技术与外植腭突的共聚焦活体成像相结合，首次实现了对这些行为的直接观察。
首先，为了在腭融合过程中可视化腭上皮细胞的动态细胞行为，我们通过将ROSA26-mTmGflox小鼠与Keratin14-cre小鼠杂交，构建了一种上皮特异性报告小鼠14,15。对所得胚胎的腭外植体培养进行共聚焦活体成像，验证了一些先前提出的细胞行为，并揭示了融合过程中的新事件6。上皮细胞膜突起先于最初的细胞间接触，随后通过细胞嵌合及口鼻侧细胞移位实现上皮汇聚。值得注意的是，我们还发现细胞挤出（一种已被报道在上皮稳态中发挥重要作用的过程）是驱动小鼠次级腭融合的主要机制之一6,16。该成像方法可与其他报告小鼠品系联合使用；我们利用Lifeact-mRFPruby转基因小鼠17,18观察了融合过程中肌动蛋白细胞骨架的动态变化。此外，也可采用其他报告系统来观察腭融合的特定方面，该方法可根据成像需求和显微镜设备情况，适配于激光扫描共聚焦显微镜或转盘共聚焦显微镜。活体成像正日益成为发育生物学研究中的关键方法。特别是颅面形态发生过程复杂，影响面部的人类出生缺陷较为常见。这种共聚焦活体成像技术将有助于深入理解基本的发育机制以及人类颅面异常的起源。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>生命科技</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>生命科技</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>生命科技</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>生命科技</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>BioExpress</td><td>E-3111-125</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>凡士林（Vaseline）</td><td>Sigma</td><td>16415-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;小鼠&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;角蛋白14-cre&lt;/em&gt;</td><td></td><td>MGI: J:65294</td><td>等位基因 = Tg(KRT14-cre)1Amc</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;ROSA26&lt;sup&gt;mTmG&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td>MGI: J:124702</td><td>等位基因 = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Lifeact-mRFPruby&lt;/em&gt;</td><td></td><td>MGI: J:164274</td><td>等位基因 = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>白光SP5共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Observer 转盘共聚焦显微镜</td><td>蔡司显微镜</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠次级腭融合的活体成像

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

继发性腭板的融合以形成完整的继发性腭是哺乳动物发育过程中的关键事件，该过程若受到干扰，可导致继发性腭裂，这是人类常见的先天性畸形之一。继发性腭融合已被广泛研究，由此提出了多种可能介导该过程的细胞机制。然而，这些研究大多是在发育过程中不同时间点获取的固定胚胎组织上进行的，或基于在固定时间点分析的离体培养组织，属于静态观察。由于腭融合是一种动态形态发生过程，静态分析在研究此类动态过程时存在局限性，目前对介导腭融合的具体动态细胞行为仍了解不足。本文介绍一种活体成像方案，用于 离体 小鼠胚胎次级腭融合。为了研究腭融合过程中的细胞行为，采用上皮细胞特异性 Keratin14-cre 用于标记腭上皮细胞 ROSA26-mTmGflox 报告基因胚胎。为了可视化丝状肌动蛋白， Lifeact-mRFPruby 报告基因小鼠被用于实验。通过分离胚胎第14.5天（E14.5）阶段刚发生黏附的继发性腭突，并将其培养在含琼脂糖的培养基中，置于玻璃底培养皿内，从而利用倒置共聚焦显微镜对继发性腭融合过程进行活体成像。利用该方法，我们检测到继发性腭融合过程中多种新的细胞行为。深入理解不同细胞行为在时空上的协调机制，对于揭示这一动态形态发生过程具有重要意义。本实验方案可应用于基因突变小鼠品系，或经药物抑制剂处理的培养样本，以进一步推动对继发性腭融合调控机制的研究。

腭突外植体培养的活体成像揭示了介导腭融合的多种细胞过程6。两个上皮细胞之间的初始接触由细胞膜突起介导（图2B-2E）。当两层上皮相遇时，首先形成多细胞层的中缝上皮结构（MES），随后通过上皮汇聚过程发生细胞交错，最终整合为单层上皮的MES（图2A-2E 和 图2K-2O）。位于更深Z层面的上皮细胞也逐渐被移向MES的口腔侧，从而参与上皮汇聚过程（图2K）。在腭中部的MES中还观察到细胞向后迁移的现象（图2F-2J）。此外，我们在腭融合过程中发现了上皮细胞外排事件，...

本文介绍了一种利用共聚焦显微镜对小鼠继发性腭融合过程进行活体成像的实验方案。该方案可与多种荧光报告小鼠品系及信号通路抑制剂联合使用，以获得机制性见解。本方案亦可适用于其他发育系统的活体成像研究。

次级腭板融合形成完整的次级腭是哺乳动物发育过程中的关键事件，该过程若受到干扰，则可能导致……

本共聚焦活体成像方法的总体目标是直接观察颅面发育过程中驱动次级腭融合的细胞过程。首先，在含有新鲜、室温 PBS 的培养皿中，于解剖显微镜下将胚胎的头部与身体分离。用一对精细的5号镊子夹住头部，并用另一对镊子去除上脑组织，同时用第二对镊子剪除外侧腭突以外的所有多余组织。小心移除下颌骨，避免损伤腭板。当下颌骨被分离后，仔细移除舌头，并确认中线处上皮缝合带存在明显的报告基因信号。在解剖过程中，为保持中线上皮缝合带的完整性，务必注意不要损伤该结构。接下来，去除后脑、脑干以及附着腭板的上颌骨。切开上颌前部组织，保持初级腭和次级腭完整。切除外植体鼻侧的鼻中隔，以暴露中线的上皮缝合线，并确认组织间的上皮层保持完整。现在，向35毫米玻璃底培养皿中加入活体成像培养基，将解剖得到的腭板组织切片口侧朝下放置于培养皿中，尽量靠近玻璃底部。随后，将干冰颗粒置于靠近培养皿的导热表面上，以加速成像培养基中琼脂糖的凝固。当琼脂糖变为半固态时，将培养皿安装至配备37°C孵育腔的倒置共聚焦显微镜上，并使用注射器在培养皿与培养盖之间涂抹凡士林，以防止成像培养基蒸发。选择低倍物镜以定位目标区域。然后切换至高倍物镜，使用适当的激光激发，以5微米步长采集多个z轴层叠图像，持续16至24小时。腭突外植体培养的活体成像揭示了介导腭融合的多种细胞过程，其中两个上皮细胞之间的初始接触由细胞膜突起完成。当两层上皮相遇时，会形成一个多细胞层的中线-上皮接缝，随后通过上皮汇聚过程中的细胞嵌合，发育为整合的单层中线-上皮接缝。位于较深z层面的上皮细胞也逐渐向中线-上皮接缝的口腔侧移动，参与上皮汇聚过程。在中段腭部中线-上皮接缝中可观察到细胞向后方定向迁移。在腭融合过程中观察到上皮细胞外排现象，表明中线处上皮缝中的上皮细胞可通过这一主动过程被清除。这种整合的上皮缝最终将发生降解，实现组织融合。此外，丝状肌动蛋白在上皮区与间充质区交界处富集，沿前后轴形成类似缆索的结构。可以使用软件在腭融合过程中追踪特定的细胞行为，其中最佳的细胞追踪方法取决于实验中所使用的报告信号。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

小鼠第二腭融合的实时成像

一种用于在活体生物中随时间追踪细胞融合的方法。该方法利用 Cre-LoxP 通过细胞融合诱导荧光素酶表达的重组。所产生的发光信号可在活体生物中利用生物发光成像系统进行检测，其检测灵敏度为...

一种用于检测细胞融合的Cre-LoxP重组方法 体内

来源：Pietruczyk, E. A., 等．小鼠椎板切除术与脊髓窗植入．J. Vis. Exp.

小鼠脊髓窗植入术用于活体成像

神经前体细胞的有丝分裂是神经发生过程中的一个关键参数。目前对神经前体细胞有丝分裂的大部分认识主要基于对固定组织的分析。在胚胎脑切片中进行活体成像是一种多功能的技术，可在受控环境中以高时间和空间分辨率评估有丝分裂过程。...

活体成像小鼠胚胎大脑皮层发育过程中的有丝分裂

腭发育研究的动力源于腭裂的发生率，腭裂是一种出生缺陷，会给患者带来巨大的健康负担，并可能导致持久的畸形。本文展示了一种培养腭突的技术，可用于研究参与腭发育及融合过程中的不同信号通路。...

利用静态器官培养研究腭融合的方法

本方案描述了利用活体动物活细胞显微镜实时检测CCL5介导的骨膜骨骼干细胞迁移的方法。...

实时成像小鼠骨膜骨骼干细胞在CCL5诱导下的迁移

我们介绍了一种分离和培养原代小鼠胚胎腭部间充质细胞的方案，用于进行二维（2D）生长和伤口修复实验的延时成像。同时提供了分析延时成像数据的方法，以确定细胞流的形成及定向运动能力。...

分离与原代小鼠胚胎腭间充质细胞的延时成像以分析集体运动特性

本方案描述了一种带有可更换盖板的新型乳腺成像窗（R.MIW）。植入R.MIW后，可通过活体显微镜对健康及病变乳腺组织在不同发育阶段进行长期、多日、细胞分辨率的成像观察。...

使用可更换盖板的乳腺成像窗进行纵向活体显微成像

本文概述了建立具有口鼻瘘小鼠模型的逐步操作流程。通过使用加热的眼科烧灼器损伤硬腭中线部分，导致口腔与鼻腔之间形成开口，从而建立口鼻瘘。...

建立经口鼻瘘小鼠模型

免疫荧光成像受限于仅能通过单一时相的静态图像来观察复杂且具有时间依赖性的生物学过程。本研究介绍了一种在精密切割的小鼠下颌下腺组织切片上进行的活体成像方法。该方法可实现实时观察稳态期间的细胞间相互作用，以及再生与修复过程。...

探究唾液腺中的细胞间相互作用 通过离体实验 活细胞成像

离体活体成像是一种研究活体组织中细胞运动和相互作用动态过程的强大技术。本文介绍了一种利用双光子显微镜对培养的成年小鼠全门齿中的牙上皮细胞进行活体示踪的实验方案。...

使用 离体 活体成像技术研究小鼠牙齿更新过程中的细胞分裂与迁移

活体显微镜的发现向临床转化面临的主要挑战是其对组织的穿透深度较浅。本文介绍了一种小鼠背部窗口腔模型，该模型可实现活体显微镜与临床适用的成像方式（如CT、MRI）的共同配准，从而进行直接的空间关联分析，有望加速活体显微镜发现成果的临床转化。...

用于转化癌症研究中活体显微成像与磁共振成像联合应用的背侧皮肤折叠窗室肿瘤小鼠模型

学习使用共聚焦显微镜对小鼠胚胎第二腭融合进行实时成像的方法。该技术可直接观察颅面发育过程中的细胞动态，为发育生物学研究提供可靠工具。

小鼠次级腭融合的活体成像

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