Name: 氟 TrFE 导管内许旺细胞移植桥断大鼠脊髓残肢促进轴突再生跨越间隙 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 了解利用氟TrFE导管填充许旺细胞和可注射基质桥接大鼠完全横断脊髓残端的方法。该技术促进轴突再生跨越损伤间隙，为脊髓损伤修复提供新策略。

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我们感谢迈阿密瘫痪治疗项目中的病毒载体核心实验室和动物核心实验室分别制备了慢病毒-GFP病毒并提供了动物护理，同时感谢组织学核心实验室和成像核心实验室提供冷冻切片机、共聚焦显微镜以及配备Stereo Investigator系统的荧光显微镜。本研究由美国国立神经疾病与中风研究所（NINDS，项目号09923）、美国国防部（DOD，项目号W81XWH-14-1-0482）和美国国家科学基金会（NSF，项目号DMR-1006510）提供资金支持。M.B. Bunge 是神经科学领域的克里斯汀·E·林杰出教授。

雌性成年Fischer大鼠（体重180 - 200&#160;g）的饲养遵循美国国立卫生研究院（NIH）和美国农业部（USDA）的指南。所有动物实验程序均经迈阿密大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 移植前准备
<ol>
	<li>导管制备。
	<ol>
		<li>在解剖显微镜下，使用#10刀片将导管切割为5 mm长度。 
		注意：导管内径为2.4–2.7 mm；外径为2.5–2.8 mm。</li>
		<li>沿纵向轻轻折叠导管（图1A）。使用直刃Vannas剪刀，在距导管开口至少1 mm处，沿同一侧剪出四个长约0.4 mm、间距约1 mm的小切口（图1B）。
		<ol>
			<li>将导管展开（图1C），然后在同一侧的两个切口之间进行切割，形成两个并列的窗口（图1D）。确保窗口能沿未切割的一侧正常开合。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将导管置于10 cm培养皿中，用75%乙醇消毒25分钟。用1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗导管一次，每次4分钟，并用无菌镊子将导管转移至新的10 cm培养皿中。再用1×PBS冲洗导管两次，每次25分钟。</li>
		<li>将导管保存在1×PBS中直至手术使用。 
		注意：可同时对多个导管进行消毒。将导管分别存放于无菌的1.5 mL离心管中，以保持其无菌状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绿色荧光蛋白（GFP）标记的施万细胞（SC）制备
	<ol>
		<li>按照先前描述的方法43，从成年雌性Fischer大鼠的胫神经中制备纯化的施万细胞（SC）培养物。完成此步骤后，将SC接种于多聚-L-赖氨酸（PLL）包被的10 cm培养皿中，并在D10/3M培养基中维持培养；这些细胞定义为第0代。 
		注意：D10/3M培养基的成分为：10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素（pen/strep）、20 µg/mL垂体提取物、2 µM forskolin、2.5 nM heregulin，溶剂为杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
		<li>每3至4天更换一次新鲜D10/3M培养基（每10 cm培养皿7 mL）。</li>
		<li>当SC培养物达到70–80%融合度时进行传代。
		<ol>
			<li>吸除培养基，并用不含钙和镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）冲洗两次。</li>
			<li>向每个10 cm培养皿中加入5 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液，在室温（RT）下孵育5分钟。</li>
			<li>向50 mL离心管中加入5 mL D10培养基（含10% FBS和1% pen/strep的DMEM），用于中和胰蛋白酶。</li>
			<li>轻轻吹打培养皿中的胰蛋白酶/EDTA溶液数次以使SC脱落。将细胞悬液转移至上述步骤准备好的离心管中。再用5 mL D10培养基冲洗培养皿，并将冲洗液也加入离心管中，以最大化回收细胞。</li>
			<li>在4 oC条件下，以370 × g离心5分钟。弃上清，按每传代一个培养皿加入4 mL D10/3M培养基重悬细胞。</li>
			<li>将1 mL SC悬液与6 mL D10/3M培养基加入一个10 cm培养皿中；每次传代一个培养皿可获得4个新培养皿。这些细胞定义为第1代。</li>
			<li>接种后次日更换新鲜D10/3M培养基，之后每3–4天更换一次。</li>
			<li>当SC达到70–80%融合度时，重复步骤1.2.3.1至1.2.3.6，但将SC重悬于6 mL D10培养基中。此时细胞为第2代。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>当SC达到约50%融合度时，使用编码GFP的慢病毒载体在D10/3M培养基中以感染复数（MOI）为30的条件过夜转导，方法如前所述44,45。</li>
		<li>次日更换新鲜D10/3M培养基，并在之后每3–4天更换一次。</li>
		<li>当GFP-SC达到70–80%融合度时，重复步骤1.2.3.1至1.2.3.5，但将GFP-SC重悬于6 mL D10培养基中。取15 µL GFP-SC悬液加入1.5 mL离心管中，再加入15 µL 0.4%台盼蓝溶液。轻轻弹击离心管混匀，取10 µL混合液加入细胞计数板的一个计数室中。
		<ol>
			<li>将计数板放入自动细胞计数仪中，测定细胞密度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在4 oC条件下，以370 × g离心5分钟。弃上清，按每3×106个GFP-SC加入1.5 mL冻存液重悬细胞。将1.5 mL GFP-SC悬液分装至冻存管中，先在-80oC冷冻至少24小时，再转移至液氮中长期保存。 
		注意：冻存液成分为：25% FBS和8%二甲基亚砜（DMSO）溶于DMEM中。</li>
		<li>手术前一周复苏GFP-SC。
		<ol>
			<li>向50 mL离心管中加入10 mL D10培养基。</li>
			<li>将冻存的GFP-SC冻存管在37 oC水浴中解冻至部分融化状态。</li>
			<li>将GFP-SC悬液从冻存管中取出，转移至步骤1.2.8.1准备好的50 mL离心管中。反复轻柔吹打混匀。</li>
			<li>在4 oC条件下，以370 × g离心5分钟。弃上清，按每支冻存管加入4 mL D10/3M培养基重悬细胞。</li>
			<li>将2 mL GFP-SC悬液与5 mL D10/3M培养基加入一个10 cm培养皿中；每支冻存管可获得2个培养皿。此时GFP-SC定义为第3代。 
			注意：一个10 cm培养皿在培养一周后通常可收获约8×106个GFP-SC。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>手术当天重复步骤1.2.6。使用步骤1.2.10中计算得到的细胞密度。</li>
		<li>根据步骤1.2.9计算的细胞密度，将3×106个GFP-SC分装至无菌1.5 mL离心管中。在4 oC条件下，以370 × g离心5分钟，弃上清。向每管中加入1 mL DMEM/F12培养基，再次以370 × g离心。 
		注意：每只动物接种3×106个GFP-SC。在本步骤之前，GFP-SC均使用含血清的培养基。</li>
		<li>将GFP-SC置于冰上，直至移植时使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胸段第8节（T8）完全横断
<ol>
	<li>手术动物准备
	<ol>
		<li>通过腹腔注射氯胺酮（60 mg/kg&#160;体重）和赛拉嗪（5 mg/kg&#160;体重）对一只雌性Fischer大鼠（180–200&#160;g）进行麻醉。在进行下一步操作前，通过检查脚趾夹捏反应和眨眼反应来监测麻醉深度。</li>
		<li>使用电动剪刀剃除大鼠背部毛发，并用70%乙醇擦拭皮肤。在双眼涂抹眼用润滑剂。将动物转移至带有加热垫的手术台上，以维持体温在约37 oC。将动物置于一个卷状物上，使脊柱易于接触。 
		注意：该卷状物可由可灭菌的纸巾或2英寸×2英寸纱布制成。当需要将T7–T9节段平放在卷上时，建议使用较大的卷。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>T7至T9椎板切除术
	<ol>
		<li>定位T9–T11棘突的解剖标志。 
		注意：与其他节段相比，T9、T10和T11之间的间隙较小。将大鼠放置在卷上后，T9–T11棘突在皮肤下会呈现为一个小的三角形隆起。</li>
		<li>使用#10刀片沿T4至T11做一条4至5 cm长的正中皮肤切口。使用钝头弯剪在浅层脂肪层上做小切口，以分离脂肪组织。 
		注意：可使用其他类型的器械分离脂肪，但钝头弯剪是实现最有效且创伤最小的脂肪分离方法。</li>
		<li>使用#10刀片背面定位T7至T9棘突。用钝头镊子夹住约T4处的肌肉，并沿T6–T10椎体两侧的肌肉做切口。切口应尽可能靠近椎体，以形成清晰的开口并减少对动物的损伤。</li>
		<li>使用#10刀片切断T6与T7、T7与T8、T8与T9以及T9与T10之间的肌肉和韧带，从而分离T7至T9各个独立的棘突。</li>
		<li>使用咬骨钳清除T7至T9椎板上的肌肉和韧带组织。尽可能向外侧清除肌肉和韧带，直至T7至T9横突之间的间隙清晰可见。</li>
		<li>使用咬骨钳切除T9棘突。用钝头镊子夹住T8棘突并轻轻提起，使T9椎板在T9与T10棘突之间的小开口处抬高。</li>
		<li>从T9的开口处开始，使用咬骨钳向头侧方向切除椎板。尽可能向外侧切除椎板；椎板切除后应能观察到背根。</li>
		<li>椎板切除完成后，对T8和T7重复相同操作。 
		注意：在椎板切除过程中，应使用吸血棒清除血液，同时继续操作。若出现过多出血，可在出血部位放置压缩海绵，并滴加生理盐水以促进血液凝固。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>T8横断术
	<ol>
		<li>将牵开器放置于T7至T9周围。待所有椎板完全切除后，确认T7至T9横突之间的间隙清晰可见，尤其是T8节段。同时检查T7至T9两侧的骨质，确保无向外突出的骨碎片。 
		注意：T8处的间隙对于完成完全横断至关重要。应沿纵轴彻底清除椎体，以便于导管插入。</li>
		<li>使用斜角弹簧剪在T8上下方切断背根和腹根。向脊髓区域滴加生理盐水，并等待血液凝固。&#160; 
		注意：此步骤对于正确插入导管至关重要。</li>
		<li>将斜角弹簧剪置于T8横突间隙内的脊髓上方，进行一次切割，完全切断脊髓。在形成的2–2.5 mm缺损处填入一小块压缩泡沫，并立即向该区域滴加生理盐水。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 导管插入
<ol>
	<li>在等待离断的脊髓残端达到止血状态的同时，从1× PBS中取出导管。将吸水条切成细长条状，放入导管中以去除多余的PBS。检查预先切割的窗口是否已打开。</li>
	<li>使用细长的吸水条去除生理盐水和血液。用显微铲轻轻抬起脊髓的两个残端，确保充分分离。用显微铲轻轻抬起头侧残端，并将导管套入残端，使窗口朝向操作者。确保整个残端完全插入导管，并且无过量出血进入导管内。</li>
	<li>轻轻抬起尾侧残端，并将导管的另一端套在该残端上。确保整个残端完全插入，且窗口位于背侧表面（图2A）。</li>
</ol>
4. 施万细胞/可注射基质（参见材料表）的制备与注射
<ol>
	<li>在等待离断的神经束达到止血状态的同时，移除GFP-SC沉淀物（步骤1.2中制备）上方的培养基。用10 µl冷DMEM/F12重悬GFP-SCs。向细胞悬液中加入10 µl冷的可注射凝胶，通过反复吹打充分混匀。将GFP-SC/DMEM/F12/可注射基质混合物置于冰上保存，直至完成导管植入。</li>
	<li>确认背侧窗口已打开后（图2A），使用Western印迹加样枪头和微量移液器，将20 µl的GFP-SC/DMEM/F12/可注射基质混合物通过预先切好的窗口之一注入导管内46。若SC/DMEM/F12/可注射基质混合物填充过多，可用吸水纸条吸除多余部分。注射完成后关闭窗口；无需缝合（图2B）。</li>
</ol>
5. 伤口闭合与术后护理
<ol>
	<li>缝合肌肉层和浅层脂肪层。用70%乙醇清洁皮肤，然后使用伤口钉合器（e.g., 伤口夹）将皮肤闭合。将动物置于温度可控的孵育箱中，直至其恢复意识。随后将动物转移回笼中。提供带有长饲喂管的饮水，并将食物颗粒放置在垫料上以便取食。</li>
	<li>术后立即开始，皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg 体重），每日两次，连续3天，以减轻疼痛。术后立即开始，皮下注射庆大霉素（5 mg/kg 体重），每日一次，连续7天，以预防和减少感染。为维持水合状态，皮下注射乳酸林格液10 mL，每日两次，持续7天。</li>
	<li>每日手动排空膀胱两次，直至膀胱功能恢复。若发生膀胱感染，则皮下注射10 mL生理盐水，直至尿液变清。若两天内无改善，继续皮下注射庆大霉素（5 mg/kg 体重，每日一次），直至尿液变清。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

建立有效横断模型最关键的步骤是通过一到两次切割完全切断脊髓。在横断部位，头端与尾端脊髓残端之间应形成2-2.5 mm的间隙。若该间隙未出现，最可能的三个原因是：（1）背侧或腹侧神经根未被充分切除，（2）腹侧硬脊膜未被充分去除，和/或（3）动物在下方所垫卷轴上的体位未摆放正确。
为了在残端之间有效插入导管：（1）导管的直径应根据实验所用动物的物种和年龄进行适当选择；（2）必须充分向外侧去除椎板，直至能够观察到横突之间的间隙；（3）必须清除神经根；（4）导管插入残端之间应一次完成。若需多次尝试，可能导致残端水肿，进一步增加导管插入的难度，并造成额外损伤。
为了将GFP-SC/DMEM/F12/可注射基质有效引入导管中，请确保：（1）在将导管插入残端之间前，脊髓无出血。若导管插入残端之间后内部有液体，应使用一小块吸水尖头材料通过预切开的窗口将其吸除。（2）确保导管已良好套接在两端脊髓残端上，且（3）背侧预切开的窗口处于开放状态。注射20 µl的SC/可注射基质混合物应足以完全填充导管。预切开窗口处出现溢出是判断移植是否有效的良好指标...

脊髓损伤修复是一个复杂且具有挑战性的问题，需要采用联合治疗策略，例如结合使用细胞与生物材料，以在损伤部位为移植细胞的功能发挥和轴突再生提供有利的微环境。半横断1,2,3,4,5,6,7,8,9和完全横断10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22模型常被用于评估基于生物材料的桥接疗法的效果。使用半横断模型的优势在于，与完全横断相比，它能为桥接结构提供更高的稳定性。然而，在半横断模型中，由于存在未受损的残留组织，很难将轴突再生明确归因于所应用的治疗手段。完全横断模型是证明轴突再生最为严格的实验方法。
各种天然和合成材料已被研究用于作为可注射凝胶、用于挫伤或半横断模型的预制凝胶，或作为结构化导管用于半横断或完全横断模型（详见综述）23,24,25). 原位 可注射基质/干细胞混合物的凝胶化在移植物与宿主脊髓之间形成了更利于轴突穿过的界面26,27 与预凝胶基质/SC植入物相比5,18,19,28. 原位 凝胶化使基质能够顺应不规则的宿主界面，而更 rigid 的结构化导管或可塑性较差的预制凝胶则无法实现这一点。结构化导管通常可提供接触引导和植入稳定性，这与可注射基质形成对比。本文所述的实验方案介绍了一种外科手术操作，该操作结合了可注射基底膜基质的特性例如， 基质胶，参见 材料表， 称为可注射基质）和一种结构化导管，以在最严格的脊髓损伤模型中评估轴突再生。
电纺聚偏氟乙烯-三氟乙烯（PVDF-TrFE）取向纤维中空导管在本实验方法中被使用。PVDF-TrFE是一种压电聚合物，当受到机械形变时可产生瞬时电荷，已被证明可促进神经突延伸和轴突再生 体外29,30 和 体内31静电纺丝是一种常用的支架制备方法，可利用多种聚合物快速制备性能可控的纤维支架，其纤维取向、纤维直径及支架厚度等参数均可调控，适用于神经及其他领域的应用32,33,34.
大量研究已证明，将大鼠施万细胞（SCs）移植至脊髓损伤部位具有治疗效果5,9,18,19,20,21,26。这些移植细胞对损伤周围组织具有神经保护作用，可减小损伤空腔的体积，并促进轴突向损伤/移植区域再生以及新生轴突的髓鞘化。人类施万细胞可进行自体移植，相较于大多数其他神经相关细胞，这是一个显著优势24。通过外周神经活检后，可分离、纯化施万细胞，并扩增至适合人体移植的数量。自体施万细胞移植在脊髓损伤患者中的应用已被证实是安全的，相关研究已在伊朗35,36,37,38、中国39,40和美国41,42开展。已知施万细胞能够分泌多种对轴突生长至关重要的神经营养因子和细胞外基质蛋白，并在外周神经损伤后的轴突再生过程中发挥关键作用。本研究的目标是描述可用于评估导管设计的方法，以改善施万细胞移植在完全性大鼠脊髓横断模型中的治疗效果。

<table><tbody><tr><td>冻存管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>VWR</td><td>25382-428</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基：F-12 营养混合物）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11039-021</td><td>&quot;DMEM/F12&quot; 在方案中。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>&quot;Pen/Strep&quot; 在方案中。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH300-70-03</td><td>&quot;FBS&quot; 在方案中。</td></tr><tr><td>垂体提取物</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-215</td><td></td></tr><tr><td>佛司可林</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>396-HB/CF</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>&quot;PLL&quot; 在方案中。</td></tr><tr><td>Dulbecco 改良 Eagle 培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965-092</td><td>&quot;DMEM&quot; 在方案中。</td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170-112</td><td>&quot;HBSS&quot; 在方案中。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>雌性 Fischer 大鼠（160–180 g）</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>直头 Vannas 剪刀</td><td>FST</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Vedco Inc</td><td>5098976106</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Lloyd Inc</td><td>AnaSed</td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-010-02</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>微型刮铲</td><td>FST</td><td>10089-11</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>钝头弯剪</td><td>FST</td><td>14017-18</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td>FST</td><td>11006-12</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>咬骨钳</td><td>FST</td><td>16121-14</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>弯头弹簧剪</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>吸水棉片</td><td>FST</td><td>18105-03</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Henry Schein</td><td>9083300</td><td>&quot;压缩泡沫&quot; 在方案中。</td></tr><tr><td>#10 刀片</td><td>Sklar</td><td>06-3010</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>&quot;可注射基质&quot; 在方案中。</td></tr><tr><td>鸡抗绿色荧光蛋白抗体</td><td>Millipore</td><td>AB16901</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 RT97 杂交瘤抗体</td><td>DSHB</td><td>RT97</td><td></td></tr><tr><td>兔抗神经丝蛋白抗体</td><td>Encor Biotechnology, Inc</td><td>PRCA-NF-H</td><td></td></tr><tr><td>多克隆兔抗胶质纤维酸性蛋白抗体</td><td>Dako</td><td>Z033401</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记山羊抗鸡 IgG（H+L）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 标记山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21244</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记山羊抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>clsi</td><td></td></tr></tbody></table>

将雪旺细胞移植至聚偏氟乙烯-三氟乙烯导管内以桥接大鼠横断脊髓残端促进轴突再生跨越缺损

Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

在大鼠脊髓损伤的多种模型中，挫伤模型最为常用，因为它是人类脊髓损伤中最常见的类型。尽管完全横断模型在临床相关性上不如挫伤模型，但它却是评估轴突再生最严格的方法。在挫伤模型中，由于损伤后仍有部分组织残留，难以区分再生的轴突与出芽或幸存的轴突。而在完全横断模型中，必须采用桥接方法填充缺损，以建立从头端到尾端残端之间的连续性，从而评估治疗效果。可靠的桥接手术对于减少手术方法带来的变异性、准确测试结局指标至关重要。本文所述方案用于在移植前准备施万细胞（SCs）和导管，实施胸段第8节（T8）脊髓完全横断，插入导管，并将施万细胞移植入导管内。该方法还使用了 原位 可注射基底膜基质与干细胞移植相结合的凝胶化方法，可促进轴突在宿主组织头端和尾端界面处的生长。

采用该手术技术的目的是评估一种结构化导管与可注射基质在移植至完全横断的脊髓后，对施万细胞（SC）功能最大化的应用效果。移植后三周，用4%多聚甲醛灌注动物，大体解剖脊柱并用相同固定液再固定24小时。随后解剖出脊髓，将用于冰冻切片的样本置于30%蔗糖溶液中进行冷冻保护。另一组解剖脊髓中，从SC桥中间部位分离出1毫米厚的横截面，放入戊二醛固定液中以制备树脂切片。样品按照Bates et al.47详细描述的方案进行透射电镜制样。冰冻切片经以下一抗孵育：GFP、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、神经丝重链（RT97）和神经丝中链（NF），随后使用相应的二抗：羊抗鸡IgG-488、羊抗兔IgG-546、羊抗小鼠IgG-647和羊抗兔IgG-647。GFP标记的施万细胞（GFP-SCs）沿导管内部均匀分布（图3A；导管内壁以黄线标示）。观察到轴突再生现象（图3B），且再生轴突与GFP-SCs的存在密切相关...

本文介绍了一种技术：在脊髓完全横断后，将一个中空导管插入脊髓残端之间，并填充施万细胞（SCs）和可注射的基底膜基质，以桥接断端并促进轴突跨越缺损区域再生。

在大鼠脊髓损伤的多种模型中，挫伤模型最为常用，因为这种损伤类型在人类脊髓损伤中最为常见。

本手术干预程序的总体目标是利用填充有施万细胞和可注射基质的导管，在完全横断的脊髓残端之间建立桥接，以促进轴突通过该桥接区域再生。我们的目标是在大鼠中桥接脊髓损伤部位，以恢复其功能。我们所采用的损伤模型为制造完全横断性缺损。只有通过使用这种类型的损伤模型，当我们在损伤部位发现轴突时，才能确信轴突已经再生。我们所使用的桥接物是一种含有施万细胞的聚合物通道，而施万细胞对于轴突再生至关重要。本视频将展示如何将此类桥接物植入完全横断的损伤间隙中。初次接触该方法的研究人员需要进行练习，因为完全横断脊髓并植入导管对初学者而言可能具有挑战性。在开始操作前，使用10号刀片将导管切割为5毫米长。如需要，也可在解剖显微镜下完成此步骤。沿导管的纵边轻轻折叠，使用直刃Vannas剪刀在距离开口至少1毫米处、彼此相距约1毫米的位置剪出四个长约0.4毫米的小切口。然后将导管展开，沿同一侧的两个切口之间进行切割，形成两个并列的窗口，确保窗口能够沿未切割的一侧正常开合。进行T7-T9椎板切除术时，先确认麻醉后的180至200克雌性Fischer大鼠对足趾夹捏无反应，然后定位T9-T11棘突的解剖标志。通过皮肤可感觉到一个微小的三角形隆起。使用10号刀片，从T4至T11做一条4至5厘米长的正中线皮肤切口，随后用弯头钝头剪刀在浅层脂肪层上做一个小切口。分离脂肪组织后，使用10号刀片定位T7-T9棘突，并用钝头镊子在T4水平夹持肌肉。从T6到T10，在每侧椎骨旁尽可能贴近椎骨处切开肌肉，以形成清晰的术野并尽量减少对动物的损伤。将牵开器放置于T7至T9节段。使用10号刀片切开T6至T10各棘突之间的肌肉和韧带组织，并用咬骨钳尽可能向外侧清除T7至T9椎板上的肌肉和韧带。当T7至T9横突之间的间隙清晰可见时，使用咬骨钳切除T9棘突，同时用钝头镊子轻轻抬起T8棘突，以抬高T9与T10棘突间小开口处的T9椎板。随后，从该开口处开始，使用咬骨钳沿T9节段向头侧尽可能向外侧切除椎板。当所有椎板均被清除后，确认横突间的间隙清晰可见，尤其在T8节段，并检查T7至T9两侧骨面，确保无向外突出的骨碎片，此时背根应变得可见。使用斜面弹簧剪刀，在 T8 节段上方和下方切断背根和腹根，并向脊髓添加生理盐水以帮助止血。接着，将斜面弹簧剪刀置于 T8 节段横突间隙处的脊髓上方，进行一次切割，完全切断神经组织。将一小块压缩泡沫置入由此形成的 2 至 2.5 毫米的间隙中，并立即向该区域添加生理盐水。在等待离断的神经干残端达到止血状态的同时，将吸收性明胶海绵切成细长条状，并从 PBS 储存液中取出一根导管。将部分条状明胶海绵放入导管内，以去除多余的 PBS，并确认预先切割的窗口已打开。接着，移除 GFP 标记雪旺细胞沉淀物中的培养基，并将雪旺细胞重悬于 10 µL 冷的 DMEM/F-12 培养基中。加入10微升冷的可注射凝胶至细胞悬液中，通过反复吹打充分混匀。然后将细胞悬液置于冰上。当脊髓圆锥残端准备就绪后，移除压缩泡沫，再用较长的吸收三角条清除椎板切除区域的生理盐水和血液。然后，使用微型刮勺轻轻抬起吻端残端，将导管带窗口的一面朝上套入残端，注意确保整个残端完全插入导管内，且无过多血液渗入导管。轻轻抬起尾端残端，将导管的另一端套在其上，注意确保整个残端完全插入，并使窗口位于背侧表面。随后，使用配备Western blot加样头的微量移液器，通过预先切好的窗口之一向导管内注入20微升GFP标记的施万细胞可注射基质混合物，并闭合窗口。注意事项：必须尽快且小心地处理脐带残端。延迟可能导致残端肿胀，使导管难以套入脊髓，从而造成进一步损伤。移植后三周，冷冻切片的脊髓矢状组织经共聚焦荧光成像显示，雪旺细胞在导管内及沿导管均匀分布，且桥接区域中心可见血管及有髓轴突。轴突再生与雪旺细胞的存在密切相关，证实了在结构化导管内构建雪旺细胞桥可有效促进头端与尾端残端之间桥接区域的轴突再生。一旦掌握该技术，操作规范时可在45分钟内完成。完成此操作后，可进行其他方法，例如 EndoRay 示踪，以回答更多问题。例如，有多少轴突再生进入桥接区域，其中又有多少轴突从桥接区域延伸并重新进入脊髓？观看本视频后，您应能充分理解如何横断脊髓、植入导管，并在基质中注射细胞，以构建可靠的桥接结构，用于轴突再生及其他结果评估。

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科研

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Medicine

医学

氟 TrFE 导管内许旺细胞移植桥断大鼠脊髓残肢促进轴突再生跨越间隙

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取一只麻醉后右侧坐骨神经暴露且完整的实验大鼠，该神经支配后肢的运动和感觉功能。切除一段神经，形成缺损，切断神经元轴突，阻断信号传导。切断的远端轴突会退化，导致特化的神经修复细胞或施万细胞脱离。将一种带有微通道的柔软管状仿生导电神经支架缝合至神经两端切断处的外层——神经外膜上。在神经末端附近植入成对电极，并将导线穿过皮肤下方引至颈部后方。施加持续的电刺激，向支架输送温和的脉冲。来自变性远端的施万细胞迁移进入支架，并沿微通道排列。这些细胞释放生长因子，刺激轴突近端的延伸。当轴突延伸时，施万细胞以富含脂质的髓鞘膜包裹它们，从而恢复信号传导。这展示了支架和电刺激在神经修复中的潜力。...

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来源：Lee, Y., et.al. 将施万细胞移植至PVDF-TrFE导管内以桥接大鼠脊髓横断残端促进轴突再生。J. Vis. Exp.

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脊髓损伤是一种导致严重发病率和高死亡率的创伤性疾病。在本研究中，我们详细描述了一种小鼠脊髓损伤的挫伤模型，随后进行神经干细胞移植。...

脊髓损伤实验性挫伤模型中的神经干细胞移植

严重的脊髓损伤常导致组织缺损。本文描述了两种成功桥接此类缺损的方法，可通过在急性损伤后以及完全脊髓横断五周后植入机械微连接系统，促进大鼠的组织适应、再生反应及功能改善。...

急性与慢性损伤后修复脊髓大范围组织缺损的实验策略

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电穿孔是一种将目的基因有效导入细胞的方法。通过应用该技术 体内 在成年小鼠背根神经节（DRG）神经元上，我们描述了一种用于研究轴突再生的模型 体内.

研究哺乳动物轴突再生：体内电穿孔成年小鼠背根神经节

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原位主动脉移植：一种研究慢性血管病变发生的大鼠模型

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