Name: 一种从煤泥霉菌中生长生物器的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学习利用多头绒泡菌培养生物忆阻器的标准化方法，通过3D打印容器和琼脂接种技术，可在12小时内完成电极连接。该技术使非专业人员也能进行生物计算实验，为非常规计算研究开辟新途径。

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本研究由普利茅斯大学人文与表演艺术学院资助。作者感谢Functionalize公司提供其导电PLA样品。

1. 3D 打印容器的制备
<ol>
	<li>腔室、盖子和底座
	<ol>
		<li>使用打印机界面将高抗冲聚苯乙烯（HIPS）装入3D打印机，设置打印床温度为85 °C，挤出机温度为230 °C。当达到设定温度后，松开惰轮臂，插入耗材，并向下推动直至耗材开始从热端挤出。然后重新拧紧耗材惰轮臂，并清除挤出的多余材料。</li>
		<li>将3D容器的STL模型文件导入3D打印切片软件中，通常可通过进入文件选项卡并选择导入/打开选项完成（图2）。</li>
		<li>如果切片软件提供高、低质量打印设置，请选择高质量模式，同时确保已选择正确的材料配置文件。 
		注意：若一次打印多个容器，请确保软件设置为逐个打印每个对象。若跳过此步骤，打印质量可能下降，导致组装部件时出现公差问题。</li>
		<li>打印完成后，等待打印床温度降至50 °C以下后再取下部件。</li>
		<li>使用细钢丝刷轻轻清理电极插孔中的任何瑕疵，避免在将腔室与电极装配时产生阻碍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电极
	<ol>
		<li>将HIPS耗材更换为清洁耗材，并让大量材料通过打印头进行清洗。</li>
		<li>将具有0.75 Ω·cm或更低体积电阻率的导电性聚乳酸（PLA）耗材装入打印机。</li>
		<li>设置打印床温度为60 °C，挤出机温度为230 °C（参见步骤1.1.1的操作指导）。</li>
		<li>当达到设定温度后，通过打印头挤出数厘米长的耗材，以确保彻底清除之前打印残留的颗粒物。</li>
		<li>使用3D打印切片软件加载电极的STL文件（图3）。</li>
		<li>在打印设置中指定以下参数：层高 = 0.16 mm，壳体厚度 = 1.7 mm，底部/顶部厚度 = 0.74 mm，填充密度 = 100%（图4）。</li>
		<li>若一次打印多个电极，请设置打印机逐个打印。</li>
		<li>打印完成后，让电极留在打印床上直至冷却至室温，以防止部件发生翘曲或变形。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>容器组装
	<ol>
		<li>将电极分别插入两个腔室中。若步骤1.1.5已正确完成，则电极应能无需施加较大力量即可顺利装入腔室。</li>
		<li>使用锋利的手术刀，切割一段10 mm长的聚氯乙烯（PVC）管（内径4 mm，外径6 mm），注意确保两端切割平整、干净。</li>
		<li>将10 mm长PVC管的两端轻轻套入两个电极的边缘。</li>
		<li>连接完成后，将两个腔室卡入底座中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 接受器准备与P. polycephalum接种
<ol>
	<li>2% 琼脂培养基的制备
	<ol>
		<li>将 2 g 非营养性微生物琼脂粉末放入一个 250 mL 玻璃瓶中。</li>
		<li>加入 100 mL 去离子水并充分混合。</li>
		<li>在 121 °C 条件下高压灭菌 12 - 15 分钟，或置于沸水浴中加热 15 - 20 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将琼脂基质注入容器的腔室中
	<ol>
		<li>使用水浴或微波炉将琼脂融化。</li>
		<li>用 2 mL 移液器吸取熔化的琼脂。</li>
		<li>将移液器尖端悬停在腔室内部底部上方约 5 mm 处，缓慢注入琼脂，直至液面升至连接管孔的底部。</li>
		<li>注满各腔室后立即盖上盖子，并将容器静置，直至琼脂完全凝固并达到室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>P. polycephalum 接种
	<ol>
		<li>在两个腔室中各放入一片燕麦片。</li>
		<li>从饥饿处理约 12 小时的原生质团培养物中取出一个 2 mL 的伪足团块，放入其中一个腔室中。为促进快速生长，应尽量取自该生物体最活跃的前端部分的原生质。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chua, L. O. <a target="_blank" href="http://ccfit.nsu.ru/~tarkov/Memristive%20computing/Chua/Chua1971_Memristor.pdf">Memristor-The Missing Circuit Element.</a> IEEE Transactions on Circuit Theory. 18 (5), 507-519 (1971).</li>
<li>Trefzer, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-319-49881-2_6">Memristor in a Nutshell.</a> Guide to Unconventional Computing for Music. , 159-180 (2017).</li>
<li>Strukov, D. B., Snider, G. S., Stewart, D. R., Williams, R. S. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v453/n7191/full/nature06932.html">The missing memristor found.</a> Nature. 453 (7191), 80-83 (2008).</li>
<li>Howard, G., Gale, E., Bull, L., De Lacy Costello, B., Adamatzky, A. <a target="_blank" href="https://arxiv.org/pdf/1212.3441.pdf">Evolution of plastic learning in spiking networks via memristive connections.</a> IEEE Transactions on Evolutionary Computation. 16 (5), 711-729 (2012).</li>
<li>Sah, M. P., Kim, H., Chua, L. O. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/6744690/">Brains are made of memristors.</a> IEEE Circuits and Systems Magazine. 14 (1), 12-36 (2014).</li>
<li>Miranda, E. R., Kirke, A., Braund, E., Antoine, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-319-49881-2_2">On Unconventional Computing for Sound and Music.</a> Guide to Unconventional Computing for Music. , 23-62 (2017).</li>
<li>Volkov, A. G., Tucket, C., Reedus, J., Volkova, M. I., Markin, V. S., Chua, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24556876">Memristors in plants.</a> Plant Signal Behav. 9 (2), 37-41 (2014).</li>
<li>Grimnes, S., Lütken, C. A., Martinsen, ØG. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-642-03885-3_193">Memristive properties of electro-osmosis in human sweat ducts.</a> World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering, September 7-12, 2009, Munich, Germany. , 696-698 (2009).</li>
<li>Gale, E., Adamatzky, A., de Lacy Costello, B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12668-014-0156-3">Slime Mould Memristors.</a> BioNanoScience. 5 (1), (2014).</li>
<li>Braund, E., Sparrow, R., Miranda, E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-319-26662-6_34">Physarum-based memristors for computer music.</a> Advances in Physarum Machines. , 755-775 (2016).</li>
<li>Daniel, J. W., Rusch, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pure+culture+of+Physarum+polycephalum+on+a+partially+defined+soluble+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The pure culture of Physarum polycephalum on a partially defined soluble medium.</a> Journal of General Microbiology. 25 (1901), 47-59 (1961).</li>
<li>Adamatzky, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13534-013-0108-9">Physarum wires: Self-growing self-repairing smart wires made from slime mould.</a> Biomedical Engineering Letters. 3 (4), 232-241 (2013).</li>
<li>Tarabella, G., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/sc/c4sc03425b">A hybrid living/organic electrochemical transistor based on the Physarum polycephalum cell endowed with both sensing and memristive properties.</a> Chemical Science. 6 (5), 2859-2868 (2015).</li>
<li>Braund, E., Miranda, E. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1672652916603864">On Building Practical Biocomputers for Real-world Applications: Receptacles for Culturing Slime Mould Memristors and Component Standardisation.</a> Journal of Bionic Engineering. 14 (1), 151-162 (2017).</li>
<li>Peninsula Arts. Peninsula Arts Contemporary Music Festival 2016. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cmr.soc.plymouth.ac.uk/event2016.htm">http://cmr.soc.plymouth.ac.uk/event2016.htm</a> (2017).</li>
<li>Walter, X. A., Horsfield, I., Mayne, R., Ieropoulos, I. A., Adamatzky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+hybrid+circuits+exploiting+thermistive+properties+of+slime+mould%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">On hybrid circuits exploiting thermistive properties of slime mould.</a> Scientific reports. 6, (2016).</li>
<li>Romeo, A., Dimonte, A., Tarabella, G., D'Angelo, P., Erokhin, V., Iannotta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bio-inspired+memory+device+based+on+interfacing+Physarum+polycephalum+with+an+organic+semiconductor%5BTitle%5D)+AND+%22APL+materials%22%5BJournal%5D)">A bio-inspired memory device based on interfacing Physarum polycephalum with an organic semiconductor.</a> APL materials. 3 (1), (2015).</li>
<li>Whiting, J. G., de Lacy Costello, B., Adamatzky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+function+of+protoplasmic+tubes+of+Physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">Transfer function of protoplasmic tubes of Physarum polycephalum.</a> Biosystems. 128, 48-51 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种利用黏菌P. polycephalum培育忆阻器的方法。该生物体被培养在3D打印的容器内，这些容器的设计旨在克服实现生物忆阻器过程中存在的一些限制。这些限制包括装置准备时间、样品生长时间，以及样品间生长条件和电学观测缺乏标准化等问题。
我们的培养装置最初于2015年在半岛艺术当代音乐节2016（PACMF）的印刷宣传材料及相应网站上公开15。在此应用中，该技术被用于开发一种混合硬件-生物交互式音乐系统，能够为现场演奏的音乐家生成音乐伴奏。在参考文献14中，我们报告了对该培养装置的广泛测试，并将结果与先前的方法9,10进行了比较。在此之后，另一组研究人员进一步探索了构建生长环境以研究该生物体的热敏特性16，但这些特性与忆阻特性并不相同。然而，迄今为止，仅有另外两项研究尝试以可控方式实现P. polycephalum忆阻器13,17。在这些实验中，研究人员使用一种名为聚二甲基硅氧烷（PDMS）的类凝胶生物相容性弹性体材料制作微孔，电极则采用多种金属或聚(3,4-乙烯二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐)（PEDOT:PSS）制成。尽管这些材料在电子学、微流控和仿生工程中常规使用，但其成本较高，且需要一定的专业技术才能操作。例如，PEDOT:PSS需要通过旋涂和掺杂处理以提高其导电性。因此，这些技术对于无法获得专业资源的人员而言难以实现。本文所介绍的培养装置采用的方法和材料均易于获取且成本低廉。此外，该设计为原生质团提供了适宜的栖息环境，这与此前其他P. polycephalum忆阻器原型形成对比——在那些原型中，并未尝试维持细胞在实验期间的存活状态。
迄今为止，使用以往在培养皿上培养该生物体的方法难以获得稳定的电流-电压（I-V）测量结果（图5，左侧）。我们的方法显著改善了这一状况（图6）。对本装置的测试结果表明，该设计缩短了生长周期，延长了生物体寿命，实现了组件响应的标准化，并构建了一个受保护的微环境以包封该生物体。此外，该装置为将该生物体整合为电路系统中的一个功能组件提供了可行途径。
本文所述方法缓解了在电气系统中利用P. polycephalum忆阻器时存在的若干问题。然而，仍存在一些局限性，需要进一步的研究与开发。首先，如果容器经历快速的温度变化，或在较长时间内施加高电压，连接管的内表面可能会产生冷凝水。后者是由于生物体具有较高的电阻，导致电能转化为热能。若冷凝现象显著，可能在连接管两端的两个电极之间形成低电阻通路。这一局限性可通过确保忆阻器不超负荷运行而有效控制。其次，采用本文所述方法制备的忆阻器，其整体电阻在不同器件之间可能存在差异。这种现象可能是由于该方法未对原生质管的外径进行限制所致。因此，用户在应用这些忆阻器时，可能需要引入校准步骤。
通过这种方法，我们现在可以开始研究在多头绒泡菌（P. polycephalum）中引起忆阻现象的生物学过程。这些过程可能具有动态参数，我们或许能够加以利用以增强该元件的应用。我们已开始进行一些初步实验，通过改变细胞外离子浓度，来检验电压门控离子通道是否在忆阻效应中发挥作用。
P. polycephalum忆阻器的实现而专门设计。然而，这些装置的应用可能不仅限于单一元件的构建。例如，在参考文献12,18中，原生质管被研究作为一种自组装和自修复的生物导线。在这两项研究中，研究人员均指出，仍需进一步工作以建立按照特定方案生长原生质管的方法。本文提出的容器提供了一种在两个或更多点之间界定原生质管生成路径的方法。图7展示了两张照片，说明这些容器可用于生长长度超过100 mm的健康原生质管。在参考文献18中，研究了原生质管的传递函数。该研究结果表明，若将该生物体整合到电子系统中，用于培养原生质管的琼脂可能会引发问题，原因在于基质具有电容性。本文所提出的容器仍需使用琼脂以维持高湿度环境。然而，若对容器设计进行微小改进，则有可能构建出可拆卸的原生质管。这种设置可在原生质管生长完成后将其从培养腔室中断开，并插入电子系统中使用。此外，一旦原生质管的健康状况开始下降，还可将其重新连接至新的腔室以获取营养和休养，直至其自我修复后再次投入使用。图8展示了一张长原生质管已从腔室断开的照片。未来的研究需要进一步探究在不使用琼脂的情况下，以及采用本文所述方法在较长距离下生长的原生质管的电学特性。

当今的计算机是利用三种双端子基本无源电路元件构建的：电容器、电阻器和电感器。无源元件只能耗散或储存能量，而不能产生能量。这些元件建立于18th和19th世纪，且通过麦克斯韦方程组相互关联。我们通过四种电路变量中的两个之间的关系来定义这三个电路元件，这四种电路变量分别是电流（I）、电压（V）、电荷（Q）和磁通链（φ）。电荷是电流对时间的积分，而法拉第定律将电压定义为磁通对时间的积分。因此，电容器由电压与电荷之间的关系定义，电阻器由电压与电流之间的关系定义，电感器由磁通与电流之间的关系定义。一个多世纪以来，这些元件一直是电子学的基石。然而，它们仅代表了电路变量之间可能存在的四种关系对中的三种，留下了磁通链与电荷之间尚未关联。1971年，蔡少棠（Leon Chua）发表了一篇论文1，提出存在一个缺失的第四种元件，用于连接剩下的两个变量，他将其称为忆阻器（memristor）。忆阻器可被描述为一种能够记忆其历史状态的电阻器，因此得名“记忆电阻器”（memory resistor）。该元件通过根据先前施加电压的大小及其持续时间来改变自身的电阻而发挥作用。此外，当电压不再施加时，忆阻器会保持其最后的电阻状态。与电容器、电阻器和电感器不同，忆阻器的行为具有非线性特征，这在其电流-电压（I-V）特性曲线中表现明显：在交流电压作用下形成一个捏缩的滞后环。该环呈现为包含高阻态与低阻态两个垂直振荡的李萨如图形。在蔡少棠正式提出忆阻理论之前，已有其他研究人员在实验聚合物和金属氧化物等材料以及开发微米尺度电子器件时，报告了在特定频率下出现的记忆电阻效应2。然而，在许多情况下，这些效应被视为不利因素。直到近四十年后，蔡少棠的理论才被关联到实际物理器件上，研究人员才开始探索利用忆阻效应的方法。2008年，惠普实验室（HP Laboratories）的一个团队成功制备出一种忆阻器件3，引发了人们对这一元件的巨大兴趣。&#160;
由于忆阻器被认为是首个将处理与存储功能集成于单一单元的元件，计算机科学家对其产生了浓厚兴趣。此外，它还表现出类似于某些神经生物学过程的行为，例如脉冲时序依赖可塑性（Spike-Timing-Dependent Plasticity, STDP）4。这类特性为构建类脑计算技术带来了新的前景，有望打破传统内存与中央处理器（CPU）之间的界限5。与当前主流的忆阻器开发方法（例如使用TiO2）不同，我们的目标是研制一种有机生物忆阻器。此外，我们还关注该器件如何为探索超越传统计算设备工程范式的新方法提供可能；e.g.，在计算机音乐领域的创新应用6。
忆阻是研究人员最近在多种生物系统中发现的一种现象。例如，在芦荟植物中已观察到具有忆阻特性7 和人类皮肤8，仅举两例。这些发现表明，或许有可能在生物基质上实现信息处理和存储器件。在技术中利用有机系统，可能使我们探索诸如自组装、自修复、低环境影响和自供能等令人兴奋的概念。然而，在我们能够深入研究这些机遇之前，必须解决若干挑战。许多具有忆阻特性的生物系统存在显著限制，制约了其作为实际电子元件的可行性。例如，芦荟叶片7 需要光照，寿命有限，且难以集成到电路中。此外，还有其他几种 体内 忆阻现象，例如人体汗腺导管8目前尚不可行将其开发为适用于实验室之外及日常电子系统的方案。然而，在所有忆阻现象中，存在一种潜在候选者： P. polycephalum.
P. polycephalum 的原生质团是一种无定形的单细胞系统，已被发现可作为忆阻器元件9,10。该生物体之所以成为湿件-硬件混合电子学研究的理想候选对象，原因有多个。首先，该生物体无致病性、具有宏观形态，且无需使用专业设备，这使得非生物学家和工程师均可方便地获取和操作原生质团。其次，该细胞呈无定形状态，可形成类似导线的脉络网络，并能在大多数基底上生长（图1）。这些特性使得细胞形态易于被引导，以符合传统的电路设计。此外，已有研究证明，该原生质团可存活四年以上11，其脉络可作为可自我修复的导电通路12。多项实验室研究已证实该生物体具备忆阻特性9,10,13，目前正是深入探索其应用潜力的合适时机。
使用多头绒泡菌（P. polycephalum）忆阻器的想法相对较新，因此目前尚无统一标准用于测量和观察其电学特性。同一研究组内部及不同研究组之间实验流程缺乏一致性，可能是导致已发表结果存在差异的原因9,10。这种差异在样品培养条件和操作处理方面可能尤为显著。因此，我们需要建立制备和测试P. polycephalum忆阻器的方法，以更有效地控制和监测可能导致误差的各种因素。&#160; 此外，我们还需要开发能够将P. polycephalum忆阻器稳定、便捷地集成到电子系统中的实现方法。
本文介绍的方法为探索实际应用提供了一个平台 P. polycephalum 忆阻器，方法是提供将生物体作为组件整合进电路图的手段。这些技术很可能吸引那些希望探索硬件-湿件混合系统在现实世界中应用的工程师。此外，该方法对非专家而言也易于掌握（例如，开源电子原型开发爱好者）可能对非常规计算的某些方面进行实验感兴趣，但发现难以找到可适应其需求的原型。一些潜在应用包括：利用忆阻器的脉冲行为实现概率模型，开发执行有状态逻辑运算的方法，以及模拟神经过程以实现信息存储与处理。

<table><tbody><tr><td>导电PLA线材 2.85mm</td><td>Functionalize</td><td>FE_1LB_2.85MM</td><td>导电3D打印线材</td></tr><tr><td>HIPS线材 3mm 1KG（黑色）</td><td>NuNus</td><td>104856</td><td>3D打印线材</td></tr><tr><td>清洗线材，3mm，0.1 kg，本色</td><td>3D Prima</td><td>3DPCLEAN300</td><td>3D打印机清洗线材</td></tr><tr><td>Lulzbot Taz 5</td><td>Lulzbot</td><td>TAZ 5</td><td>3D打印机</td></tr><tr><td>琼脂粉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0504</td><td>非营养性微生物琼脂粉</td></tr><tr><td>内径4mm × 外径6mm 透明PVC软管 5米</td><td>Amazon</td><td>B008NC4JUO</td><td>PVC软管卷</td></tr><tr><td>多头绒泡菌原生质，活体，培养皿</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>156193</td><td>原生质体培养物</td></tr><tr><td>燕麦片</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td></td><td>用于喂养原生质体的燕麦片</td></tr><tr><td>Cura</td><td>Lulzbot</td><td>Cura LulzBot Edition</td><td>https://www.lulzbot.com/cura</td></tr><tr><td>230型可编程电压源</td><td>Keithley Instruments</td><td></td><td>电压源仪器</td></tr><tr><td>617型可编程静电计</td><td>Keithley Instruments</td><td></td><td>用于测量微弱电流的静电计</td></tr></tbody></table>

一种利用黏菌培育生物忆阻器的方法

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

我们的研究旨在更深入地理解生物体的电子特性，以基于生物学设计和构建新型生物电子系统与计算架构。本文重点探讨利用单细胞黏菌 多头绒泡菌 开发生物忆阻器（或称生物忆阻器）及生物计算装置。忆阻器是一种具有记忆功能的电阻器，是第四种基本的无源电路元件&#160;电路元件（另外三种是电阻器、电容器和电感器），这为设计新型计算系统铺平了道路； 例如，可能放弃存储单元与中央处理器之间区别的计算机。当施加交流电压时，忆阻器的电流-电压特性呈现为捏滞回线。已有研究表明 P. polycephalum 在交流电压下产生捏滞回线，并表现出与忆阻器功能相当的自适应行为。本文介绍了我们开发的利用生物材料实现生物忆阻器的方法 P. polycephalum 并介绍了用于培养该生物体的培养装置的开发，该装置有助于将其作为电子电路元件进行部署。我们的方法已证明可缩短生长周期、延长元件使用寿命，并实现电学观测的标准化。

为了获得具有代表性的结果，我们采用上述完全相同的方法制备了5个样品。作为对照，另设5个样品，采用早期 P. polycephalum 忆阻器研究中描述的方法9,10。在该对照实验中，我们将两个电极置于60 mm的培养皿内，电极间距约为10 mm。每个电极由一圈锡镀铜导线（直径约20 mm，16股，每股0.2 mm）构成，其中填充2%非营养性去离子琼脂（约2 mL）。所有样品均通过延时成像进行监测，以记录生长所需时间。在实验组的5个样品中，均在接种后10小时内实现了两个电极之间的连接；其中最快的一个在2小时以内完成生长，最慢的为10小时，5个样品的平均生长时间为7小时24分钟。在对照组中，4个样品形成了连接两个电极的原生质管，另1个样品虽从接种电极开始扩展，但在完成连接前干涸。对照组中最快连接完成时间为19小时，最慢为36小时，平均生长时间为26小时15分钟。这些数据表明，采用本文所述方法培养的忆阻器在生长时间上显著缩短。
忆阻器的电流-电压（I-V）特性曲线是其最显著的特征。因此，我们对样品进行了I-V测量，以获得本文的代表性结果。在此过程中，对一个160步的电压正弦波的每一步进行瞬时电流测量，每个电压步长的静态停留时间为2秒。电学测量使用230型可编程电压源和617型可编程静电计完成。选择这些设备是因为它们能够以高分辨率输出电压并进行测量。实验在室温、无光照的环境中进行。
图6展示了从多头绒泡菌（P. polycephalum）忆阻器测试中获得的典型I-V曲线。图6c和6d显示了在培养皿中制备的器件所测得的代表性数据图。采用该方法的结果表明，尽管在同一样品上测得的曲线在形态上相似，但样品之间的滞后现象差异显著。这种差异包括捏合点的位置、正负支路峰值的大小，以及负电压域与正电压域测量结果之间的对称性。因此，采用培养皿方法在忆阻器上测得的I-V曲线并不具备“理想”忆阻器的特征，因为其捏合点并不位于零电压和零电流处。图6a和6b展示了在容器中生长的忆阻器所获得的代表性测量结果图。这些滞后环的捏合点位置和支路大小在不同电压范围和时间步长下测试的单个样品曲线之间，以及样品与样品之间的曲线中均表现出相对一致性。因此，容器法测得的I-V曲线更接近于“理想”忆阻器的特征，其捏合点始终为单一且几乎始终位于零电压和零电流处。然而，尽管样品间的滞后形态相似，样品之间的整体电阻仍存在差异。
完成初始的I-V测量后，每天对每个样品进行一次测试，直至其不再呈现忆阻曲线。在4个对照样品中，有2个在初始测试后的2天内干涸，其余2个则继续记录捏合曲线达额外2天。 receptacle样品的忆阻特性至少维持了7天，其中3个样品超过了这一时长。随着时间推移，每个receptacle样品的原生质管逐渐变粗，整体电阻下降，部分样品在10 V测试中的电阻值达到A × 10-04范围，而早期测试中为A × 10-05。
读者可参考 Braund14 的文章，了解有关所展示容器的广泛测试结果。
<img alt="培养皿中的黏菌网络，正向食物源生长，用于行为建模实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 多头绒泡菌（P. polycephalum）培养2天的原生质团培养物照片。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56076/56076fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="3D打印过程，3D打印机组件，CAD设计布局，装配规划。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2： 将接头STL文件载入切片软件后的截图。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56076/56076fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="3D打印设计流程；网格上的蓝色部件布局；CAD仿真图；设计预览。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：电极STL文件加载到切片软件后的截图。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56076/56076fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="3D打印设置对话框，层高0.16 mm，壳厚1.7 mm，填充密度100%。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：电极STL模型打印设置配置的截图。
<img alt="在培养皿中进行的黏菌生长实验及用于路径寻找研究的3D打印迷宫。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5： 两张照片，分别展示在培养皿中实现的 P. polycephalum 忆阻器（左）以及采用本文所述方法实现的忆阻器（右）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56076/56076fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="循环伏安法图谱、电流与电压分析、电化学实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6： 由两个在 receptacles 中制备的忆阻器（a, b）和两个在培养皿中实现的忆阻器（c, d）所获得的四条 I-V 曲线。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56076/56076fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="管中的流体动力学、压力系统、带有管和连接器的实验装置放置在标尺上。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7： 照片显示使用容器培养不同长度的管。
<img alt="黏菌生长实验的塑料管示意图，标尺显示测量刻度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 8"> 
图8： 一张显示已从培养室断开的原生质管的照片。

本文介绍了一种利用多头绒泡菌（Physarum polycephalum）的原生质团培养生物忆阻器的改进方法。该方法已被证实可缩短生长周期、延长器件寿命、标准化电学特性观测，并构建可集成到常规电路中的保护性环境。

我们的研究旨在更深入地理解生物体的电子特性，以设计新型的生物电子系统并……

本实验的总体目标是标准化基于多头绒泡菌（Physarum polycephalum）的忆阻器的制备方法，以推动其在技术中的集成应用。通过这些方法，我们可以开始探索基于多头绒泡菌的元件在实验室外及现实世界中的实际应用。该技术的主要优势在于，它能够将这些元件转化为一种既便于非专业人士使用，又易于整合到分析电路中的形式。我们最初是在开发一种基于多头绒泡菌（Physarum polycephalum）忆阻器的音乐处理系统用于实时演奏时，提出了该方法的构想。为了在实验室外使用基于这些组件的系统，必须解决其实用性问题。首先，将高抗冲聚苯乙烯装入3D打印机中。然后，准备使用3D打印机。将打印床温度设置为85摄氏度，挤出机温度设置为230摄氏度。达到目标温度后，松开惰轮臂，插入耗材，并向下推动，直至聚苯乙烯从热端挤出。然后，重新拧紧挤出机惰轮臂，并移除已挤出的材料。接下来，在软件控制界面中加载3D插座的STL模型文件。如果可选择高或低打印质量，请选择高质量打印，同时确保已选中正确的材料配置文件。收集零件后，使用细钢丝刷轻轻清除电极插座上的任何缺陷，以免影响设备组装。现在，在打印机上将HIPS耗材更换为清洗耗材，并通过打印头挤出足量材料，以确保彻底清洁。接下来，使用具有低体积电阻率的导电聚乳酸（PLA）耗材装入打印机。然后，将打印平台温度设置为 60 摄氏度，挤出头温度设置为 230 摄氏度。当温度达到设定值后，挤出数厘米耗材，以确保清除之前使用残留的所有颗粒物。现在，加载电极的 STL 文件，在打印设置中指定层高、侧壁厚度、底部和顶部厚度以及填充密度等所需的参数。打印完成后，让电极在打印平台上冷却至室温后再进行处理，以确保部件不会发生翘曲或变形。组装部件时，首先轻轻将电极插入两个腔室中。插入时不应使用过大力量。接着，使用锋利的手术刀小心地切割一段10 mm的PVC管，确保每一处切口平直且整齐。然后，将10 mm PVC管的两端轻轻套在两个电极的边缘上。连接后，将两个腔室卡入底座中。预先制备2%非营养琼脂。当琼脂冷却至约 55 摄氏度时，使用 2 mL 移液器将琼脂转移至容器的各个腔室中。将移液器吸头悬停在液面约 5 mm 上方，缓慢加样至连接管孔的底部，注意避免引入气泡。加样完成后，立即为每个腔室盖上盖子，并将容器静置，直至琼脂完全凝固并达到室温。然后，在每个小室的琼脂上放置一片燕麦片。接着，从培养12小时的饥饿菌原质团培养物中取出2 mL的伪足团块。为促进快速生长，应尽量从该生物体最活跃的前端区域获取原生质。这些容器非常坚固，通常在12小时内即可准备就绪投入使用。一旦黏菌在两个电极之间形成连接，容器即为准备就绪状态。通过透明的PVC管观察该生物体，即可轻松判断这一连接的形成。按照所述方法制备了五个样品，并通过延时成像监测其生长所需时间。接种后10小时内，所有五个样品均连接了两个电极，其中一个在两小时内即完成连接。我们的忆阻器的IV特性曲线是最具特征性的表现。在160步电压符号波的每一步上均进行了瞬时电流测量。每个电压步长的静态停留时间为两秒。实验在室温下于无光照的房间内进行。在不同时间步长和电压范围下测得的单个样品曲线，以及样品间的曲线均表现出强相关性。电滞回线的叶瓣尺寸和夹点位置相对一致。这类似于理想忆阻器的特征，其捏缩点始终为单一且几乎恒定地位于零电压和零电流处。在完成初始的电流-电压（IV）测量后，对每个样品每天测试一次，直至其无法再呈现出类似忆阻器的行为特征。在五个样品中，所有样品均至少正常工作了七天。随着时间推移，原生质管逐渐增粗，整体电阻在约一天内先下降，随后上升；尽管早期测试时电流处于10的负5次方量级（10伏电压下运行），但部分样品后期测得电流达到10的负4次方量级。观看本视频后，即使没有配备完善资源的实验室和昂贵设备，你也能够开展生物忆阻器的实验。该技术为非常规计算领域的研究人员探索生物忆阻器在实际应用中的使用铺平了道路。一旦掌握，受体的制备可在一小时之内完成，且生长过程将在12小时内结束。在尝试该操作时，需注意生长速度在很大程度上取决于多头绒泡菌（Physarum polycephalum）培养物的状态。在完成该操作后，可进一步开展实验，以回答其他问题，例如：多头绒泡菌（Physarum polycephalum）忆阻现象背后的生物学机制是什么？

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