基于蛋白质的继承在酿酒酵母中的高通量筛选
August 8th, 2017
此协议说明一种高通量方法来功能屏幕在酿酒酵母中的蛋白质基础继承。
这种高通量酵母表型分析的总体目标是筛选具有传递表达的持久表型记忆的蛋白质，作为基于蛋白质的遗传的代理。这种方法可以帮助回答酵母朊病毒领域中的关键问题，例如，它可以非法遗传多少种蛋白质。该技术的主要优点是您可以以无偏倚的方式筛选许多蛋白质和通路。
通过在 96 摄氏度下在 30 孔板中培养适当的酵母细胞来开始此过程，如文本方案中所述。目视检查培养物以确认培养物已饱和，细胞应在每个孔的底部肉眼可见。使用液体处理机器人制备 384 孔板，每孔含有 45 μL 的适当培养基。
首先，将 Scal-URA 分配到 384 孔板的孔中。然后将 Scal-URA 加上感兴趣的压力源分配到第二个板的孔中，在该实验中使用 20 毫摩尔氯化锰作为压力源。第三，将不会诱导质粒表达的 SD-URA 和氯化锰分配到另一个板中。
将含有培养物的 96 孔板降低到液体处理机器人上，并从 96 孔板的每个孔中接种 1 到 4 个 1 微升的阵列，接种到每个 384 孔板的四个独立孔中，填充有不同培养基。立即将带有细胞的板放在室温和大气二氧化碳下的微孔板堆叠器上。将方案设置为 72 小时连续循环，使用酶标仪测量 600 纳米的光密度。
生长测量后，将每孔 1 微升经历蛋白质过表达的 SCal-URA 诱导的培养物转移到新的 384 孔板中，每孔含有 45 微升不允许质粒蛋白表达的 ST-URA 培养基。同时，对第二组 384 孔板进行类似接种，每孔含有 45 微升 ST-URA，这些 ST-URA 来自在应激源存在下在 ST-URA 中生长的培养物。将板放入加湿室中，并在 48 摄氏度下培养板 30 小时至饱和。
48 小时后，使用板在 384 孔板中每孔重新接种 1 微升，每孔含有 45 微升 ST-URA。然后，从同一源板每孔 1 微升单独重新接种到单独的 384 孔板中，每孔含有 45 微升的 ST-URA 和压力源。立即将带有微量堆叠器细胞的板置于室温和大气二氧化碳下，并将方案设置为连续 48 小时循环，用酶标仪测量 600 纳米的光密度。
生长测量完成后，使用 Plate Reader 软件将 600 纳米测量值的时间与光密度导出为 XY 表。将每个生物重复的光密度测量值列分组在一起并计算平均值。在 600 纳米处创建时间与光密度的 XY 图，以生成生长曲线。
对于响应给定应激源而选择显著生长差异的培养物，取决于祖先蛋白过表达，从每个生物重复中取出 1 微升，用 10 毫升水稀释，然后将 50 微升接种在含有 5-FOA 的平板上。在 30 摄氏度下生长 3 天。如果这导致每个板的菌落过多或过少，请相应地调整稀释因子。
每个板 100 至 200 个菌落是理想的。用高压灭菌器牙签挑选 8 到 32 个单菌落，并将它们固定在每孔含有 150 微升 SDCSM 的 96 孔板上。将板放入加湿室中，在 48 摄氏度下生长至 72 至 30 小时。
使用这些培养物接种两组新的 96 孔板，每孔含有 150 微升的 SDCSM，有和没有压力源。将板放在微孔板堆叠器上，并设置方案以在 48 小时连续循环中测量 600 纳米的光密度。48 小时后，如前所述分析数据，并确认之前看到的显着生长差异在质粒丢失后得以维持。
然后测试维持诱导表型的细胞是否具有文本方案中所述的基于蛋白质的遗传的典型标志。这种基于蛋白质的遗传筛选揭示了 PSP1 开放阅读框的瞬时过表达，导致对氯化锰的耐药性在过表达停止后很长一段时间内在细胞中维持了数百代。朊病毒预测算法将 PSP1 的末端评分为中等朊病毒样。
相比之下，这些算法从屏幕上回收的大多数诱导蛋白中几乎没有预测到明显的朊病毒样序列特征，如以下代表性分析所示。菌株和氯化锰 SDCSM 的生长测量，标准化为相应的初始 PSP1 减去对照，表明抑制 HSP104 解聚酶不会损害 PSP1 依赖性氯化锰耐药性，而去除 HSP70 伴侣和 PSP1 基因，遗传性地消除了这种表型。来自菌株之间杂交的单个四分体的所有孢子，携带 PSP1 依赖性表型状态和幼稚菌株，都显示出氯化锰抗性，表明表型的非孟德尔遗传。
模拟裂解物与以裂解物为传播材料的 PSP1 之间蛋白质转化的感染性比较表明，超过 53% 用接种的 PSP1 转化的幼稚细胞获得了相应的氯化锰抗性表型。一旦掌握，该技术可以在几周内完成，包括孵育步骤和大多数筛选步骤的准备可以在每天不到两个小时内完成，即使使用大量板也是如此。在尝试此过程时，请务必记住事先准确计划您要测试的内容，并牢记实验的规模。
现在，这对于该技术的初学者来说尤其重要。按照此过程，可以执行其他方法，如文本协议中描述的方法，以确定在筛选中观察到的表型是否显示出真正的、类似朊病毒的遗传模式。经过开发，这项技术为表观遗传学领域的研究人员探索朊病毒生物学在骶骨服务 CI 中的广度铺平了道路。
不要忘记，某些化学应激源（例如 DNA 损伤剂）可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护设备。
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概述
该协议描述了一种用于在酿酒酵母中功能性筛选蛋白质基因继承的高通量方法。该方法旨在识别可以诱导持久的表型记忆的蛋白质，从而为蛋白质基因继承机制提供见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 遗传学
背景
- 蛋白质基因继承是酵母研究的一个关键领域。
- 本研究关注蛋白质在表型记忆中的作用。
- 理解这些机制可以揭示朊蛋白生物学。
- 该方法允许对多个蛋白质进行无偏性筛选。
研究目的
- 筛选能够引起持久表型记忆的蛋白质。
- 研究酵母中蛋白质基因继承的潜力。
- 提供一种高通量方法来研究蛋白质功能。
使用的方法
- 酵母细胞在30摄氏度下在96孔板中培养。
- 目视检查培养物的饱和度。
- 液体处理机器人准备带有适当培养基的384孔板。
- 以无偏性方式对各种蛋白质进行筛选。
主要结果
- 该方法允许识别诱导表型记忆的蛋白质。
- 它提供了关于能够这种继承的蛋白质数量的见解。
- 研究的高通量性增强了筛选过程。
- 结果有助于理解酵母朊蛋白领域。
结论
- 该协议为研究蛋白质基因继承提供了一种新方法。
- 研究结果可能对更广泛的生物学研究产生影响。
- 未来的研究可以在此方法基础上探索更多蛋白质。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput screening for protein-based inheritance in S. cerevisiae enables systematic identification of proteins that drive heritable phenotypic changes independent of DNA sequence. This approach expands the discovery pipeline beyond genetic mutations, offering new avenues for target validation and mechanistic de-risking in early-stage R&D. The method's scalability and unbiased design support portfolio-wide interrogation of epigenetic mechanisms relevant to disease biology and therapeutic innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of non-genetic mechanisms underlying heritable phenotypes.
- Supports functional target validation by linking protein conformation to stable biological traits.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing protein-driven inheritance from classical genetic effects.
- Provides predictive confidence for advancing novel epigenetic targets.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, unbiased screening across the yeast ORFeome for protein-based inheritance.
- Standardizes phenotypic readouts using quantitative optical density measurements.
- Enables reproducible workflows for evaluating protein function under diverse stressors.
- Prepares validated biological systems for downstream mechanistic or compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by uncovering stable, non-Mendelian inheritance mechanisms.
- Supports translational biomarker discovery by linking protein states to persistent phenotypes.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation of epigenetic targets.
- De-risks advancement decisions by providing robust, heritable phenotypic endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This screening method integrates at the early discovery and target validation stages, bridging functional genomics and phenotypic screening workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for protein-driven inheritance and pathway clarification.
- Screening: Provides scalable, quantitative phenotyping for large-scale protein function assessment.
- Analytics: Generates growth curves and statistical outputs for condition comparison and hit selection.
- Translational Research: Connects protein-based inheritance findings to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for screening diverse genetic networks or environmental stimuli.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable high-throughput workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by revealing non-genetic drivers of phenotype.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of novel epigenetic targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, phenotypic screening, and data analysis.
- Needs access to liquid handling robotics, microplate readers, and analytical software.
- Demands cross-team standardization of protocols and data interpretation criteria.
- Adaptable to targeted or unbiased screens across different genetic or environmental contexts.
- Scale and complexity may require careful experimental planning and resource allocation.
