Name: 颅脑损伤后大鼠行为缺陷的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学习检测大鼠颅脑损伤后的行为缺陷，包括前肢屈曲、平衡木行走和水迷宫测试等方法。这些技术可评估神经功能与认知损伤，为创伤性脑损伤研究提供可靠的实验手段。

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感谢 Ian Bolding 在受试者手术准备方面的协助，以及 Elizabeth Sumner 的细致编辑。这些研究是作为摩迪创伤性脑损伤转化研究项目资助团队的一部分完成的。

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作者无任何利益冲突需要披露。

在进行任何类型的行为学测试时，保持一致性至关重要。这一细节包含许多看似微不足道但对动物反应具有重大影响的考虑因素。一个不可忽视的重要步骤是在实验开始前使动物适应其笼舍/饲养环境。这一准备可降低动物生理应激反应的影响，而应激反应可能改变行为学结果18。同样，必须尽一切努力以相同的方式对待所有动物。这种一致性包括前文提到的对饲养环境的适应，以及在训练或测试前对抓取和在不同房间之间转运的适应。这一原则的重要性再怎么强调也不为过。粗暴的动物操作会对任何行为学测试造成灾难性影响19。同样，应尽一切努力在每天相同的时间段进行动物测试，无论是在其黑暗期还是光照期。对于本文讨论的测试，在光照期或黑暗期进行测试均可接受，前提是测试时间保持一致。已有研究表明，在昼夜节律周期的不同时间点进行测试会改变行为学结果18,20。此外，操作人员和动物本身都必须处于无应激、平静的状态，以最大限度地提高实验结果的准确性。
在进行Neuroscore评估时，假阳性与假阴性结果较为常见。假阳性通常发生在动物尚未充分适应抓取和测试操作的情况下。实验动物必须完全放松，以确保所观察到的反应为反射性反应，而非因应激或恐惧导致肌肉紧张所引发的反应。操作者若处于紧张状态，可能会将应激传递给动物，从而影响实验结果。因此，抓握大鼠过紧或过松均可能带来问题。此外，若操作者表现出紧张情绪，也可能干扰大鼠的行为反应。同时，缺乏经验的观察者还存在误判大鼠反应的风险。良好的培训和大量实践对于确保Neuroscore评估的成功性和结果一致性至关重要。
通常，这些实验的主要问题是处理组之间差异较小，有时甚至没有差异。由于动物可能对不同的操作人员、噪音、一天中的不同时段以及可能的季节变化产生不同反应21，因此必须尽一切努力减少所有可能的混杂因素。
此处展示的平衡木行走和平衡梁任务结果表明，这些测试在损伤后早期可用于检测前庭运动功能的缺陷。这类缺陷通常会随着时间推移而逐渐恢复1,14。在本模型中，损伤后6个月时，由损伤引起的功能缺陷已完全恢复。6个月时间点的结果显示，NAIVE、SHAM和损伤大鼠之间无显著差异；然而，所有大鼠在此期间均在各自的饲养笼中静养了6个月，经历了自然衰老和体重增加。因此，当它们在术后6个月（或NAÏVE组相应时间点）重新接受测试时，实际上已处于年老肥胖状态，故各组的表现均不如其基线第0天的结果。
另一个重要的考虑因素是所使用的行为学测试是否恰当。例如，本文所采用的测试被认为能够反映特定脑区的功能。一个例子是前庭系统，它对维持平衡至关重要。参与感觉运动功能的脑区，如包括感觉运动皮层在内的大脑皮层、丘脑、皮质脊髓神经元、基底神经节、黑质-纹状体等，均参与前庭运动协调。因此，平衡木测试（Beam-Balance）或行走木测试（Beam-Walk）中的表现缺陷提示这些脑区可能存在功能异常。此外，海马和前额叶皮层参与工作记忆水迷宫所检测的学习与记忆功能。即使选择了正确的测试方法，也必须牢记所用测试的局限性。例如，本文介绍的这些测试均无法敏感地检测情绪方面的缺陷，如抑郁、焦虑，或社交互动行为中的攻击性、决策能力或冲动性等。重申一点，必须根据待评估的行为和脑区选择合适的测试方法。
对行为学数据的解释与分析必须谨慎进行。强烈建议对每种类型的测试分别进行功效分析，因为将行为学结果作为神经功能缺损的衡量指标，本质上是对微小效应的一种粗略测量。此外，不同测试需要采用不同类型的统计分析方法。例如，本文所述的神经功能评分（Neuroscore）和横梁平衡（Beam-Balance）测试依赖于经过培训的观察者使用有序量表对行为进行评分。这类数据不属于连续型数据，也不符合正态分布，因此应采用非参数统计方法，如Kruskal-Wallis检验，如第6.1和6.2节所示。相比之下，横梁行走（Beam-Walk）测试和工作记忆水迷宫测试所产生的数据为连续型且符合正态分布，因此可采用参数统计方法，如单因素方差分析（one-way ANOVA）或重复测量双因素方差分析（repeated-measures two-way ANOVA），如第6.3和6.4节所示。
本文所介绍的行为学任务经受了时间的检验，能够产生可重复的结果，尤其在与大鼠FPI模型联用时效果显著，尽管目前还存在许多其他用于脑损伤的行为学检测方法。神经评分是一种简短的评估方法，仅需最少的设备即可完成。其他可用于神经功能评估的反射和力量测试也可纳入，例如侧向推力任务、运动不能试验、斜面试验和抓力测试（参见Fujimoto et al.22 和 Gold et al.23）。文中描述的平衡木行走（Beam-Balance）和平衡木通过（Beam-Walk）任务用于评估损伤后的前庭运动功能缺陷。前庭运动协调性可视为粗大运动行为的一种指标，而其他评估粗大运动功能障碍的方法还包括转棒试验（Rotarod）、旋转杆试验和开放场地活动测试。在水迷宫实验中测得的游泳能力（以游泳速度表示）也是粗大运动协调性的指标之一22,23。工作记忆水迷宫任务通过检测参考记忆缺陷（由第1次试验反映）和工作记忆缺陷（由第2次试验或第1次与第2次试验之间的差异反映），完善了这一整套测试体系。其他认知功能评估方法还包括八臂放射迷宫、巴恩斯迷宫、新物体识别试验以及多种水迷宫变体，后者包括原始的莫里斯水迷宫（Morris water maze）和Lashley III迷宫（同样参见Fujimoto et al.22 和 Gold et al.23）。该系列测试已被证实可在损伤后早期有效使用，并在不同程度上适用于损伤后长达12个月的评估1。
此外，本文展示的任务可适用于不同品系、性别和年龄的大鼠；但可能需要根据体型差异以及更脆弱的情况作出相应调整。例如，年龄较大、体重较重的大鼠在进行平衡木任务时需要更宽的横梁，而年老体弱的大鼠在进行水迷宫实验时可能需要缩短游泳时间。因此，这些测试具有一定的灵活性，也有潜力开发新的测试方法，以适应不同的实验条件和研究假设。

本文所述方法旨在检测大鼠创伤性脑损伤（TBI）实验模型所引起的特定脑区功能缺陷。将介绍四种不同的行为学测试。首先，简短的神经功能评估，称为神经评分（neuroscore），无需特殊设备即可实施，但操作者需经过练习；该测试用于检测反射功能的缺陷。其次，平衡木测试（Beam-Balance test）用于检测平衡能力的缺陷。该任务要求操作者根据等级量表对大鼠进行评分，因此操作者需接受一定培训。平衡木测试需使用一根狭窄的横梁，对前庭系统功能缺陷具有敏感性。第三项测试用于评估前庭运动协调能力，称为横梁行走任务（Beam-Walk task）。尽管需要对大鼠进行一定的预训练，但由于该实验以穿越横梁所需时间为客观指标，不依赖主观评分，因此比前两种测试更具客观性。其差异在于，测量的是大鼠穿越狭窄横梁到达安全箱所需的时间。横梁行走测试所需的横梁比平衡木测试更长，并需配备一个逃逸箱。该测试可评估运动协调和平衡能力两方面的缺陷，因此对小脑及与运动相关脑区的损伤具有敏感性。莫里斯水迷宫的工作记忆版本（MWM-WM）主要用于检测海马功能及其与前额叶皮层的整合能力，即执行功能。本文展示的莫里斯水迷宫版本也可用于检测参考记忆功能的缺陷1。
这些方法的选择基于其在文献中已确立的良好应用记录。多年来，不同实验室的研究人员使用多种大鼠品系均证明这些方法具有良好的有效性。然而，过去通常仅将损伤后两周内的损伤后评估指标视为有效 &#34;慢性&#34; 时间点。因此，为了建立用于研究啮齿类动物TBI慢性效应的行为学技术，需要评估这些已知方法在损伤后较长时间点检测TBI诱导功能缺陷的敏感性。尽管目前已有多种啮齿类动物TBI模型，但FPI模型是应用最广泛的模型之一，本研究亦采用该模型。该模型最早于20世纪50年代发表2，此后已有超过1,000篇论文在大鼠中应用了FPI3这种损伤的神经病理学特征已由我们进行了详细描述4 及其他人5,6,7简而言之，通过损伤后短时间内使用Fluoro-Jade染色已证实，海马区的神经元损伤具有剂量依赖性。 即，24-48 小时；而损伤后一年时已报道出现明显的萎缩和空洞化，包括内囊和皮层的变薄6,7.
评估实验性脑损伤后行为学结果指标是衡量脑功能最有意义的方法。然而，绝大多数使用行为学结果指标的FPI实验仅在损伤后相对较早的时间点进行检测，通常为损伤后1至14天。而采用本文所展示的方法，某些行为缺陷可在损伤后长达12个月内被检测到1。神经功能、粗大前庭运动功能和精细运动协调能力分别在术后第1-3天以及术后3、6和12个月时，通过简短神经功能评估（Neuroscore；改良自Schallert8）、平衡木平衡任务（Beam-Balance task）和平衡木行走任务（Beam-Walk task）9,10,11进行评估。参考记忆和工作记忆则采用工作记忆版本的莫里斯水迷宫（Morris water maze）进行评估1,12,13。

<table><tbody><tr><td>Sprague-Dawley 大鼠</td><td>Charles Rivers Laboratories&lt;br/&gt; 251 Ballardvale St&lt;br/&gt; 马萨诸塞州威尔明顿，01887-1096&lt;br/&gt; 电话：800-522-7287</td><td>CD-IGS 大鼠，品系编号 001</td><td>雄性，白化，到达时体重300-350克</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;平衡木测试&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>平衡木</td><td>自制</td><td></td><td>木头，25&quot; l x 1&quot; h × 3/4&quot; 用聚氨酯清漆密封</td></tr><tr><td>C形夹</td><td>家得宝</td><td>1422-C</td><td>2 1/2&quot;</td></tr><tr><td>屏障</td><td>家得宝</td><td></td><td>泡沫塑料，18&quot; x 17 1/2&quot;</td></tr><tr><td>（适用于 BB 的表格） &amp;和 BW）</td><td>通用办公用品</td><td></td><td>37&quot; h × 30&quot; w x 60&quot; l</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;平衡木行走&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>平衡木</td><td>自制</td><td></td><td>木料 38-1/2&quot; l × 1-3/4&quot; h x 1&quot; w 用聚氨酯清漆密封（约 37&quot; 离地</td></tr><tr><td>逃生箱</td><td>自制</td><td></td><td>木制，涂黑，12 1/2 &quot; l x 9&quot; h × 7-1/4&quot; w</td></tr><tr><td>钉子（插销）</td><td></td><td></td><td>2&quot;</td></tr><tr><td>铰链</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>夹子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>白噪声发生器</td><td>San Diego Instruments&lt;br/&gt; 9155 Brown Deer Rd, Suite 8, San Diego, CA 92121&lt;br/&gt; 电话：(858)530-2600</td><td></td><td>http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf</td></tr><tr><td>光</td><td>家得宝</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;姓名&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;莫里斯水迷宫&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃钢泳池</td><td>制造商未知</td><td></td><td></td></tr><tr><td>（类似于 SDI 生产的设备）</td><td>圣迭戈仪器公司</td><td>7000-0723</td><td>72&quot; 直径 × 30&quot; 深（约 500 加仑）</td></tr><tr><td>有机玻璃平台</td><td>由Maggie Parsley手工制作</td><td></td><td>10 cm 直径，26&quot; 平台表面涂有硅胶以提供防滑抓握面</td></tr><tr><td>（类似于 SDI 生产的设备）</td><td>SDI</td><td>7500-0272</td><td></td></tr><tr><td>带盖的聚甲基丙烯酸甲酯动物箱</td><td>UTMB 机械加工车间</td><td></td><td>2 个盒子，10&quot; w x 16&quot; L x 9&quot; h</td></tr><tr><td>聚光灯/加热灯</td><td>家得宝</td><td></td><td>3 个围绕水池，2 个置于箱子上方用于干燥动物</td></tr><tr><td>AnyMaze</td><td>San Diego Instruments&lt;br/&gt; 9155 Brown Deer Rd, Suite 8, San Diego, CA 92121&lt;br/&gt; 电话：(858)530-2600</td><td>/9001</td><td>http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/</td></tr></tbody></table>

检测大鼠创伤性脑损伤后的行为缺陷

Detecting Behavioral Deficits in Rats After Traumatic Brain Injury

随着创伤性脑损伤（TBI）在平民和军人人群中发病率的不断上升，TBI 目前已被视为一种慢性疾病；然而，针对 TBI 动物模型中损伤长期影响的研究仍十分有限。本文展示的行为学检测方法在 TBI 研究中已被广泛采用，适用于损伤后早期（如两周至两个月）的评估。其中部分方法虽曾有少数实验室用于损伤后更长时间（长达一年）的检测，但应用极为罕见。本文所演示的方法包括：用于检测反射功能的简短神经功能评估、用于检测平衡能力的平衡木测试（Beam-Balance）、用于检测平衡与运动协调能力的行走木测试（Beam-Walk），以及一种可敏感反映参考记忆缺陷的工作记忆版莫里斯水迷宫实验。雄性大鼠在接受矢状旁路液体冲击损伤（FPI）或假手术处理前，均经过神经功能、平衡及运动协调测试的适应性操作和预训练。简短神经功能评估（神经评分）、平衡木测试和行走木测试可在同一只大鼠上进行多次重复检测，而水迷宫测试则只能进行一次，原因是大鼠会对任务产生记忆，若在同一动物上重复测试将干扰结果的准确性。在损伤后1至3天进行检测时，三项非认知任务均可检测到显著差异；然而，在较晚时间点（3个月后），行走木测试中的差异已无法检出。平衡木测试中的功能缺陷可持续至3个月，神经评分的缺陷则可持续至6个月。工作记忆的缺陷可延续至损伤后12个月，而参考记忆的缺陷首次在12个月时被发现。因此，标准行为学测试可作为评估FPI后持续性行为功能缺陷的有效指标。

神经评分程序的结果（图2) 既展示了假阳性结果的可能性（第0天的假手术组和TBI组），也体现了该检测方法在识别微小差异方面的敏感性。当大鼠对实验操作未充分适应时，可能无法完全放松，从而导致假阳性结果。第0天为手术前，因此理想情况下，所有大鼠在进入研究前均应达到评分为0的标准。第1至3天的结果则反映了该检测方法对评分微小变化的敏感性。尽管评分最高可达21分，但在本模型中，评分超过3分的情况较为罕见。在此示例中，重复测量方差分析（ANOVA）显示，NAÏVE组在各时间点之间无显著差异p = 0.78）或 SHAM（p = 0.09）；然而，对于TBI组而言，各天之间存在差异（p &lt; 0.05). 事后 成对比较表明，第0天与第1、2、3天之间存在显著差异。该结果表明，损伤在神经学评估中引起了虽小但显著的变化。
进一步采用 Kruskal-Wallis 检验对每一天的 NAÏVE、SHAM 和 TBI 组进行比较，随后进行 Tukey's post-hoc 检验以确定差异的具体来源。在第 0 天，检验统计量为 13.37，p = 0.001，SHAM 组与 NAÏVE 组之间存在显著差异（p = 0.008）。理想情况下，第 0 天各组之间应无任何差异，因为尚未实施任何处理或操作。在此情况下，应进一步使大鼠适应实验操作，或将其转入非行为学研究。在第 1 天，检验统计量为 32.39，p = 9.75e-8，post-hoc 检验显示 SHAM 组和 TBI 组均显著不同于 NAÏVE 组（p = 0.002，p = 5.9e-7）。在第 2 天，检验统计量为 23.39，p = 8.34e-6，SHAM 组和 TBI 组均与 NAÏVE 组存在显著差异（p = 0.002，p = 6.8e-5）。在第 3 天，检验统计量为 38.4，p = 4.59e-9，SHAM 组和 TBI 组再次显著不同于 NAÏVE 组（p = 0.001，p = 2.1e-8）。这些结果表明，SHAM 手术本身在损伤后早期也可能导致一定程度的神经功能评估缺陷。
典型的平衡木实验结果（图3）显示，平衡木测试在损伤后不久（图3，左）以及损伤后较长时间（图3，右）均能敏感地检测出功能缺陷。然而，随着未损伤大鼠的年龄增长和体重增加，它们在平衡木上保持平衡的难度加大，导致平衡木测试对脑损伤效应的敏感性随时间推移而降低。在较晚的时间点，需将平衡木翻转，使大鼠在较宽的一侧保持平衡。尽管如此，在损伤后6个月，该测试已不再对损伤效应敏感，因为年龄和/或体重因素干扰了任务执行能力（图3，右）。另一种可能是前庭系统已发生修复，这些数据准确反映了大鼠的平衡能力已恢复至对照组水平。
在比较每天空白对照组、假手术组和TBI组时，我们采用了Kruskal-Wallis检验。损伤后早期时间点的结果如图所示 图3，左侧。在第0天，Kruskal-Wallis检验得到的检验统计量值为6.81， p = 0.033。各组之间存在显著差异，经Tukey法检验 事后 检测结果显示，Naïve 组与 SHAM 组存在差异（p = 0.038）；然而，所有三组的均值均远低于2.0，表明所有大鼠均符合继续实验的标准。尽管在第0天各组之间 ideally 无差异更为理想，但由于所有组别均值均低于2，因此均可继续进入研究。在PID 1时，Kruskal-Wallis检验统计量为69.72， p = 7.25e-16。Tukey's 事后 检验结果显示，TBI组与Naïve组和Sham组均有显著差异（p = 4.9e-14 p = 9.1e-08）。第2天，Kruskal-Wallis检验统计量为62.84，且 p = 2.26e-14，且 事后 测试显示TBI与NAÏVE和SHAM不同（p = 1.0e-10 p 分别为 2.1e-10）。第3天，Kruskal-Wallis 检验统计量为 62.69，且 p = 2.44e-14。该 事后检验 检测显示TBI与Naïve和SHAM不同，（p = 9.6e-12 p = 1.7e-08）。我们进一步分析了各组内不同时间点之间是否存在差异。采用重复测量方差分析（repeated measures ANOVA）发现，NAÏVE 组各时间点之间无显著差异（p = 0.367）。SHAM组与TBI组在不同时间点之间存在差异（p = 0.002, p = 3.90e-29）。 事后 成对比较显示，假手术组第1天与第2天及第3天相比具有显著差异（p = 0.001, p = 0.01），而对于TBI，第0天与第1、2、3天相比具有显著差异（p &lt; 2e-16 p = 5.5e-16，且 p = 2.7e-13）。第1天与第3天之间也存在显著差异（p = 0.036).
伤后6个月时，采用Kruskal-Wallis检验在每一天对NAÏVE、SHAM和TBI组进行比较（图3，右侧）。在第0天，检验统计量的值为3.36，且 p = 0.187，因此第0天各组间无差异。所有均值均低于2，表明所有大鼠及各组均符合继续参与研究的标准。在PID 1时，检验统计量为6.11， p = 0.047；然而， 事后 使用Tukey法进行分析 事后 检验结果显示，在校正多重假设检验后，各组之间无显著差异。第2天的检验统计量为4.09， p = 0.13，无显著性差异；在第3天，检验统计量为2.91， p = 0.23，无显著性差异。因此，在任何指定时间点，各损伤组之间均无差异。
此外，通过观察各治疗组内不同时间点之间的差异，重复测量方差分析显示，NAÏVE、SHAM和TBI组在不同天数之间均存在显著差异（p = 0.0003，p = 2.61e-5，p = 5.59e-7，分别对应；图3，右侧）。事后检验（post-hoc）揭示了以下差异：在NAÏVE组中，第0天与第1、2、3天之间差异显著（p = 0.002，p = 0.044，p = 0.004，分别对应）；在SHAM组中，所有时间点之间均存在显著差异：第0天与第1、2、3天差异显著（p = 0.0006，p = 0.001，p = 0.0006，分别对应）；第1天与第2、3天差异显著（p = 0.031，p = 0.0006，分别对应）；第2天与第3天差异显著（p = 0.044）；在TBI组中，第0天与第1、2、3天之间差异显著（p = 0.0005，p = 0.0008，p = 0.0005，分别对应）。
横梁行走实验的结果显示在两个时间点（图4）。与横梁平衡实验相似，该实验可在损伤后早期检测到功能缺陷（图4，左图）。然而，在损伤后6个月时，各组之间无显著差异（图4，右图），提示损伤组已发生恢复。此结果可能反映了年龄较大和体重增加的影响。
为了比较损伤后早期各天 NAÏVE、SHAM 和 TBI 组之间的差异，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。第 0 天无显著差异（F = 0.859，p = 0.426），所有潜伏期均低于 5 秒，表明所有大鼠均符合继续参与研究的标准。在损伤后第 1 天（PID 1），检验统计量显著，为 15.36，p = 1.18e-6。Tukey 事后检验（post hoc test）显示，TBI 组与 NAÏVE 组之间（p = 0.000004）以及 TBI 组与 SHAM 组之间（p = 0.0001）存在显著差异。第 2 天，各组间存在显著差异（F = 9.49，p = 0.0002）。事后检验（post-hoc testing）结果显示，TBI 组与 NAÏVE 组（p = 0.0002）以及 TBI 组与 SHAM 组（p = 0.005）之间存在差异。第 3 天，总体检验统计量为 6.27，p = 0.0025，表明各组之间存在差异。Tukey 事后检验（post-hoc test）显示，TBI 组再次与 NAÏVE 组和 SHAM 组存在显著差异（p = 0.003，p = 0.035，分别对应）。
采用单因素重复测量方差分析（one-way repeated measure ANOVA）探索各治疗组内不同时间点之间的差异。首先检验每个组的球形假设。NAÏVE组和SHAM组的组内因子（Day）均不满足球形假设，因此对这两个组应用Greenhouse-Geisser连续性校正。对于SHAM组，各时间点之间无显著差异（p = 0.066），对于NAÏVE和TBI组则存在（p = 0.006, p = 2.89×10⁻⁷，分别）。 事后 比较显示，对于NAÏVE，差异存在于第0天与第1天之间（p = 0.003）。对于创伤性脑损伤（TBI），差异存在于第0天与第1、2、3天之间（p = 9.2e-6, p = 0.0005, p = 0.002），且第1天与第3天之间存在差异（p = 0.018).
伤后6个月时，NAÏVE、SHAM和TBI组在任何一天均无显著差异（第0天，F = 0.315，p = 0.732；第1天，F = 0.336，p = 0.717；第2天，F = 0.5，p = 0.61；第3天，F = 1.17，p = 0.322；图4，右侧）。当比较各组内不同时间点之间的差异时，TBI组存在显著差异（p = 0.026），其中第0天与第1、2、3天均不同（p = 0.026，p = 0.002，p = 0.002）。NAÏVE组和SHAM组在任意时间点之间均无显著差异（p = 0.104，p = 0.063， respectively）。
Morris水迷宫工作记忆版本的数据可以通过多种方式绘图。此处我们展示了损伤后3个月（图5，左）和12个月（图5，右）的结果，采用线图表示时间进程，箱形图提供数据的总体汇总（图5，底部）。我们还可以分别可视化每天的第1次试验与第2次试验的比较结果，以及损伤导致的总体差异。第1次试验的潜伏期反映参考记忆，第2次试验的潜伏期反映工作记忆。
损伤后3个月大鼠的数据如图所示 图5，左侧。对于试验1（图5，左上）中，在比较NAÏVE、SHAM和TBI组时，仅第4天显示出组间显著差异F = 4.12, p = 0.025），且 事后 Tukey 检验显示，TBI 与 NAÏVE 存在差异（p = 0.019）。对于试验 2（图5，中左），第1天存在显著差异（F = 5.93, p = 0.006），且 事后 分析表明，TBI 与 SHAM 不同（p = 0.005）。重复测量方差分析在3个月时未发现损伤组间存在总体差异（p = 0.56）。这些结果表明，这些大鼠在损伤后3个月时，参考记忆和工作记忆均存在轻微但显著的缺陷。
伤后12个月，比较试验1的NAÏVE、SHAM和TBI组图5，右侧），重复测量方差分析显示损伤具有显著的整体效应（F = 3.94, p = 0.03）。成对比较显示，TBI 与 NAÏVE 和 SHAM 均存在显著差异（p = 0.043 和 p = 0.006，分别）（图5，右下角）。此外，通过单因素方差分析（one-way ANOVA）对每天的损伤组进行比较，在第3天检测到显著差异（F = 7.28, p = 0.003). 事后 比较显示，TBI 与 SHAM 不同（p = 0.0018) (图5，右上角）。对于试验2，重复测量方差分析发现损伤导致的差异具有统计学意义（F = 3.97, p = 0.029），且 事后 成对比较检测 TBI 与 SHAM 之间的差异（p = 0.017) (图5，右下角）。对每一天进行单因素方差分析，结果显示第2天和第4天存在显著差异。第2天（F = 4.02, p = 0.028），Tukey's 事后 检验发现，TBI 与 SHAM 存在差异（p = 0.023）。第4天（F = 4.12, p = 0.026), 事后 分析发现TBI与SHAM之间存在差异（p = 0.025) (图5，中右。
<img alt="显示四个编号点指示方向 N、E、S、W 的罗盘图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56044/56044fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1. 水迷宫示意图。 本图展示了工作记忆型莫里斯水迷宫中可能的平台位置（1、2、3、4）和起始点（N、S、E、W）。每对起始位置与平台位置组合允许大鼠进行两次试验。每次试验之间有 15 秒的间隔，每对试验之间在加热舱内休息 4 分钟，每个日间实验共进行四对试验。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56044/56044fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="损伤后三天内对 naive、sham 和 TBI 评分的柱状图比较；统计分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56044/56044fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 神经评分测试结果。 所有大鼠在第0天前均接受了简单反射测试任务的训练（训练、测试和评分的详细信息见正文）。结果以中位数（黑线）、第一和第三四分位数（方框边界）以及第10百分位数表示。th 和 90th 百分位数（误差线）。均值由红线表示，离群点以黑点表示。数据展示了伤后第0天（基线）以及伤后第1至第3天的情况。结果的 事后 t 检验每个时间点的检验结果均显示在图中：* p &lt; 0.001 对比 TBI 第0天；^ p &lt; 0.001 对比同日初始型（NAÏVE）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56044/56044fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="TBI 恢复评分的箱线图分析；显示伤后 0-3 天和 6 个月的数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56044/56044fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 木梁平衡测试结果。 所有大鼠均接受平衡训练，直至能够连续三次在横梁上保持平衡达60秒（训练、测试及评分细节见正文）。在后续测试中，大鼠的评分采用1–6分制，1分表示平衡正常，6分表示完全未尝试停留在横梁上。结果以中位数（黑线）、第一和第三四分位数（方框边界）及10th 和 90th 百分位数（误差线）。均值以红线表示，离群点以黑点表示。数据展示了伤后第0天基线评分、伤后第1-3天（左）和伤后6个月（右）的结果。 事后 t 检验每个时间点的检验结果均显示在图中。对于第 0-3 天：* p &lt; 0.001与TBI第0天相比；^ p &lt; 0.001 与同日初始型（NAÏVE）相比；@ p &lt; 0.001 与同日假手术组比较。6 个月时：* p &lt; 0.001与TBI第0天相比；# p &lt; 0.001 对比 初始状态 第0天； &amp; p &lt; 0.001 对比假手术组 第0天 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56044/56044fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="不同时间点比较幼稚组、假手术组和TBI组损伤后评分的箱线图；实验数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56044/56044fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. 穿杆实验结果。 所有大鼠均经过训练，使其在杆上行进时穿梭于柱子之间，以逃入安全箱。训练持续至大鼠连续三次试验的成绩达到 ≤ 5 秒的标准（训练、测试及评分的详细信息见正文）。基线测试于损伤后第 0 天完成，随后在损伤后第 1 至 3 天进行测试（左图）。部分大鼠还在损伤后 6 个月时重新进行了测试（右图）。结果以中位数（黑线）、第一和第三四分位数（方框边界）以及第 10 百分位数表示th 和 90th 百分位数（误差线）。均值由红线表示，离群点以黑点表示。结果的 事后 每个时间点的检测结果均显示在图中。对于第 0-3 天：* p &lt; 0.001与TBI第0天相比；^ p &lt; 0.001 对比同日初始型；@ p &lt;0.001 与同日假手术组比较；持续 6 个月：* p &lt; 0.001与TBI第0天相比 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56044/56044fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="认知功能表现图；TBI后潜伏期与试验次数的关系，涉及未处理组、假手术组和TBI组。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56044/56044fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5. 工作记忆型莫里斯水迷宫实验结果。 结果显示了3个月（左列）和12个月（右列）时各组大鼠的独立数据。 上图 显示五个测试日中，每天双试验配对第一次试验的平均潜伏期（大鼠找到隐藏平台所需的时间）。 中间的图面板 显示每天第二次试验的平均潜伏期。结果的 事后 分析结果在图中显示（* p &lt; 0.05 对比同日假手术组；^ p &lt; 0.05 对比同一天的初始状态（NAÏVE）。 下层面板 总结展示结果 中位数（黑线）, 25th 和 75th 百分位数（箱线图的边界）以及 10th 和 90th 百分位数（误差线）。均值由红线表示，离群点以黑点表示。结果的 事后 分析结果如图所示（*p &lt; 0.05 与相同试验的假手术组相比，^ p &lt; 0.05 对比相同试验的NAÏVE组。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56044/56044fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文所介绍的行为学测试旨在检测大鼠在创伤性脑损伤后的功能缺陷。文中提供了四种特定测试，用于检测行为缺陷，以反映损伤后长达一年时间内特定脑区所受到的损害。

随着创伤性脑损伤（TBI）在民用和军事人群中发病率的不断上升，TBI 现已被视为一种慢性疾病；然而，……

本行为学实验的总体目标是检测大鼠在创伤性脑损伤后的功能缺陷。将介绍四种不同的测试方法，用于检测神经功能或认知功能的缺陷。这些方法有助于回答脑损伤研究领域中的关键问题，例如损伤后大脑的哪些区域受到损害，或某种实验性治疗是否有效。这些技术的主要优势在于，它们已在众多实验室中得到广泛应用，并被证实具有良好的可重复性，且对多种类型的脑损伤（如爆炸伤和中风）具有敏感性。这些技术有助于进一步理解创伤性脑损伤对神经功能和认知功能的影响，同时也可用于在大鼠中测试实验性治疗方法。通常，初次接触该方法的研究人员可能会因缺乏大鼠操作经验，以及未给予大鼠足够的适应时间便开始训练和测试而遇到困难。此步骤旨在使大鼠保持镇静，以提高测试时间的有效性。首先进行前肢屈曲测试，通过提起大鼠的尾巴，将其固定在距离桌面约15至30厘米的高度，观察大鼠前肢是伸展还是屈曲。在评分表上，若存在屈曲则记为1，若无屈曲则记为0。接着进行后肢屈曲测试，再次抓住大鼠尾部将其提起，使其位于桌面以上约6至12英寸的高度。观察大鼠后肢是否伸展或屈曲，并在评分表上根据屈曲的存在记为1，或根据屈曲的缺失记为0。进行下一项测试时，抓住大鼠的尾巴将其提起，缓慢地将其向桌面边缘靠近，直至鼻部距离桌缘约10厘米。缓慢移动大鼠靠近边缘，但不得使触须接触桌缘。观察大鼠是否伸展前肢朝向桌面做出抓取动作。记录前爪伸展的有无。接着进行接触诱发放置试验时，将大鼠身体和手保持与桌缘平行，前肢自由悬垂。缓慢将大鼠 lowered 至桌缘，直至一侧的触须接触到桌边。观察大鼠在触须接触桌面时，是否立即将与触须同侧的前肢伸向桌缘。记录大鼠是否出现朝向桌面的抓取动作。最后，在进行后肢抓握反射测试时，用一只手握住大鼠，拇指和食指置于前肢下方的胸部位置。用食指轻轻触碰每只后肢的掌心，观察大鼠是否抓握食指，并记录抓握动作的有无。术后24小时，开始进行横梁平衡测试，将大鼠置于横梁上并启动计时器。密切观察大鼠60秒，并在记录表上记录评分。在每次试验之间，让大鼠在实验者手臂上或其饲养笼内短暂休息。首先将大鼠放入目标箱中一分钟。一分钟后，取出大鼠，开启光源和白噪声以开始试验。将大鼠放置于靠近目标箱的钉孔位置处的横梁上，允许其进入目标箱。当大鼠前肢越过目标箱阈值时，立即关闭光源和噪声源，记录单次试验结束。每次试验之间，让大鼠在目标箱中休息30秒。在每个 peg 位置及起始位置各重复一次平衡木行走训练。将 peg 插入孔中，并在 peg 处于原位时完成一次完整的平衡木行走实验。然后，使用秒表记录每次实验的时间，并重复实验，直到大鼠完成三次均在五秒以内的实验。术后24小时，使用带钉的完整横梁对大鼠进行横梁行走测试。在房间周围设置视觉线索，为大鼠提供学习和记忆隐藏平台位置的参照物。开始第一次试验时，打开视频追踪软件并加载正确的实验方案，包括含平台位置的水迷宫地图、游泳时长、试验次数、动物数量及处理组信息。将平台置于指定位置，并确认其与软件中的地图一致。随后，将大鼠面朝池壁放入指定位置的水中，并立即启动追踪程序和/或秒表计时器。给予大鼠 120 秒时间寻找平台。当大鼠找到平台时，停止计时器，并将时间记录在工作表上。注意，如果大鼠未能找到平台，需用手将其引导至平台，并记录时间为 120 秒。每次试验之间，让大鼠在平台上停留15秒。第二次试验后，将大鼠放入加热的围栏中持续4分钟。最后，将平台移至第二个位置，并确认其与软件中的地图一致。重复试验一和试验二的步骤，直至完成全部四个起始位置与平台配对组合。神经评分结果表明，在手术前（第零天）可能存在假阳性结果，同时该检测方法对创伤性脑损伤组中微小差异具有敏感性，使得第零天的结果与第一、二、三日的结果存在差异。平衡木实验结果表明，平衡木测试在损伤后不久以及较晚的时间点均能敏感地检测出神经功能缺陷。光束行走实验的结果表明，损伤后早期即出现功能缺陷。然而，损伤后六个月时，各组之间已无显著差异，提示损伤组已实现恢复。此外，损伤后三个月时表现出工作记忆缺陷，而在损伤后12个月时，工作记忆与参考记忆均表现出缺陷。让大鼠适应抓握操作，并预先训练其进行神经评分、横梁行走和横梁平衡测试非常重要。掌握这些测试后，简短的神经学评估可快速完成，且无需任何专用设备。在完成神经评分、横梁平衡和横梁行走实验后，可采用不同版本的水迷宫实验，以及其他行为学范式（如新物体识别测试），以回答有关学习与记忆的进一步问题。观看本视频后，您应能充分理解如何通过行为学检测方法来识别神经功能与认知缺陷。在开展行为学实验时，对动物进行适应性抓取训练、预训练以及操作过程中的规范一致性都至关重要。

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