Name: 基于蛋白质的继承在酿酒酵母中的高通量筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 了解在酿酒酵母中进行高通量蛋白质基遗传筛选的方法。该技术利用96孔和384孔板培养系统，可无偏倚地筛选诱导持久表型记忆的蛋白质，为研究朊病毒生物学和表观遗传机制提供重要工具。

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感谢Sohini Chakrabortee、Sandra Jones、David Garcia、Bhupinder Bhullar、Amelia Chang、Richard She和Susan Lindquist在本论文所用检测方法的开发过程中提供的帮助，同时感谢审稿人提出的宝贵意见。

1. 初始过表达
<ol>
	<li>转化酵母细胞（此处为 BY4741） MAT a 单倍体）先前在 YPD 液体培养基（每升含 10 g 酵母提取物、20 g 蛋白胨和 20 g 葡萄糖）中培养，并携带来自 FLEXGene ORFeome 文库的所需候选构建体（酵母 ORF 在半乳糖诱导型启动子控制下，位于 URA3标记的着丝粒质粒骨架，pBY01129).</li>
	<li>使用灭菌牙签从这些转化产物中挑取四个独立的菌落，作为生物学重复。将它们在96孔板中，于150 µL SRaffinose-URA培养基（每1 L含0.74 g CSM-URA、6.7 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基和20 g棉子糖）中培养48–72小时。所有板的A1孔接种第一个ORF的菌落，所有板的A2孔接种第二个ORF的菌落， 等等。 
	注意：所有培养步骤均在30 °C及大气CO₂水平下进行2 （除非另有说明，否则为407.05 ppm）。</li>
	<li>确认培养物已达到饱和状态（肉眼可见每个孔底部有细胞），使用液体处理机器人将每个96孔板孔中的1 µL培养物以1:4的比例接种到384孔板的4个独立孔中，每孔预先加入45 µL SGal-URA培养基（每升含0.74 g CSM-URA、6.7 g 无氨基酸酵母氮源基础培养基和20 g 半乳糖）。 
	注意：这将创建一个复合平板，其中每个ORF的4个生物学重复以方形模式排列。</li>
	<li>同时，准备单独的384孔板，每孔加入45 µL含目标应激因子的SGal-URA培养基（例如， 每孔加入20 mM氯化锰溶液。以与步骤1.3相同的方式接种该培养板。 
	注意：为了最大限度地扩大表型检测的动态范围，建议在特定胁迫剂的LD50浓度附近进行2倍系列稀释。可预先进行此操作，以确定观察生长增强与生长抑制的最佳浓度。</li>
	<li>作为最后的平行对照，以相同方式接种第三块384孔板，并在培养基中加入相同的应激物，但该培养基不会诱导质粒表达。确保每孔含有45 µL SD-URA（每1 L含CSM-URA 0.74 g、不含氨基酸的酵母氮源基础培养基6.7 g和葡萄糖20 g），接种操作同步骤1.3和1.4。</li>
	<li>立即将含细胞的培养板放入微孔板堆叠器中，并设置程序进行持续72小时的循环，测定OD值600 使用配备堆栈器的酶标仪在室温及大气CO条件下2 (407.05 ppm) 
	注意：生长测量的频率取决于实验中使用的培养板数量（最终由研究者希望检测的基因数量和条件数量决定）。使用的培养板越多，酶标仪完成一次循环所需时间越长，因此两次测量之间的间隔时间也越长（每块培养板的测量时间约为45秒，具体取决于所使用的仪器设备）。</li>
	<li>生长测量后，使用同一台液体处理机器人，将SGal-URA诱导培养物每孔1 µL转移至即， 将经历蛋白质过表达的样品转移至新的384孔板中，每孔含45 µL SD-URA培养基（该培养基不支持质粒的蛋白质表达）。
	<ol>
		<li>同时，对另一组384孔板进行类似的接种，每孔含有45 µL SD-URA，接种来源为在含有胁迫剂的SD-URA培养基中培养的菌液即， 步骤1.5中的那些</li>
		<li>在30 °C的湿润培养箱中培养平板48小时至饱和状态（即， 带湿纸巾的可密封塑料盒）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从上一步的培养板中取出样品，将每孔1 µL接种至含有45 µL SD-URA的384孔板中，每孔接种1 µL。然后，从同一来源板中另取每孔1 µL，分别接种至另一含有45 µL添加应激因子的SD-URA的384孔板中，进行独立的二次接种。 
	注意：这将确定在蛋白质过表达停止后，对胁迫因子的敏感性/抗性表型是否仍然存在。</li>
	<li>立即将含细胞的培养板放入微孔板堆叠器中，并设置程序以连续循环测量48小时的OD值600 在室温及大气 CO 条件下使用微孔板读板机检测2 (407.05 ppm)</li>
	<li>导出时间与OD的关系数据600 使用酶标仪软件以XY表格形式进行测量。将OD值的列分组600 将每个生物学重复的数据合并，并计算均值。绘制时间与OD的XY图600 以生成生长曲线。
	<ol>
		<li>比较经历过去过表达的培养物的生长速率即， 那些最初在含半乳糖培养基中诱导后再接种于SD-URA培养基的培养物 versus 未经历该诱导的培养物即， 如先前所述，那些在葡萄糖中培养的菌株30.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于在特定胁迫条件下因祖先蛋白过表达而表现出显著生长差异的培养物，从每个生物学重复中取 1 µL，用 10 mL 水稀释，然后取 50 µL 涂布于含有 5-FOA 的平板上（每升含 CSM-URA 0.74 g、5-FOA 1 g、尿嘧啶 50 mg、无氨基酸酵母氮源基础培养基 6.7 g、葡萄糖 20 g 和琼脂 20 g）。在 30 °C 下培养 3 天。
	<ol>
		<li>如果每个平板上的菌落数过多或过少，应相应调整稀释倍数。 
		注意：5-FOA 会通过尿嘧啶生物合成途径转化为一种有毒中间产物，从而导致质粒的丢失 URA3-在第一步中转化的标记表达质粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用灭菌牙签挑取8-32个单菌落，接种至含有150 µL SD-CSM的96孔板中。在30 °C湿润环境中培养48-72小时至饱和。用这些培养物接种两组新的含有150 µL SD-CSM的96孔板，其中一组添加步骤1.11中的胁迫因子，另一组不添加。</li>
	<li>将培养板置于微孔板架上，并设置程序以测定OD值600 48小时连续循环。</li>
	<li>按照步骤1.10的方法分析数据，并确认在质粒丢失后，步骤1.10中观察到的显著生长差异仍然存在。 
	注意：这些细胞具有稳定的表型状态，可能表明存在基于蛋白质的遗传现象。</li>
	<li>检测维持诱导表型的细胞是否具有蛋白质依赖性遗传的经典特征（见下文）。</li>
</ol>
2. 朊病毒样遗传的检测方法
<ol>
	<li>分子伴侣介导的&#34;消除&#34;
	<ol>
		<li>检测Hsp104分子伴侣依赖性。
		<ol>
			<li>挑取一株携带稳定表型状态的酵母菌落，在YPD平板（每升含10 g酵母提取物、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖和20 g琼脂）上划线分离单菌落，该平板含有3 mM GdnHCl，于30 °C培养3天。同时，以相同方式将一株未经处理的菌株菌落划线至含3 mM GdnHCl的YPD平板作为对照。</li>
			<li>在新鲜的含3 mM GdnHCl的YPD平板上重复此传代操作2次。</li>
			<li>由于GdnHCl处理可能增加“petite”细胞出现的频率，因此需挑取经过3次GdnHCl传代的多个菌落，并通过检测其在YP-甘油平板（每升含10 g酵母提取物、20 g蛋白胨、20 mL甘油和20 g琼脂）上培养7天后能否形成可见菌落，来验证其线粒体呼吸功能是否正常。</li>
			<li>从YP-甘油平板上挑取多个菌落，通过在胁迫条件下生长的方式检测其稳定表型状态的维持情况，并与未经&#34;消除&#34;的菌株以及未经处理的对照菌株（即不携带该表型状态的同源菌株，如BY4741 MATa单倍体）进行比较，方法同步骤1.13所述。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>检测Hsp70分子伴侣依赖性。
		<ol>
			<li>&#34;消除&#34;通过质粒实现。
			<ol>
				<li>将未经处理的细胞和携带稳定表型状态的细胞共同转化带有URA3标记的质粒，该质粒在强组成型启动子（GPD）驱动下表达Hsp70的显性负性等位基因（K69M）25,31。</li>
				<li>分别挑取单个转化子，在SD-URA平板（每升含0.74 g CSM-URA、6.7 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基、20 g葡萄糖和20 g琼脂）上划线分离单菌落，并于30 °C、大气CO2条件下培养3天。</li>
				<li>在SD-URA平板上重复传代2次。</li>
				<li>挑取多个菌落，在5-FOA平板上划线分离单菌落以消除质粒。</li>
				<li>对每个分离株挑取多个单菌落，采用与步骤1.13类似的方法检测其是否保留（或丢失）稳定表型状态。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>&#34;消除&#34;通过遗传杂交实现。
			<ol>
				<li>将携带稳定表型状态的BY4741 MATa单倍体菌株与交配型相反的未经处理菌株（此处为BY4742 MATα）进行杂交，后者在四个酵母Hsp70旁系同源基因中的两个存在遗传缺失（ssa1Δ ssa2Δ）。 
				注：该菌株Hsp70分子伴侣功能缺陷。</li>
				<li>通过在SD-LYS-MET（每升含0.74 g CSM-LYS-MET、6.7 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基、20 g葡萄糖和20 g琼脂）双缺失培养基上划线分离单菌落，筛选二倍体的生长。</li>
				<li>挑取单个二倍体菌落，在8 mL预孢子形成培养基（0.8%酵母提取物、0.3%蛋白胨、10%右旋糖和100 mg/L硫酸腺嘌呤）中于30 °C培养24小时。</li>
				<li>在3,000 xg条件下离心3分钟，吸除预孢子形成（pre-SPO）培养基，并用无菌水洗涤沉淀一次。</li>
				<li>将沉淀重悬于2 mL孢子形成培养基（1%乙酸钾、0.1%酵母提取物、0.05%葡萄糖和0.01%氨基酸补充混合物（含2 g组氨酸、10 g亮氨酸、2 g赖氨酸和2 g尿嘧啶））中，于25°C培养5天。</li>
				<li>将培养物转移至30 °C，继续孵育48小时。</li>
				<li>使用光学显微镜观察四分体的存在情况，以评估孢子形成的效率32。</li>
				<li>取40 µL培养物，在1.5 mL离心管中于3,000 xg离心1分钟，弃上清，重悬于等体积的zymolyase酶混合液（1 M山梨醇、0.1 M EDTA和10 mg/mL zymolyase 100T）中。</li>
				<li>于25 °C孵育5分钟。</li>
				<li>取10 µL消化后的培养物，滴加至非常干燥且水平的YPD琼脂平板上，使培养物沿直线缓慢扩散。</li>
				<li>将平板置于超净台中至少干燥30分钟。</li>
				<li>使用解剖显微镜将孢子分离为四分体，并在平板上排列整齐。</li>
				<li>让各个单倍体孢子生长成菌落，并检测其在SD-HIS-LEU（每升含0.67 g CSM-HIS-LEU、6.7 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基、20 g葡萄糖和20 g琼脂）平板上的生长能力，以确认其携带两个遗传缺失（ssa1Δ ssa2Δ）。</li>
				<li>采用与步骤1.13类似的方法，检测每个孢子在Hsp70功能缺陷背景中是否维持表型状态。 
				注：将这些孢子回交至Hsp70功能恢复的野生型菌株，不应恢复朊病毒表型。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测非孟德尔遗传。
	<ol>
		<li>将携带稳定表型状态的BY4741 MATa单倍体菌株与同源未经处理的对照菌株，分别与交配型相反的同源未经处理菌株（此处为BY4742 MATα）进行杂交。</li>
		<li>通过在SD-LYS-MET双缺失培养基上划线分离单菌落，筛选二倍体的生长。</li>
		<li>挑取单个二倍体菌落，在8 mL预孢子形成培养基中于30 °C培养24小时。</li>
		<li>重复上述步骤2.2.2.3–2.2.2.12。</li>
		<li>让各个单倍体孢子生长成菌落，并采用生长实验检测其在减数分裂过程中是否维持表型状态，方法同步骤1.13。 
		注：朊病毒的另一特征是可通过去除原始致病蛋白而可遗传地消除。因此，将朊病毒菌株与原始诱导蛋白基因存在遗传缺失的菌株杂交，将导致继承该缺失的孢子中朊病毒表型消失。还需注意的是，若被删除的基因仅参与朊病毒表型的表现而不参与其传播本身，则朊病毒可能在该突变体中以&#34;隐匿&#34;状态维持。为区分这两种可能性，可将孢子回交至未经处理的野生型菌株，并检测在二倍体遗传背景（基因功能已恢复）中朊病毒表型是否重新出现。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胞质杂交（cytoduction）。
	<ol>
		<li>构建初始的BY4742受体菌株。
		<ol>
			<li>通过转化引入一个缺陷型KAR等位基因（kar1-15），以阻止交配过程中的核融合23。</li>
			<li>通过将单个菌落接种于含0.25%溴化乙锭的YPD液体培养基中，使该菌株成为&#34;petite&#34;（即线粒体呼吸功能缺陷）。</li>
			<li>于30 °C培养至对数晚期/静止期（OD600 ~1）。</li>
			<li>用含0.25%溴化乙锭的新鲜YPD培养基稀释1:1,000，重复两次。</li>
			<li>当培养物达到对数晚期/静止早期（OD600 0.8–1.2）时，用无菌水稀释1:10,000，取50 µL涂布于YPD平板。于30 °C培养3天后，挑取多个菌落，并通过检测其在YP-甘油平板上培养7天后能否形成可见菌落，逐一验证其呼吸功能缺陷。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将供体菌株初次进行胞质杂交至BY4742。
		<ol>
			<li>将携带稳定表型状态的供体BY4741菌株细胞与未经处理的BY4742 kar1-15受体菌株细胞混合，涂布于YPD琼脂平板表面。</li>
			<li>于30 °C、大气CO2（407.05 ppm）条件下培养24小时，然后转移至含甘油的甲硫氨酸缺失培养基（SGly-MET：每升含0.74 g CSM-MET、6.7 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基、20 mL甘油和20 g琼脂）。 
			注：该条件可同时选择BY4742的核标记，并通过胞质交换恢复功能性线粒体。</li>
			<li>3–5天后，挑取多个单菌落，并在SD-MET（每升含0.74 g CSM-MET、6.7 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基、20 g葡萄糖和20 g琼脂）培养基上进行第二轮筛选。</li>
			<li>同时，通过在SD-LYS-MET培养基上传代，确认这些菌落并非二倍体。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行反向胞质杂交。
		<ol>
			<li>将新的供体菌株（即成功的BY4742 kar1-15胞质杂交子）与上述方法制备的“petite”型未经处理的BY4741细胞在YPD琼脂上混合。</li>
			<li>重复前述胞质杂交步骤（2.3.2.1–2.3.2.4），但选择在缺乏赖氨酸的甘油培养基（SGly-LYS：每升含0.74 g CSM-LYS、6.7 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基、20 mL甘油和20 g琼脂）上筛选BY4741受体的核标记。</li>
			<li>挑取多个胞质杂交子，采用与步骤1.13相同的生长实验检测其是否维持稳定表型状态。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质转化。
	<ol>
		<li>制备裂解液。
		<ol>
			<li>在YPD培养基中培养50 mL携带稳定表型状态的细胞，于30 °C培养18小时。</li>
			<li>在3,000 x g条件下离心4分钟收集菌体，用灭菌H2O洗涤一次，再用1 M山梨醇洗涤一次，共洗涤两次。</li>
			<li>将细胞重悬于200 mL SCE缓冲液（1 M山梨醇、10 mM EDTA、10 mM DTT、100 mM柠檬酸钠，每50 mL加入1片不含EDTA的蛋白酶抑制剂小片，pH 5.8）中，加入50 U/mL酵母裂解酶100T。</li>
			<li>于35 °C孵育30分钟。</li>
			<li>使用超声破碎仪在冰上以20 kHz、20%强度超声处理10秒。</li>
			<li>在4 °C、10,000 x g条件下离心15分钟，去除细胞碎片。</li>
			<li>将上清转移至新管，加入过量3倍（按活性单位计）的RNase I和生物素标记的DNase，于37 °C孵育1小时。</li>
			<li>加入过量链霉亲和素-琼脂糖珠以去除DNase I，孵育5分钟后，在10,000 x g条件下离心1.5分钟收集沉淀。</li>
			<li>将上清转移至新离心管中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备受体原生质体。
		<ol>
			<li>在YPD培养基中培养5 mL未经处理的受体细胞至对数中期（OD600介于0.5–1）。</li>
			<li>离心（3,000 x g，4分钟）收集细胞，用H2O洗涤两次，再用1 M山梨醇洗涤两次，共洗涤四次。</li>
			<li>将细胞重悬于含200 U/mL酵母裂解酶的1 M山梨醇溶液中，于35 °C孵育15分钟以消化细胞壁。</li>
			<li>以600 x g轻柔离心5分钟收集所得原生质体，用1 mL 1 M山梨醇洗涤一次，再用1 mL STC缓冲液（1 M山梨醇、10 mM Tris pH 7.5、10 mM CaCl2）洗涤一次。</li>
			<li>将洗涤后的原生质体重悬于50 µL STC缓冲液中。 
			注：使用剪刀剪去移液枪头末端约0.7 cm，以形成更宽的开口，防止原生质体破裂。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用蛋白质转化未经处理的细胞。
		<ol>
			<li>将50 µL原生质体等分试样与50 µL供体裂解液、20 µL鲑鱼精DNA（2 mg/mL）以及5 µL带有URA3标记的筛选质粒（例如 pAG426-GFP）28,33混合进行转化。</li>
			<li>于25 °C孵育30分钟。</li>
			<li>以600 x g离心5分钟收集原生质体，重悬于150 µL SOS缓冲液（1 M山梨醇、7 mM CaCl2、0.25%酵母提取物、0.5%蛋白胨）中。</li>
			<li>于30 °C恢复30分钟。</li>
			<li>将全部培养物涂布于SD-URA平板上。</li>
			<li>迅速在平板上覆盖一层温热（约45 °C）的含0.8%琼脂的SD-URA培养基。 
			注：此举可防止原生质体破裂。</li>
			<li>将转化平板于30 °C培养2–3天。</li>
			<li>用牙签从覆盖层平板上挑取成功生长的细胞，在SD-URA平板上重新划线分离单菌落。</li>
			<li>对每组挑取数十个菌落，在5-FOA平板上划线以消除带有URA3标记的载体质粒。</li>
			<li>挑取能在5-FOA平板上生长的菌落，采用与之前相同的方法（步骤1.13）通过生长实验检测稳定表型状态是否成功转移。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+%5Bpsi%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li>
<li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li>
<li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BURE3%5D+as+an+altered+URE2+protein%3A+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li>
<li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rnq1%3A+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li>
<li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li>
<li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9182769">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
<li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li>
<li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+the+yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li>
<li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li>
<li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16793280">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li>
<li>Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+switch+in+carbon+source+utilization+driven+by+an+unusual+yeast+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion.</a> Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).</li>
<li>Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+het-s+heterokaryon+incompatibility+gene+of+the+fungus+Podospora+anserina+behaves+as+a+prion+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Chakrabortee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+Disordered+Proteins+Drive+Emergence+and+Inheritance+of+Biological+Traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits.</a> Cell. 167 (2), 369-381 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).</li>
<li>Swain, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+time+derivatives+including+cell+growth+rates+using+Gaussian+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes.</a> Nat Commun. 7, 13766(2016).</li>
<li>Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+prion-like+element+converts+wild+fungi+from+metabolic+specialists+to+generalists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists.</a> Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).</li>
<li>Formosa, T., Nittis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressors+of+the+temperature+sensitivity+of+DNA+polymerase+alpha+mutations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).</li>
<li>Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteome+turnover+analyses+of+the+Yeasts+S.+cerevisiae+and+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe.</a> Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).</li>
<li>Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLAAC%3A+a+web+and+command-line+application+to+identify+proteins+with+prion-like+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition.</a> Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Mendelian+determinant+%5BISP%2B%5D+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li>
<li>Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+variations+in+an+infectious+protein+determine+prion+strain+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences.</a> Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).</li>
<li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li>
<li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+activity%3A+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

最早的酵母朊病毒是通过其异常的表型和令人困惑的遗传模式被识别出来的。随后，研究人员利用这些朊病毒的特征开发了算法和计算工具，用于筛选其他潜在的朊病毒蛋白。然而，本文所述的方法是实验性的，依赖于瞬时过表达来诱导持久性改变——即由蛋白质构象编码的稳定状态。然而，如果效率 &#34;接种&#34; 对于任何特定蛋白质而言，若其通过过表达诱导朊病毒样组装的效率极低，则该蛋白质在此类过表达筛选中将持续表现为假阴性。为纠正这一问题，一种可行的改进方法是在后续实验中使用2微米质粒进行蛋白质过表达。最后，每种诱导生成的朊病毒具有其独特的一组生长表型，且不会在所有检测条件下均显现。因此，所测试的不同条件和剂量的数量限制了阳性结果的检出数量。
需要强调的是，并非所有类型的基于蛋白质的遗传都能通过该方法被均等地检测到。那些无法高效过表达或在过表达时产生毒性的蛋白质显然会持续被遗漏。有丝分裂不稳定的遗传元件，例如&#34;mnemons&#34;，在初始过表达之后将无法传递至子代细胞22。相比之下，理论上其他类型的长寿命双稳态开关可通过短暂过表达被诱导产生<...

生物系统中蛋白质丰度常出现短暂波动。这些波动是否会对生物体表型或后代产生持久影响，目前尚不明确。此类生物学现象最著名的实例涉及一类罕见的蛋白质——朊病毒（prions），它们可在不改变基因组的情况下驱动可遗传性状的出现。这些蛋白质性质的感染性颗粒通过自我延续的蛋白质构象改变来传递表型1,2。这类遗传方式最初被发现是某种严重神经退行性疾病异常遗传模式的成因。然而，后续在从真菌到哺乳动物等多种生物中的研究3,4,5,6,7,8,9,10表明，类朊病毒元件也可能赋予适应性优势。尽管如此，朊病毒仍被视为一种引人入胜但极为罕见的生物学特例。
这种普遍接受的观点部分源于基于蛋白质的遗传现象长期以来仅局限于少数几个实例。最近的系统性筛选工作显著拓宽了这一认知，鉴定出多个新的bona fide朊病毒11以及近二十个具有引发类朊病毒构象转换能力的蛋白质结构域12。然而，由于这些研究方法通常聚焦于强烈的氨基酸序列偏好性，所发现的朊病毒在生化特性上与最初在酵母中发现的朊病毒[PSI+]13,14、[URE3]15和[RNQ+]11,16相似，包括：1）富含天冬酰胺（N）和谷氨酰胺（Q）长串联重复序列的模块化结构域；2）组装成淀粉样[PRION+]构象17,18,19；以及3）完全依赖解聚酶Hsp104的功能以实现从母细胞到子细胞的准确传递13,20,21。事实上，许多真正的bona fide朊病毒，包括[GAR+]、[Het-s]甚至最初的朊病毒（PrPSc），在如此严格的标准下仍会被遗漏。也许更重要的是，这些方法无法捕捉到基于蛋白质遗传的任何新机制22。因此，此类现象在自然界中的真实生物学广泛性可能远比此前假设的更为普遍。
为了探究这一问题，采用了一种高通量、全蛋白质组范围的策略。所有朊病毒（包括 PrPSc、[GAR+] 和 [Het-s]）的一个共同特征是：致病蛋白的瞬时过表达会显著提高朊病毒获得的速率15,23,24,25,26。我们利用这一特性，系统性地在整个酵母ORFeome范围内探究：是否可以通过瞬时诱导单个蛋白的过表达，来启动稳定的、基于蛋白质的表观遗传状态。众所周知，蛋白过表达可改变表型27。然而，朊病毒蛋白的特殊之处在于，其短暂的过量产生会导致表型发生改变，且这种改变可在初始过表达结束后持续遗传数百代。我们此前已利用这一特性以及基于蛋白质的遗传元件所特有的遗传模式，鉴定了数十种能够在不改变基因组的情况下可遗传地重塑表型景观的蛋白28。尽管其中部分被鉴定的蛋白此前已被确认为朊病毒，但大多数并非已知朊病毒，这凸显了该方法在发现新型蛋白质介导的遗传形式方面的强大能力。

<table><tbody><tr><td>盐酸胍</td><td>Sigma</td><td>Cat#G3272-25G</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>氯化锰</td><td>Sigma</td><td>Cat#M8054-100G</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>5-氟乳清酸</td><td>Sigma</td><td>Cat#F5013-50MG</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>BY4741 &lt;em&gt;MATa (his3&amp;Delta;1 leu2&amp;Delta;0 LYS2 met15&amp;Delta;0 ura3&amp;Delta;0)&lt;/em&gt;</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>酵母菌株</td></tr><tr><td>BY4741 &lt;em&gt;MAT&amp;alpha; (his3&amp;Delta;1 leu2&amp;Delta;0 lys2&amp;Delta;0 MET15 ura3&amp;Delta;0)&lt;/em&gt;</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>酵母菌株</td></tr><tr><td>Hsp70 (K69M)&amp;nbsp;</td><td>Jarosz et al., 2014b</td><td>N/A</td><td>质粒</td></tr><tr><td>FLEXGene 文库</td><td>Hu et al., 2007</td><td>N/A</td><td>质粒文库</td></tr><tr><td>葡萄糖（右旋糖）</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>棉子糖</td><td>Sigma</td><td>R0250-25G</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>半乳糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>CSM</td><td>Sunrise Science</td><td>1001-100</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>CSM-URA</td><td>Sunrise Science</td><td>1004-100</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>CSM-LYS</td><td>Sunrise Science</td><td>1032-100</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>CSM-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1019-100</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>CSM-LYS-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1035-100</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Research Products International</td><td>P20240-5000</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>细菌蛋白胨</td><td>BD</td><td>211677</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>甘油</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>不含氨基酸的酵母氮源基础培养基</td><td>BD</td><td>291920</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49172</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>硫酸腺嘌呤</td><td>Sigma</td><td>A3159-25G</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>Sigma</td><td>P1190-500G</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>尿嘧啶</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>组氨酸</td><td>Sigma</td><td>H8000-100G</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>亮氨酸</td><td>Sigma</td><td>L8000-25G</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>L5501-25G</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>RNase I&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0601</td><td>酶</td></tr><tr><td>生物素标记的DNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1906</td><td>酶</td></tr><tr><td>zymolyase 100T（酵母裂解酶）</td><td>Sunrise Science</td><td>N0766555</td><td>酶</td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td>设备</td></tr><tr><td>微孔板堆叠器</td><td>BioTek</td><td>BioStack3</td><td>设备</td></tr><tr><td>板式填充仪</td><td>BiotTek</td><td>EL406</td><td>设备</td></tr><tr><td>液体处理机器人</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>设备</td></tr></tbody></table>

基于蛋白质遗传的高通量筛选 s. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

通常通过改变DNA序列来实现可遗传给后代的生物学信息编码。以蛋白质构象（而非序列）为基础的长期遗传长期以来被视为具有范式转变意义，但极为罕见。这类表观遗传元件中研究最为透彻的实例是朊病毒（prions），其具有自我组装的特性，能够导致新的可遗传表型的出现。许多典型的朊病毒表现出显著的天冬酰胺/谷氨酰胺富集（N/Q-rich）序列偏好，并形成淀粉样折叠结构。这些特殊特征主导了大多数用于发现新朊病毒蛋白的筛选工作。然而，目前已知至少有三种朊病毒（包括首个被发现的朊病毒PrPSc）并不具备这些生化特征。因此，我们开发了一种替代方法，基于质量作用定律的原理来探索蛋白质介导遗传的范围：短暂过表达朊病毒蛋白可增加其获得自我模板化构象的频率。本文描述了一种分析酵母ORFeome中各蛋白诱导蛋白质介导遗传能力的方法。利用该策略，我们先前发现，&gt;1%的酵母蛋白能够驱动生物学性状的产生，这些性状具有长期性、稳定性，且出现频率高于基因突变。该方法可高通量应用于整个ORFeome，也可作为针对特定遗传网络或环境刺激的靶向筛选范式。正如正向遗传筛选揭示了大量发育与信号通路一样，这些技术为研究蛋白质介导遗传在生物学过程中的作用提供了方法学基础。

已知蛋白质的过表达会显著改变细胞表型27。事实上，通过初步筛选方法，仅使用十种应激因子，即可在酵母ORFeome克隆过表达的情况下，稳定地鉴定出数百种新表型。然而，上述实验方法可用于评估细胞在蛋白质过表达结束后是否仍保留任何长期稳定的表型。其中一种能够介导此类状态的蛋白质是Psp1。Psp1是一种功能未知的蛋白质，能够抑制复制机制中的突变体（例如，pol alpha中的突变）34。PSP1开放阅读框（ORF）的过表达可在多种应激条件下调节细胞表型。值得注意的是，其中一种表型（对氯化锰的抗性）在过表达停止后仍可在细胞中持续数百代（即，其祖先曾经历Psp1诱导，但后代本身从未直接表达Psp1）（图1A）。Psp1的半衰期约为5小时35，因此在此时间尺度上，该抗性表型极不可能是由于母细胞将长...

本方案描述了一种高通量方法，用于在S. cerevisiae中对基于蛋白质的遗传进行功能性筛选。

基于蛋白质遗传的高通量筛选 S. cerevisiae

生物信息的编码通常通过DNA序列的改变实现，这些改变可传递给后代。长寿的……

该高通量酵母表型分析的总体目标是筛选那些能够引发持久表型记忆的蛋白质，以此作为基于蛋白质遗传的替代指标。该方法有助于回答酵母朊病毒研究领域中的关键问题，例如，有多少蛋白质能够引发此类遗传。该技术的主要优势在于，能够以无偏倚的方式同时筛选大量蛋白质及信号通路。按照文本方案所述，在96孔板中于30摄氏度下培养适当的酵母细胞，开始此操作。通过肉眼观察培养物，确认其已达到饱和状态，即可见细胞沉淀于各孔底部。使用液体处理机器人制备384孔板，每孔加入45 µL相应的培养基。首先，将 Scal-URA 加入 384 孔板的各孔中。然后，将 Scal-URA 与目标应激物加入第二块板的各孔中，本实验中使用 20 毫摩尔的氯化锰作为应激物。第三步，将不会诱导质粒表达的 SD-URA 与氯化锰加入另一块板中。将含有培养物的96孔板放置于液体处理机器人上，从96孔板的每个孔中分别吸取1微升样品，接种至4个不同的384孔板中的一至四阵列孔内，每个384孔板预先加入不同的培养基。接种后立即将含细胞的培养板置于室温及大气二氧化碳条件下的微孔板堆叠器中。设定程序为72小时连续循环，使用微孔板读板仪每间隔一定时间测量600纳米处的光密度值。完成生长测量后，将经历蛋白质过表达的 SCal-URA 诱导培养物每孔 1 微升转移至新的 384 孔板中，每孔含有 45 微升 ST-URA 培养基，该培养基不允许质粒的蛋白质表达。同时，将处于胁迫条件下在 ST-URA 培养基中生长的培养物，以同样方式接种至另一套每孔含有 45 微升 ST-URA 培养基的 384 孔板中。将这些板置于湿润培养箱中，在 30 摄氏度下培养 48 小时至饱和状态。48小时后，取原培养板中的菌液，每孔转移1微升至含有45微升/孔ST-URA培养基的384孔板中进行重新接种。同时，从同一来源板中另取每孔1微升菌液，接种至另一含有45微升/孔ST-URA并添加应激因子的384孔板中。立即将接种后的微孔板置于室温及大气二氧化碳条件下，使用微孔板读板仪按照48小时连续循环程序进行培养，每轮测量600纳米波长下的光密度值。当生长测量完成后，使用酶标仪软件将时间与600纳米波长下的光密度测量值导出为XY表格。将每个生物学重复的光密度测量值列进行分组，并计算其平均值。绘制时间与600纳米光密度的XY曲线图，以生成生长曲线。对于在特定胁迫条件下因祖先蛋白过表达而表现出显著生长差异的培养物，从每个生物学重复中取1微升，用10毫升水稀释后，取50微升涂布于含5-FOA的平板上。在30 °C下培养三天。若每个平板上的菌落数过多或过少，应相应调整稀释倍数。每块平板上100至200个菌落为宜。使用经高压灭菌的牙签挑取8至32个单菌落，接种于含96孔板中，每孔加入150微升SDCSM培养基。将96孔板置于湿盒中，在30摄氏度下培养48至72小时至

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