基于蛋白质遗传的高通量筛选 S. cerevisiae

高通量酵母表型分析的总体目标是筛选那些在短暂过表达后仍能引发持久表型记忆的蛋白质，以此作为基于蛋白质遗传的替代指标。该方法有助于回答酵母朊病毒领域中的关键科学问题，例如：有多少蛋白质能够引发此类遗传效应。该技术的主要优势在于，能够以无偏倚的方式同时筛选大量蛋白质及信号通路。

按照文本方案所述，在96孔板中于30摄氏度培养适当的酵母细胞以开始本实验。通过肉眼观察培养物，确认其已达到饱和状态，即每个孔底部均可见细胞沉淀。使用液体处理机器人制备384孔板，每孔加入45 µL适当的培养基。

首先，将 Scal-URA 加入 384 孔板的各孔中。然后，将 Scal-URA 与目标应激物加入第二块板的各孔中，本实验中使用 20 毫摩尔的氯化锰作为应激物。第三步，将不会诱导质粒表达的 SD-URA 与氯化锰加入另一块板中。

将含有培养物的96孔板放置到液体处理机器人上，从96孔板的每个孔中取1微升样品，接种至384孔板的四个独立孔中，每个384孔板内含有不同的培养基，形成1×4的阵列。接种后立即将含有细胞的培养板置于室温及大气二氧化碳条件下的微孔板堆叠器中。设置程序为72小时连续循环，使用微孔板读板仪在600纳米波长下测定光密度。

完成生长测量后，将经历蛋白质过表达的 SCal-URA 诱导培养物每孔 1 微升转移至新的 384 孔板中，每孔含有 45 微升 ST-URA 培养基，该培养基不允许质粒的蛋白质表达。同时，将另一组 384 孔板每孔加入 45 微升 ST-URA 培养基，接种来自在胁迫条件下于 ST-URA 培养基中生长的培养物。将这些板置于湿润培养箱中，在 30 摄氏度下培养 48 小时至饱和状态。

48 小时后，使用这些平板向每孔含有 45 微升 ST-URA 的 384 孔板中重新接种，每孔接种 1 微升。然后，从同一来源平板中分别向另一块每孔含有 45 微升添加了胁迫剂的 ST-URA 的 384 孔板中，每孔重新接种 1 微升。立即将平板置于室温及大气二氧化碳条件下，使用微孔板堆叠器，并设定程序进行 48 小时连续循环，利用微孔板读板仪在 600 纳米波长处测定光密度。

当完成生长测量后，使用酶标仪软件将时间与600纳米波长下的光密度值导出为XY表格。将每个生物学重复的光密度测量值的列分组，并计算其平均值。绘制时间与600纳米光密度值的XY图，以生成生长曲线。

对于因祖先蛋白过表达而在特定胁迫条件下表现出显著生长差异的菌株，从每个生物学重复中取1 µL，加入10 mL水中稀释，然后将50 µL稀释液涂布于含有5-FOA的平板上。在30°C条件下培养三天。若每个平板上的菌落数过多或过少，应相应调整稀释倍数。

每块平板上 100 到 200 个菌落最为理想。使用经高压灭菌的牙签挑取 8 到 32 个单菌落，并接种至含有 96 孔板中，每孔含 150 µL SDCSM 培养基。将 96 孔板置于湿润培养箱中，在 30 °C 下培养 48 至 72 小时，直至菌液达到饱和生长状态。

利用这些培养物接种两组新的96孔板，每孔含150 µL SDCSM，一组含有胁迫剂，另一组不含。将培养板置于微孔板堆叠器上，并设置程序以连续48小时循环测定600 nm处的光密度。48小时后，按先前所示方法分析数据，并确认在质粒丢失后，先前观察到的显著生长差异仍然存在。

随后，针对维持诱导表型的细胞，按照文本方案中所述方法检测其是否具有基于蛋白质遗传的经典特征。该基于蛋白质的遗传筛选发现，PSP1 开放阅读框的瞬时过表达可导致细胞对氯化锰产生抗性，且这种抗性在过表达停止后仍可在细胞中维持数百代。朊病毒预测算法将 PSP1 的末端区域评为具有中等程度的朊病毒样特征。

相比之下，算法预测在筛选中获得的大多数诱导蛋白几乎不具有显著的朊病毒样序列特征，如本代表性分析所示。对菌株和SDCSM在氯化锰条件下的生长情况进行测量，并相对于相应的未经处理的PSP1阴性对照进行归一化，结果表明，抑制HSP104去聚集酶并不影响PSP1依赖的氯化锰抗性，而去除HSP70分子伴侣或PSP1基因则会可遗传地消除该表型。在携带PSP1依赖表型状态的菌株与未经处理菌株杂交后产生的单个四分孢子中，所有孢子均表现出氯化锰抗性，表明该表型以非孟德尔方式遗传。

以模拟裂解液与含有PSP1的裂解液作为可传播材料，在蛋白质转化感染性方面的比较显示，超过53%的未处理细胞在接受PSP1接种后获得了相应的氯化锰抗性表型。一旦掌握该技术，包括孵育步骤在内，整个实验可在数周内完成，且大多数筛选步骤的准备工作每天耗时不到两小时，即使处理大量培养板也是如此。在进行该实验操作时，重要的是要提前明确计划好需要检测的内容，并始终考虑实验的规模。

这对于该技术的初学者而言尤为重要。在完成此操作步骤后，可进一步采用文本方案中所述的其他方法，以确定筛选中观察到的表型是否表现出真正且符合朊病毒样遗传模式的特征。该技术建立后，为表观遗传学领域的研究人员探索酿酒酵母中朊病毒生物学的广泛内涵铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何以无偏倚和靶向两种方式，在酵母中设计高通量筛选实验，以发现新型的蛋白质依赖性遗传形式。

请注意，某些化学应激剂（如DNA损伤剂）可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护装备。