Name: 细菌显示文库的半自动化筛选肽亲和试剂的发现与分离结果分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: 学习利用细菌展示文库的半自动化生物淘选方法，快速分离特异性肽类亲和试剂并有效去除非特异性结合物。该技术可在约一周内完成肽类试剂的分离，适用于生物检测与疾病诊断等多种应用场景。

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作者谨此感谢美国陆军研究实验室（ARL）博士后研究基金项目的支持，该项目由橡树岭联合大学通过与 ARL 的合同负责管理，并资助了 Justin P. Jahnke 博士的任命。其余经费由 ARL 传感器与电子器件理事会提供。作者还感谢加州大学圣塔芭芭拉分校（UCSB）的 Daugherty 实验室分享了细菌展示文库以及 YPet Mona 试剂的克隆信息，感谢 ARL 的 Bryn Adams 博士在 ARL 完成 YPet Mona 试剂克隆工作期间提供的支持，感谢 Joshua Kogot 博士在细菌展示文库的生物筛选（biopanning）方面的初期工作和培训，感谢 Edgewood 化学与生物中心的 Alena Calm 分享用于表达和纯化 abrax 和 rivax 蛋白的质粒，感谢 Brandi Dorsey 在 PA 结合肽分离方面的技术支持，感谢 Qin Guo 在分离 abrax 结合肽的初步实验中提供的技术支持，以及感谢 Jessica Terrell 博士对本手稿撰写过程中提出的有益讨论。

作者无任何利益冲突需要披露

利用细菌展示文库进行生物淘选（biopanning）已被证明是分离亲和试剂的有效方法，而多肽在需要特定条件（如在极端环境中保持稳定性）时，可作为识别分子的有用替代抗体的选择。通过本文所述的自动磁性细胞分选（autoMCS）方法，这些文库的生物淘选过程已得到简化，且市售的autoMCS平台进一步将该技术推广至更广泛的用户群体。与传统的交替使用磁性细胞分选（MCS）和荧光激活细胞分选（FACS）的方法相比，autoMCS方法成本更低，因其无需购置价格更高的FACS分选仪器来分离结合细胞，而仅需使用本文所采用的仅具备分析功能的流式细胞仪即可14。通过autoMCS实现成功生物淘选的关键步骤包括：分选程序的选择、针对潜在交叉反应物进行阴性分选以减少假阳性结果、利用FACS监测文库富集程度以确定生物淘选的终止时机，以及对候选克隆池进行智能分析，以避免对数百个候选子进行繁琐的筛选。
本文所述实例展示了针对两种不同靶标PA和abrax，成功对选定的细菌展示文库进行生物淘选的结果，尽管由于四轮生物淘选后各候选克隆池的肽序列存在差异，分析策略略有不同。PA的分析相对直接，通过对144个克隆中至少重复出现一次的肽序列进行分析，可明显观察到序列趋势。仅此一点就足以确定PA靶标的共识序列，且含有该共识序列或类似序列的克隆在结合PA与结合链霉亲和素阴性对照的比值方面表现最佳。然而，情况并非总是如此。对于abrax靶标，测序100个克隆后得到5个重复序列，但这些序列中的趋势不如PA明显，仅能观察到倾向于含有芳香族氨基酸残基以及天冬氨酸或天冬酰胺。仅基于重复序列预测出的&#34;共识&#34;序列虽可被合成并检测其对abrax的亲和力，但由于没有任何亲本序列包含该精确的共识序列，我们重新审视了测序克隆列表，发现其他一些候选序列彼此之间具有更多共通趋势。事实上，有两个克隆的序列与仅基于重复序列得出的&#34;共识&#34;序列（FWDTWF而非FWAWF）相似，其同样具有色氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸残基的趋势，但残基间距不同。其中一个肽序列是重复出现的，另一个则不是。这两个序列以及第三个含有类似变体的序列，在检测的候选物中均为对abrax亲和力最高的前五名结合肽之一。总体亲和力最高的结合肽AX-A05也表现出类似的趋势。abrax的结果表明，针对某些靶标，可能需要在序列分析与亲和力及特异性分析之间多次交替进行。abrax靶标的结果还表明，可在高度相似的蛋白质（rivax 1,15）之间实现较高的特异性识别水平。
本研究选用的自动磁性细胞分选（autoMCS）程序为Posselds和Posseld，二者均适用于初始群体中频率较低（低于5%）的标记靶细胞的正向筛选。在这两种程序中，细胞均需通过两个磁性柱。然而，在Posselds程序中，细胞通过第一个磁性柱的速度更慢，以延长暴露时间41。除了参考商用autoMCS设备制造商提供的程序说明（见材料表）41外，我们还通过初步比较多个潜在程序后选择了上述两种程序。比较内容包括：各程序在均一的阴性对照细胞培养物中避免非特异性捕获假阳性细胞的能力，以及从含有递减比例已知结合物的混合培养物中成功分离出针对目标分子的已知结合物的能力。若新应用与本文所述应用场景存在显著差异，则进行类似的比较可能有助于选择合适的程序。然而，已有发表的研究比较了这两种程序（Posseld与Posselds）在分离针对PA的肽亲和试剂中的表现，结果显示，在四轮生物淘选中均使用任一程序，均可获得对PA具有相似亲和力和特异性的肽，并确定出WXCFTC共有序列。主要差异在于：Posseld因流速较快，分选速度更快，因此仅经过两轮生物淘选即可获得较高的靶标结合亲和力；而使用Posselds则在四轮生物淘选后可获得更多的独特序列14。基于此经验，我们在筛选abrax结合肽时略微调整了策略，以兼顾两种程序的优势：第一轮使用Posselds程序，以便在多样性最高的关键步骤中延长暴露时间；随后在第二至第四轮切换为Posseld程序，以更快地分离出亲和力最高的结合物1,15。该策略对abrax而言似乎更为理想，尤其是第四轮分选中abrax的nMFI值和结合百分比均高于使用任一程序进行PA第四轮分选的结果（图2 和图3，以及Sarkes et al. 201514）。然而，若要得出更具结论性的比较结果，还需针对同一靶标直接比较两种策略。对于特定应用而言，最佳程序的选择可能取决于具体靶标、所用分选文库，以及在本文所述条件基础上进行任何调整后所实现的肽表达水平。
本文未讨论与非生物材料进行生物淘选的潜在结果，但我们已使用相同的细菌展示文库对块体铝进行生物淘选2。该研究未使用autoMCS完成，但如果材料可直接存在于磁珠上，或可包被或偶联至磁珠，则类似研究可通过autoMCS实现。在块体铝的研究中，单个氨基酸分析和二级结构建模有助于理解分离出的肽段结合亲和力的驱动因素，因为未确定共识序列2。即使针对生物靶标，也可能需要此类分析来阐明某些靶标结合亲和力的驱动机制，因此由&#34;eCPX_Sequencing&#34;宏生成的电子表格中包含一个标签页，提供单个残基频率分析。然而，如果除缺乏共识序列外，未观察到重复序列，且残基频率也未显示任何模式，则可能需要其他类型的分析。此外，可能需要进行更多轮次的分选，以避免在筛选大量候选序列时难以进一步缩小具有足够靶标亲和力的候选范围。
随着下一代测序技术的日益普及，可以在进行亲和力测试前更全面地研究以确定最具潜力的候选序列，并可在每轮生物淘选后评估富集程度。然而，进入结合分析阶段的序列可能需要通过克隆重新构建，如果其频率不够高，无法通过常规的数十或数百个菌落测序轻松分离获得。随着该技术的发展，成本不断降低并变得更加常规化，特别是若能结合菌落分离选项，这很可能成为分析生物淘选数据的最佳方法。该技术可能有助于阐明单个序列乃至整个文库的演化过程。此外，分选文库中的细菌可能随时间发生突变，这可能导致分选偏向于生长速度更快的细胞，或偏向于过度表达基因组蛋白的细菌——这些蛋白即使在没有展示支架和肽表达的情况下也能与材料结合。因此，一旦发现有前景的候选序列，值得分离质粒DNA，重新转化新鲜的 E. coli，并通过流式细胞分选（FACS）验证肽的结合能力。如果计划将肽用于无细胞体系，还应评估游离肽的亲和力。例如，通过细菌展示技术发现的针对靶标SEB的肽亲和试剂，已被合成为无细胞形式，并采用更传统的方法（如酶联免疫吸附测定，ELISA）进行分析；同时通过FACS（细胞上）和ELISA（无细胞）两种方法测定Kd值，比较其在细胞上与无细胞状态下的亲和力7。
尽管生物素-链霉亲和素相互作用的强结合力使其成为捕获蛋白质靶标及其结合肽的理想策略，但该方法也可根据其他捕获策略进行调整。将蛋白质直接偶联至磁珠（如环氧基或羧酸基磁珠）已被成功应用，并可省去一个结合步骤。然而，直接连接可能以特异或非特异性方式阻碍潜在的结合位点，具体取决于偶联策略。使用链霉亲和素磁珠的另一个优势在于，稳定性较差的蛋白质靶标可在30分钟内新鲜生物素化，必要时亦可冻存；而磁珠本身通常需要较长的孵育时间以实现蛋白质交联，且一般保存于2–8°C。本文建议的生物素化蛋白质靶标起始浓度为600 nM，该浓度已成功适用于多种靶标，但若降低该浓度，可能有助于分离出亲和力更高的肽捕获试剂。此外，本方法还可拓展并修改用于其他细菌展示文库及其他生物体。例如，这些步骤可在无氧条件下进行以适用于厌氧菌，或在其他特殊环境中进行以适用于嗜极菌，从而分离具有独特性质的肽。针对特定目标所获得的肽序列和/或保守序列，可潜在地作为活体材料在细胞上直接使用，或在体外合成生产。合成制备的肽可进一步优化，用于开发亲和力更高、更稳定的蛋白质催化捕获（PCC）试剂，应用于传感器，或替代抗体用于结合与识别的其他应用场景。

关键词：生物素-链霉亲和素系统，磁珠偶联，蛋白质捕获，肽展示，细菌展示文库，蛋白质催化捕获（PCC），合成肽，亲和筛选，极端环境微生物，厌氧菌 38,55分子建模也可用于辅助确定肽段与其靶标结合的位置，近期针对abrax结合肽段及其中所列共识序列的研究即采用了该方法 图5C 1总体而言，利用细菌展示文库进行生物淘选以获得多肽亲和试剂，是一种快速、直接且强大的抗体替代方法，可用于靶蛋白的识别与检测；这种半自动化的生物淘选方法已产生可靠结果，并具有广泛的应用前景。

生物淘选是亲和试剂发现的一种成熟技术，而细菌展示文库是获取肽类亲和试剂的便捷来源1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24。与噬菌体展示25,26和酵母展示27,28类似，肽段暴露于细胞表面，可结合生物性或非生物性靶标，其相互作用由肽骨架及氨基酸侧链的独特性质共同驱动29。与噬菌体展示不同的是，细菌自身具有自我复制能力，且携带展示所需全部遗传物质，无需洗脱结合的噬菌体并重新感染细胞。与酵母展示相比，细菌展示速度更快，因为大肠杆菌（Escherichia coli）的倍增时间极短（约20分钟30）。由此获得的肽类亲和试剂可在离体条件下生产，用于多种传感平台16,17,26，也可在细胞表面展示时作为活体材料使用2,31,32。与用于识别特定靶标的单克隆抗体相比，肽段体积更小、结构更灵活，且可在DNA水平上轻松操控肽展示文库，以避免特定氨基酸（如半胱氨酸）的出现33。由于肽类易于发现、可重复地进行合成（离体）生产，并在极端环境中仍能更好地保持性能，即使经历高温处理或长期无需冷藏储存后仍具备功能活性37,38，因此在治疗领域34,35,36及其他原本使用抗体的应用中正日益受到重视。克服试剂储存过程中对冷链依赖的能力，尤其受到美国国防部等机构的关注，因其需在极端环境下开展作业。因此，针对本文所列举的目标分子所开发的亲和试剂，热稳定性是一项理想特性。
近年来，利用半自动化的磁激活细胞分选（MACS 或 MCS）方法，细菌展示文库的生物筛选已变得更加简便且可靠9,14,39。这些方法已在多种相似但各有优势的分选平台上被验证可用于生物靶标，其中包括一种 commercially available 的自动化磁激活细胞分选（autoMACS 或 autoMCS）仪器（参见材料表）1,14,15，以及一些更专业化的设备，可将样品封闭在一次性 cartridge7,9 或芯片39中，这对于处理生物安全等级为 2 级（BSL-2）或更高的生物体或毒素而言是一项重要的技术指标7。如果目标材料具有磁性，或能够包被于磁珠表面，则这些半自动化方法也可拓展用于筛选能够结合非生物材料的多肽；此外，若调整分选与培养条件，该方法还可适用于不同类型的生物体（如厌氧细菌）。除了用于细菌展示文库的分选外，本文所使用的 commercial autoMCS 仪器还曾部分用于在酵母表面展示的人源单链抗体片段的初步筛选，后续再通过荧光激活细胞分选（FACS）进一步分离40。半自动化的主要优势在于显著缩短分选时间并减少人工操作，同时在洗涤步骤中更高效、更可重复地去除未结合的细胞，从而降低假阳性率，减少所需分选轮次，并简化后续分析流程9,14。对于 commercial autoMCS 仪器而言，其内置多种预设程序，可针对不同应用需求进行优化，例如负向预分选（去除非目标细胞）、优先提高纯度、最小化终末样品体积，或调节对稀有细胞分离的灵敏度41。
本研究的重点是展示如何使用市售的 autoMCS 仪器对细菌展示文库进行生物淘选，并阐述在分析和缩小候选分子池时所采用的思维过程，以促进该方法向其他应用的拓展。本研究所使用的展示文库（见材料表）12,13 包含约 109–1011 个独特的15肽，这些肽通过改造后的细菌外膜蛋白 OmpX 以无约束形式展示在细胞表面，若以合成方式生产，其性质预期与溶液中的游离肽相似。该蛋白支架在C末端还包含一个阳性对照P2X肽，可通过其与YPet Mona的结合来监测表达情况。然而，对于特定应用而言，只要具备足够多样性及其他必要特性的商用或新型文库，均可采用类似的生物淘选流程，尽管可能需要进行一些微小调整。本生物淘选方案的示意图见图1。此外，该方案也可适配于其他自动化磁性分选平台及其他分选策略。已有研究成功采用台式磁铁进行手动磁性分选，但因假阳性率升高，后续分析更为复杂且耗时14；尽管如此，若无自动化磁性细胞分选设备，手动方法仍可作为autoMCS步骤的替代方案。

<table><tbody><tr><td>autoMACS Pro 分离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>用于磁珠的自动化细胞分离仪</td></tr><tr><td>LB 培养基（Miller 配方）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>生长培养基</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP904-100</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-500</td><td>增稠/凝胶剂</td></tr><tr><td>eCPX 3.0 细菌展示肽库</td><td>Cytomx Therapeutics</td><td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td><td>细胞表面肽展示文库。由美国加州大学圣塔芭芭拉分校（USCB）合作者提供。</td></tr><tr><td>L-阿拉伯糖</td><td>Sigma</td><td>A3256-500G</td><td>糖类，用于诱导蛋白表达</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 pH 7.4（PBS）</td><td>Amresco</td><td>0780-10L</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素，无需称量</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21327</td><td>将生物素分子添加至伯胺基团</td></tr><tr><td>Pierce 生物素定量试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI28005</td><td>确保生物素分子共价结合至蛋白</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1 磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td>用于捕获生物素偶联蛋白的磁珠</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td>蛋白，用作阻断非特异性结合的封闭剂</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td>糖类，用于细菌生长并抑制可诱导蛋白表达</td></tr><tr><td>Ypet Mona</td><td>UCSB 和 ARL</td><td>N/A</td><td>eCPX 3.0 表达监测的阳性对照。由作者及合作者制备；参见参考文献 12 和 13。</td></tr><tr><td>Dylight 488 NHS 酯</td><td>Thermo Scientific</td><td>46403</td><td>用于将目标蛋白与荧光染料偶联</td></tr><tr><td>链霉亲和素-R-藻红蛋白偶联物（SAPE）</td><td>Thermo Scientific</td><td>S866</td><td>监测链霉亲和素非特异性结合的阴性对照</td></tr><tr><td>BD FACSFlow 缓冲液</td><td>Becton, Dickinson, and Company</td><td>342003</td><td>FACS 仪器运行用缓冲液</td></tr><tr><td>autoMACS 柱</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-021-101</td><td>用于 MACS 分离</td></tr><tr><td>autoMACS 运行缓冲液 &amp;ndash; MACS 分离缓冲液</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td>用于 autoMACS 仪器维护。危险：含 0.09% 叠氮化钠。</td></tr><tr><td>autoMACS Pro 洗涤液</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-987</td><td>用于 autoMACS 仪器维护</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>VWR</td><td>E505-4L</td><td>autoMACS 的去污剂</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G6279-1L</td><td>用于细菌冻存菌种</td></tr><tr><td>Chill 15 架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-952</td><td>用于 MACS 分离</td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>Becton, Dickinson, and Company</td><td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td><td>用于评估肽与靶标的结合情况</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 软件</td><td>Becton, Dickinson, and Company</td><td>659523</td><td>用于评估肽与靶标的结合情况</td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S 磁性粒子浓缩器</td><td>Thermo Scientific</td><td>A13346</td><td>用于磁珠的台式细胞分离器</td></tr><tr><td>菌落测序</td><td>Genewiz</td><td>N/A; https://www.genewiz.com/</td><td>DNA 及菌落测序服务</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td><td>用于序列分析宏</td></tr><tr><td>炭疽保护性抗原（PA）</td><td>List Biological Laboratories, Inc.</td><td>171</td><td>作为代表性结果示例所用的目标蛋白。</td></tr><tr><td>Abrax</td><td>ECBC 和 ARL</td><td>N/A</td><td>作为代表性结果示例所用的目标蛋白。由作者及合作者制备；参见参考文献 1 和 15。</td></tr><tr><td>Rivax</td><td>ECBC 和 ARL</td><td>N/A</td><td>作为代表性结果示例所用的目标蛋白。由作者及合作者制备；参见参考文献 1 和 15。</td></tr></tbody></table>

用于肽亲和试剂发现及分离株分析的细菌展示文库半自动生物筛选

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

利用细菌展示文库进行生物淘选是发现可识别生物与非生物靶标的多肽亲和试剂的有效技术。多肽亲和试剂可用于类似于抗体的应用，包括检测与治疗，但其稳定性更高，能够在更极端的环境中发挥作用。采用半自动化分选方法可增强针对目标蛋白的多肽捕获试剂的特异性富集，该方法优化了结合与洗涤步骤，从而降低假阳性结合物的出现频率。本文描述了一种适用于商用自动化磁激活细胞分选装置的半自动化分选方法，结合表达随机15肽的非限制性细菌展示分选文库使用。经过轻微修改后，这些方法可推广至其他自动化设备、其他分选文库以及其他生物体。本研究的主要目标是提供一套全面的方法学，并阐明在分析和最小化候选分子库过程中所采用的思维逻辑。这些技术包括使用荧光激活细胞分选（FACS）分析细胞表面结合情况，以评估分选过程中的亲和力与特异性，并用于比较单个候选分子；以及对多肽序列进行分析，以识别趋势和共有序列，从而理解并可能改进对目标分子的亲和力与特异性。

生物淘选细菌展示文库是发现肽类亲和试剂的一种成熟技术，可作为抗体的可靠替代方法。本文所述的半自动化分选方法简化了生物淘选流程，降低了假阳性结果的出现频率。本文将阐述在候选分子评估及减少下游分析工作量方面所采用的思路与技术。

生物展示文库的生物淘选是发现可识别生物与非生物靶标的肽亲和试剂的一种成熟技术。

本生物淘选实验的总体目标是快速分离出针对特定目标蛋白的肽类捕获试剂，并有效剔除非特异性候选分子，避免其进入后续分析。该方法可用于发现适用于多种应用的稳定肽类亲和试剂，从生物威胁的检测到疾病诊断均可适用。该技术的主要优势在于，可在约一周时间内快速获得肽类亲和试剂，且无需大量专业培训。尽管该方法可用于发现用于细胞外的肽亲和试剂，但这些肽也可用作活体材料。通常，初次使用该方法的研究人员面临的最大挑战是候选序列的下游分析，这与本文所示的实验方案密切相关。生物淘选细菌展示文库是一个循环过程，首先针对磁珠本身进行阴性分选，以去除对磁珠材料或任何附着的捕获蛋白具有非特异性结合的分子。应保留不与磁珠结合的阴性组分。可针对任何潜在的交叉反应性蛋白质靶标进行额外的阴性分选，再次保留不与磁珠结合的阴性组分。后续的阳性分选步骤与针对蛋白质靶标的阴性分选非常相似，但此次保留与磁珠结合的阳性组分。用于细菌展示文库的阳性分选时，首先将约1 × 10¹¹个经过阴性分选去除不需要肽段的多样化细菌展示分选文库细胞接种至500毫升添加氯霉素的Luria Broth Miller培养基（LBCM-25）中。在37 °C、225 rpm条件下培养文库，直至菌液OD600达到0.5至0.55。随后在37 °C、振荡条件下加入0.04% L-阿拉伯糖诱导肽段表达，持续45分钟。诱导期结束后，将培养物置于冰上。通过离心收集2 × 10¹¹个细菌细胞。用1.5毫升PBS轻轻涡旋重悬菌体沉淀。根据需要将细菌分装到多个微量离心管中，进行第二次离心。将菌体沉淀重悬于1 mL PBS中，加入感兴趣的生物素化靶标，在4°C条件下于旋转平台上孵育45分钟。在此期间，通过离心法用1 mL PBS缓冲液（添加牛血清白蛋白，即BSA）洗涤100 µL链霉亲和素编码微珠。将洗涤后的磁珠置于台式磁性粒子分离器中，小心移除上清液，注意不要扰动沉淀。旋转孵育结束后，离心细胞以收集未结合的目标物质至上清液中，并将结合有目标蛋白的菌体沉淀用1毫升含BSA的PBS重悬。使用全部体积的菌液来重悬磁珠沉淀。在4°C条件下于旋转平台上孵育30分钟。然后将磁珠与细菌溶液置于冰上。打开Auto MACS仪器以初始化系统，并在分离菜单中选择“洗涤即刻”、“冲洗”和“运行”，分别用生产商提供的洗涤缓冲液和运行缓冲液对管路进行预处理。洗涤结束后，使用含BSA的PBS缓冲液再次对管路进行一次引流通。当仪器准备就绪后，将细菌与微珠混合物转移至一个15毫升的圆锥形离心管中，并用额外的500 µL新鲜含BSA的PBS冲洗该管。将含有细菌和微珠混合物的洗涤液收集后，将离心管放入4 °C的圆锥形离心管架的样品槽中。将空的15毫升收集管放入支架的阳性与阴性分选插槽中，并将支架转移至仪器平台。为支架上的每个样本指定分离程序，在每份样本之间以及最后一个样本之后添加冲洗步骤。选择“运行”以开始细胞分离，并点击“确定”或“继续”以确认有足够的缓冲液可用。程序完成后，取出支架，将含有细菌和磁珠的阳性组分置于冰上。按照上述方法使用厂家提供的运行缓冲液和洗涤缓冲液对管路进行预冲洗后，选择电源关闭和“是”以关闭仪器，并确认储存溶液瓶中装有70%乙醇用于去污染。系统关闭完成后，瓶体将显示为紫色。可以关闭机器。然后用全部阳性分选组分接种一升添加了D-葡萄糖的LBCM25培养基，在37摄氏度下振荡过夜培养。为了分析每轮分选后亲和试剂分离的效果，在分选后肽段诱导结束时，将5微升诱导后的细胞加入到25微升如表格所示的溶液中。在冰上孵育45分钟后，通过离心收集各溶液中的细菌，并吸除每个样品的上清液。将样品管保持在冰上，选择FAX仪器软件中的administrator，打开相应的分析文件夹，然后单击新建实验。然后右键单击以重命名实验，并点击全局工作表。在全局工作表电子表格中点击点图图标，创建新的散点图。接着选择点图本身，然后选择检查器图标。在打开的窗口中，点击 X 轴和 Y 轴旁边的复选框，将坐标轴调整为双指数显示，然后关闭检查器窗口。点击实验，创建一个新的样本，根据实验需要右键单击以重命名该样本。然后点击加号展开样本，并重命名该样品。为运行阴性对照样本，将仅含 PBS 的沉淀物重悬于 500 微升预冷的 FAX 运行缓冲液中，通过移液充分混匀。将样本转移至 FAX 管中，轻轻振荡以保持细胞悬浮状态，并将样本加载到仪器的样本进样管（SIT）中。双击当前样本管，然后点击“采集数据”。然后在先前准备好的侧向散射面积与前向散射面积点图中显示事件，根据需要在“阈值”选项卡下调整光电倍增管电压阈值，使阴性对照细胞位于中心附近。当样本正常读取时，调节流速以显示每秒200–2,000个事件，并点击“记录数据”以采集至少10,000个事件。当所有事件采集完成后，将样本管从SIT中取出。选择多边形门控图标，并在散点图中围绕大部分细胞群绘制门控。右键单击点图以选择显示群体层级，然后在群体层级中单击 P1，并创建一个新的点图以显示 P1 群体。右键单击每个坐标轴，将 Y 轴更改为 FITC 面积，X 轴更改为前向散射面积，并将坐标轴调整为双指数显示模式。使用多边形门尽可能紧密地围绕阴性对照细胞群体的上方和左侧设门，并在群体层级中选择 P2，右键单击选择反向设门。落在门之外的细胞比例应低于 1%。在散点图上右键单击带有 P2 门的区域，选择“显示群体”，并选中 P2 及非 P2 群体进行显示。然后右键单击带有 P2 门的点图以创建统计视图，再右键单击统计视图窗口以编辑统计视图。在“群体”选项卡下，根据需要添加或删除群体，包括 P1 父代群体。P2 和非 P2 群体应已显示。然后在统计选项卡下，添加 FITC 面积中值及其他感兴趣的统计参数，点击确定以关闭窗口。右键单击 P2 散点图，选择复制，以创建 PE 面积对 FSC 面积的相似点图。调整 Y 轴，并使用 PBS 单独样本圈定 P3 群体。然后翻转门控。显示相应的细胞群。当所有适当的门控设置完成后，使用电子表格运行所有样本，每管记录约 10,000 个事件。在本代表性实验中，Ypet Mona 与固定的阳性对照肽结合可用于监测群体中诱导型肽库的表达水平。在第三轮和第四轮筛选中可观察到，缺乏表面展示肽的细胞通常会在分选过程中被剔除。针对特定目标分子结合肽的富集通常在三轮阳性分选后即可实现。继续进行第四轮筛选可能具有优势，因为在第三轮中已存在的高亲和力肽序列在第四轮中有望得到进一步富集，有助于缩小潜在候选分子的范围。通过比较待选分子与目标靶点的结合能力及其与潜在交叉反应靶点（如用于阴性筛选的靶点）的结合情况，可评估其特异性。对第四轮筛选获得的序列进行分析，通常会发现重复出现的序列，这些序列是开展亲和力与特异性分析的理想起点。重复序列的序列比对分析可用于揭示共识序列的存在，从而有助于缩小候选范围。随后可对每种重复序列的代表性克隆进行细胞表面亲和力和特异性分析，以评估肽段与靶标蛋白及交叉反应蛋白的结合能力。若操作熟练，一个包含初始亲和力与特异性分析的完整生物实验，可在正确执行的情况下于两周内完成。在执行完整流程时，需要注意的是，可能需要多次交替进行结合能力评估和序列分析，以充分理解结合亲和力所涉及的动态过程。我们提供了一个补充的宏文件，该文件可自动化大部分肽段分析工作，并进一步简化候选分子的筛选流程。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从细菌展示文库中快速分离出肽段捕获试剂，以及如何排除非特异性候选分子，避免其进入后续分析流程。按照本方案操作后，可采用其他方法（如ALIZA）来验证离细胞结合亲和力与特异性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

细菌显示文库的半自动化筛选肽亲和试剂的发现与分离结果分析

本视频展示了一种利用基于石英晶体微天平（QCM）生物传感器的T7噬菌体展示肽库生物筛选方法来研究蛋白质-药物相互作用的技术。通过在QCM生物传感器上对展示特异性肽段的噬菌体进行生物筛选，可特异性分离出高亲和力肽段，随后进行氨基酸测序，从而帮助确定靶标蛋白上的特异性相互作用位点。...

基于石英晶体微天平生物传感器的生物筛选技术研究蛋白质-药物相互作用

本视频展示了一种应用多肽微阵列技术来分析识别组蛋白多肽上翻译后修饰（PTM）的抗体特异性的方法。将含有已知PTM组合的固定化荧光染料标记组蛋白多肽的微阵列芯片与靶向PTM特异性抗体孵育。该过程有助于确定抗体对靶标PTM的特异性及其与非靶标PTM之间潜在的交叉反应性。...

一种用于抗体特异性分析的多肽微阵列技术

噬菌体展示是一种强大的技术，可用于捕获与固定化目标分子相互作用的蛋白质或蛋白质片段。在确定了要构建和筛选的噬菌体cDNA文库类型后，本文所述方案可实现高效的亲和筛选，从而鉴定出相互作用分子。...

使用重组蛋白诱饵进行噬菌体展示与亲和筛选的实验方案

本文描述了一种可视化的方法，用于从噬菌体展示的组合合成抗体文库中，同时针对数百种抗原进行可扩展的高通量筛选。通过这种并行方法，我们分离出的抗体片段对多种抗原具有高亲和力和特异性，并可在标准免疫测定中发挥功能。...

可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

我们提供一种方法，利用大肠杆菌（Escherichia...

用于筛选抗体片段文库的细菌内膜展示技术

本文介绍了一种用于高通量筛选细胞外蛋白微阵列以鉴定新型受体-配体相互作用的实验方案。同时，我们还描述了一种通过使用蛋白-微珠复合物来增强瞬时蛋白质-蛋白质相互作用检测的方法。...

用于高通量检测低亲和力受体-配体相互作用的细胞外蛋白微阵列技术

本文介绍一种筛选大肠杆菌（E.

细菌肽展示技术用于筛选新型生物素化酶

构建具有理想亲和力和特异性的、可被任意给定小分子配体化学诱导的蛋白质二聚化系统，在生物学检测与调控方面具有广泛的应用前景。本文中，我们描述了一种高效且可推广的从头设计化学诱导二聚化系统的方法，该方法通过逐步筛选噬菌体展示的组合型单域抗体文库来实现。...

通过逐步噬菌体筛选组合式单域抗体文库创建高特异性化学诱导蛋白二聚化系统

本研究旨在提出一种用于鉴定药物-肽相互作用的策略。该策略基于石英晶体微天平（QCM）生物传感器进行识别药物的短肽的生物筛选，随后通过生物信息学分析，对获得的药物识别信息及蛋白质上药物结合位点的注释进行定量评估。...

基于生物传感器的高通量生物筛选与生物信息学分析策略用于药物-蛋白质相互作用的全局验证

HCN通道与其辅助亚基之间的相互作用已被确定为重度抑郁症的治疗靶点。本文介绍了一种基于荧光偏振的方法，用于筛选该蛋白质-蛋白质相互作用的小分子抑制剂。...

识别HCN1与TRIP8b蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂的方法

学习利用细菌展示文库的半自动化生物淘选方法，快速分离特异性肽类亲和试剂并有效去除非特异性结合物。该技术可在约一周内完成肽类试剂的分离，适用于生物检测与疾病诊断等多种应用场景。

用于肽亲和试剂发现及分离株分析的细菌展示文库半自动生物筛选

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