Name: 主动脉环共培养法: 一种方便的工具, 可以评估骨髓间质细胞的血管生成潜能体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学习使用大鼠主动脉环共培养法评估骨髓间充质干细胞的血管生成潜能。该方法可在体外可视化MSC与内皮网络的相互作用，为再生医学和缺血性疾病细胞治疗研究提供可靠的定量功能检测工具。

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作者感谢以下工作人员和研究人员：Andrée Gauthier-Fisher、Matthew Librach、Tanya Barretto、Tharsan Velauthapillai 和 Sarah Laronde。

所有涉及动物的研究均按照ARRIVE指南进行并予以报告29所有研究均经机构研究伦理委员会批准（REB编号4276）。所有动物实验均经大学健康网络动物护理委员会（多伦多，加拿大）批准，所有动物均按照 实验动物护理和使用指南, 8th （美国国立卫生研究院，2011年版）
1. 主动脉环实验设置
<ol>
	<li>分离大鼠主动脉。
	<ol>
		<li>使用 CO2 窒息法处死 8–10 周龄的 Sprague-Dawley 大鼠：将 CO2 气室设置为 20% 气体置换率（流速 = 0.2 × 气室体积/分钟）。通过捏夹反射消失及触诊胸部无心跳来确认死亡。</li>
		<li>用含 70% 乙醇的无菌纱布润湿胸部区域的毛发。使用无菌镊子和剪刀沿胸部正中线切开皮肤和肌肉层。</li>
		<li>暴露肋骨后，在两侧距胸骨约 5 mm 处剪断肋骨并向上翻折。新鲜尸体中肋间动脉可能出现少量出血，属正常现象。</li>
		<li>将肺组织和心脏推向解剖学右侧，以暴露主动脉。主动脉为紧邻脊柱的一条白色血管。</li>
		<li>用镊子夹住主动脉弓远端部位，同时用手术剪在镊子夹持处进行首次剪切。一旦切断主动脉，胸腔将迅速充满血液，因此必须迅速操作，以在血液凝固前取出主动脉。</li>
		<li>用镊子夹住主动脉，轻轻自脊柱方向向下剥离。牵拉动作可自然切断肋间动脉，无需额外切口。获取长约 10 cm 的组织，或在主动脉进入腹腔分叉前将其完整取出。必要时可将膈肌向尾侧推移，以暴露主动脉下段。 
		注意：应轻柔剥离主动脉，用力过猛可能导致其撕裂。若发生撕裂，可等待数秒使血液凝固，并用纸巾清除凝血块，以便观察剩余的主动脉。</li>
		<li>将取出的主动脉置于含 10 mL 冰冷 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）的 15 mL 离心管中，该溶液需添加 1% 青霉素/链霉素（P/S）。将离心管置于冰上保存。 
		注意：主动脉组织在冰上可维持 1–2 小时，但应尽快处理以保证最佳状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌生物安全柜（BSC）中配制主动脉环实验培养基。
	<ol>
		<li>使用滤器过滤 500 mL 内皮基础培养基（EBM），该培养基需添加 2% 胎牛血清（FBS）、1% 庆大霉素及生长因子（见材料表），以制备内皮细胞生长培养基（EGM）。取 50 mL 过滤后的培养基置于 37 °C 恒温水浴或珠浴中预热。</li>
		<li>使用另一滤器过滤 100 mL 添加了 2% FBS 和 1% P/S 的 EBM，以制备 EBM 2% FBS（EBM-FBS），并储存于 4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在冰上操作，用基底膜提取物（BME）包被 12 孔细胞培养板。
	<ol>
		<li>将 12 孔板置于冷表面（如大冰袋或冰盘）上。使用预冷的移液枪头，每孔加入 200 µL 新鲜解冻的 BME，并轻轻摇晃使 BME 均匀覆盖孔底。操作需迅速，以避免 BME 聚合不均。 
		注意：一次典型的主动脉切除可获得约 20 个主动脉环。为减少主动脉环实验间的变异性，每个处理组至少设置三个重复，并包括对照组。若样本充足，建议每个处理组使用 6 个主动脉环。</li>
		<li>将包被好的培养板放入湿化培养箱（相对湿度 95%，37 °C，5% CO2；此后所有湿化培养箱步骤均采用此条件）中孵育 30 分钟。将 1,000 µL 移液枪头放回 -20 °C 冰箱，以备步骤 1.5.3 使用。 
		注意：尽管基底膜提取物使用原液浓度，其稠度和硬度严格依赖于聚合时间。务必确保所有平行组及独立实验的聚合时间完全一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将主动脉切成大小一致的环状片段。
	<ol>
		<li>从 15 mL 离心管中取出主动脉，放入含 10 mL 新鲜 HBSS（添加 1% P/S）的 10 cm 培养皿中。</li>
		<li>使用两把镊子小心去除多余的结缔组织和脂肪组织，并用手术刀切除与主动脉相连的残余肋间动脉分支。此举可减少因残留组织量不同而导致的环段间差异。同时清除主动脉腔内的凝血残留物。</li>
		<li>在 10 cm 培养皿下放置直尺或网格，使用无菌手术刀和镊子精确切割出 1–2 mm 宽的主动脉环。应尽可能保证切口一致，以降低样本间差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将主动脉环包埋于 BME 中。 
	注意：若在 BME 聚合孵育前尚未完成主动脉环切段，需将包被板从湿化培养箱中取出，每孔加入 100 µL EBM 以终止聚合反应。时间控制至关重要，BME 过度聚合可能影响内皮网络形成及细胞迁移。待主动脉环制备完成后，吸除孔中 EBM，继续执行步骤 1.5.2。
	<ol>
		<li>将 BME 包被的培养板从湿化培养箱中取出，返回生物安全柜。</li>
		<li>用镊子小心夹取单个主动脉环，将其置于每个 BME 包被孔的中央。对剩余主动脉环重复此操作。 
		注意：随主动脉环转移的液体应尽量减少，以避免干扰 BME 的正常聚合。</li>
		<li>使用预冷（-20 °C）的 1,000 µL 移液枪头，向每个主动脉环上方加入 300 µL BME，并均匀分布至孔底。</li>
		<li>将包埋好的主动脉环重新放回湿化培养箱中孵育 30 分钟。</li>
		<li>从湿化培养箱中取出含包埋主动脉环的培养板，缓慢加入 1,000 µL EGM（于步骤 1.2.1 中配制并预热），移液枪头应紧贴培养孔壁加入。 
		注意：直接将培养基滴加至 BME 表面可能破坏已聚合的基质，阻碍内皮网络的连续形成。如有条件，可使用多通道移液器。</li>
		<li>24 小时后，吸除 1,000 µL EGM，替换为 1,000 µL 步骤 1.2.2 中配制的 EBM-FBS，同样沿孔壁缓慢加入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每 48 小时更换 500 µL EBM-FBS，加入 500 µL 新鲜的 EBM-FBS（37 °C），以维持主动脉环实验的培养状态。 
	注意：参见第 2 节，建议在建立主动脉环实验的当天同步启动间充质干细胞（MSC）的扩增培养，以确保当内皮网络形成时，MSC 已准备好用于共培养。</li>
	<li>使用明场显微镜观察主动脉环实验中内皮网络的形成情况（可参考图 1 中所示的最佳网络发育状态）。当内皮网络形态达到图 2 所示状态时，即可开始建立主动脉环-MSC 共培养体系（见第 3 节）。有关内皮网络成像的更多细节，请参见步骤 4.1。</li>
</ol>
2. 组织培养
<ol>
	<li>配制组织培养基的储备液。
	<ol>
		<li>培养FTM HUCPVCs（先前已建立，每组≥3个独立细胞系）30 以及商品化的BMSCs，在添加了10% FBS和1% P/S的α-MEM中培养。</li>
		<li>使用孔径为 0.2 µm 的滤器瓶对培养基进行灭菌。</li>
		<li>将配制好的培养基溶液在 4 °C 下保存，最多可存放 3 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在加湿培养箱中培养FTM HUCPVC和BMSC细胞，根据相差显微镜观察结果，在细胞融合度达到70–80%时进行传代。根据所使用的组织培养皿的规格，使用适量的培养基。即 10 mL，置于10 cm培养皿中）。采用上述培养条件用于MSCs的维持和传代。</li>
	<li>使用解离酶溶液（4 mL/10 cm 培养皿）对MSC单层细胞进行解离，用于传代或主动脉环与MSC共培养实验，在湿润培养箱中孵育3分钟。通过明场显微镜观察确认细胞是否完全脱落；如未完全脱落，可额外孵育1–2分钟。</li>
	<li>将解离的细胞转移至15 mL离心管中，在400 x g下离心5分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，注意不要扰动细胞沉淀，然后将细胞重悬于1 mL适当的培养基中（传代细胞使用含血清的α-MEM完全培养基，主动脉环实验或MSC共培养使用EBM-FBS培养基），用于细胞计数仪计数。</li>
</ol>
3. 主动脉环实验/间充质干细胞共培养的制备
<ol>
	<li>在每个包埋的主动脉环上接种 104 个间充质干细胞（MSCs）（9,000 个细胞/cm2/12 孔板）。根据主动脉环实验的数量，使用可存活且不可转移的荧光染料对 MSCs 进行预染色。至少保留三个不含 MSCs 的主动脉环孔作为对照组。
	<ol>
		<li>将 2.5 µL 可存活且不可转移的荧光染料/mL 培养基（终浓度 5 µM）加入含 105 个 MSCs/mL EBM-FBS 培养基的 15 mL 离心管中，置于湿润培养箱中孵育 30 分钟。孵育至一半时间时轻轻混匀管内液体。</li>
		<li>孵育 30 分钟后，向染色细胞中加入等体积的新鲜 EBM-FBS 培养基，并在 400 × g 下离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL EBM-FBS 培养基中。使用荧光显微镜确认 MSCs 染色成功。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从湿润培养箱中取出含主动脉环的培养板，从每孔中移除 500 µL EBM-FBS 培养基。</li>
	<li>在 500 µL EBM-FBS 培养基中，小心地将 104 个 MSCs 均匀接种到每个包埋的主动脉环上，沿内皮网络周围均匀吹加。通过轻轻摇动培养板确保细胞分布均匀。
	<ol>
		<li>补充额外的 EBM-FBS 培养基，使主动脉环实验与 MSC 共培养体系的总培养基体积达到 1,000 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用荧光显微镜观察主动脉环实验中荧光标记的 MSCs。</li>
</ol>
4. 显微镜观察
<ol>
	<li>使用明场显微镜在主动脉环实验/间充质干细胞（MSC）共培养之前对大鼠内皮网络进行成像，以获取内皮网络特性的基线（第0天）测量数据（例如，网络长度、网络环数）。每个孔选取从主动脉环到该象限内皮网络最远区域的4个象限进行成像。
	<ol>
		<li>在主动脉环实验/MSC共培养的第3、5和7天，对主动脉环周围的内皮网络进行成像。利用这些图像量化MSC对内皮网络发育的影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用荧光显微镜对主动脉环实验中预先标记的MSC进行成像。
	<ol>
		<li>在主动脉环实验/MSC共培养24小时后，使用荧光显微镜观察MSC的归巢、伸长及其与内皮网络的整合情况。将MSC的荧光图像与内皮细胞的明场图像叠加，以观察两种细胞类型的共定位情况。</li>
		<li>对定位于靠近主动脉环组织处已形成的内皮网络中的MSC，以及定位于远离主动脉环组织的新形成网络中的MSC进行成像（图2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 流式细胞术和qPCR
<ol>
	<li>在解离主动脉环内皮网络的前一天，于 4 °C 过夜解冻冷冻的分散酶。第 5.3 节对于流式细胞术和 qPCR 实验完全相同。</li>
	<li>将 50 mL 分散酶和 50 mL 0.5% 胰蛋白酶在 37 °C 的珠浴或水浴中预热。</li>
	<li>从主动脉环实验/间充质干细胞（MSC）共培养体系中回收用于分析的细胞。
	<ol>
		<li>在进行主动脉环实验/MSC 共培养一周后，移除培养基，并向每个孔中缓慢加入 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），静置 3 分钟后吸除。重复该洗涤步骤两次。</li>
		<li>向每个孔中加入 800 µL 预热的分散酶，于湿润培养箱中孵育 15 分钟。</li>
		<li>将培养板从湿润培养箱中取出，通过移液（5–10 次）使分散酶悬浮以打碎基底膜提取物（BME），并将每孔内容物转移至独立的 15 mL 离心管中。</li>
		<li>使用新鲜的预热分散酶重复步骤 5.3.3，直至培养孔中无残留 BME。向分散酶-细胞悬液中加入等体积含 3% FBS 的 PBS 以灭活分散酶。使用移液枪头去除悬浮在细胞悬液中的主动脉环。</li>
		<li>以 400 × g 离心 5 分钟。小心移除上清液，每管中保留约 3 mL 细胞悬液。 
		注：可能无法观察到明显的固体沉淀，但细胞和 BME 仍存在。</li>
		<li>向细胞悬液中加入 3 mL 预热的 0.5% 胰蛋白酶，剧烈重悬细胞（通过移液 5–10 次）。将消化后的细胞溶液置于湿润培养箱中孵育 10 分钟。</li>
		<li>将胰蛋白酶处理的细胞悬液从湿润培养箱中取出，加入 6 mL 含 3% FBS 的 PBS 并轻轻重悬数次。以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>小心移除所有上清液，保留管底细胞沉淀，并将每管细胞重悬于 1 mL 含 3% FBS 的 PBS 中。</li>
		<li>使用 70 µm 细胞筛过滤 1 mL 细胞悬液，以去除聚集的细胞和残留的 BME。使用细胞计数仪对 1 mL 细胞悬液中的细胞进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于流式细胞术的细胞。
	<ol>
		<li>将细胞悬液（每 200 µL 含 3% FBS 的 PBS 中含 105 个细胞）与荧光标记的一抗（TRA-1-85、CD146、CD31，偶联 FITC 或 APC，工作浓度为 1:40）在 4 °C 避光孵育 30 分钟。 
		注：MSC 的流式细胞术方案由 Hong et al., 201328 优化。准确检测至少需要 10,000 个细胞。</li>
		<li>30 分钟孵育结束后，将细胞重悬于 2 mL 含 3% FBS 的 PBS 中，离心（400 × g，5 分钟）。</li>
		<li>将细胞在 4 °C 避光保存，并在 1 小时内完成流式细胞术分析（至少采集 1 × 104 个事件）。门控策略参见补充图 1。使用抗 TRA-1-85 抗体（APC 标记，浓度 1:40，溶于含 0.5% FBS 的 PBS）分选人源 MSC，并将分选后的细胞收集至 350 µL 细胞裂解液中用于后续 qPCR 分析。 
		注：裂解后的细胞可在 -80 °C 保存最长 3 个月，用于未来的 qPCR 分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于 qPCR 分析的细胞。
	<ol>
		<li>使用基于柱法的 RNA 提取试剂盒从裂解细胞中提取 RNA，并测定 RNA 浓度和质量。</li>
		<li>每 100 µL 反转录反应体系中，使用最多 5 µg RNA 制备 cDNA。若 RNA 产量较低（&#60; 10 ng/µL），需进行预扩增步骤。若使用的 RNA 量少于 100 ng，将导致较高的假阴性率。 
		注：cDNA 模板可在 -20 °C 保存长达 4 个月，用于后续分析。</li>
		<li>使用血管生成表达谱阵列进行 qPCR，检测基因表达变化。每反应使用 5 ng cDNA（40 个循环，退火/延伸温度为 60 °C）。以未分化的 MSC 来源的 cDNA 样品为对照，计算基因表达的倍数变化。同时运行适当的阴性对照（不含人源 MSC 的主动脉环样本）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 主动脉环实验/间充质干细胞共培养后网络形成量化分析
<ol>
	<li>下载成像软件（如 ImageJ）以及血管生成分析插件（Angiogenesis Analyzer plugin）31。</li>
	<li>导入所采集的内皮细胞网络图像，并使用该软件打开。</li>
	<li>根据所用显微镜的参数规格转换图像比例尺。</li>
	<li>使用直线工具测量网络的径向生长情况。</li>
	<li>利用细胞计数工具统计内皮细胞网络中的环状结构（应量化包含至少4条边的环）。</li>
	<li>如需进一步量化网络特性，可使用血管生成分析插件或其他类似插件分析主段数量、总段长度、网络总面积及节点数量；使用模糊掩膜工具（blurred mask tool）对主动脉环组织和空白区域进行模糊处理，以避免产生假阳性计算结果。</li>
	<li>将所得数值导入统计分析软件，并绘制主动脉环实验/间充质干细胞共培养后的内皮细胞网络特性图。</li>
</ol>

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Clifford L. Librach 博士是以下专利的共同持有人：从妊娠早期脐带组织中分离和使用细胞的方法。该专利于加拿大和澳大利亚获得授权。

建立成功的主动脉环与间充质干细胞（MSC）共培养实验包含几个关键阶段。首先，分离和切片主动脉时最重要的步骤包括：1）仅获取主动脉的胸段部分；2）仔细去除分支血管、结缔组织和脂肪组织；3）将主动脉切成厚度均匀的节段（约1 mm），以减少各次实验之间的变异性。其次，将主动脉环成功包埋于基底膜提取物（BME）中对该实验至关重要。如果BME未完全聚合或聚合不均匀，则包埋在其中的主动脉环将无法启动内皮出芽，或可能形成不连续的内皮网络。若BME聚合不充分，则实验结果不可靠，无法用于定量分析。第三，必须使用含有完整生长因子的内皮细胞培养基，以为主动脉环启动出芽提供必要的营养支持。一旦主动脉环开始血管出芽，接下来的关键步骤涉及待测细胞类型的处理。为此，需要成功预先标记MSC并将其加入正在出芽的主动脉环中。该环节有两个关键操作步骤：1）选择合适的接种时间：此时血管网络应处于发育阶段，尚未达到培养孔内过高的覆盖面积。若MSC未能及时加入，将难以准确量化其对血管网络发育的净效应；2）在加入前对MSC进行预标记：若MSC染色过强或长时间保留在沉淀中，会导致细胞聚集，从而影响其向内皮网络的归巢与整合。最后，只要设置了适当的对照组，血管网络的定量分析便可顺利实现。...

血管生成是一个复杂的过程，通过促进从已有血管系统中形成新的血管来改善并维持组织灌注1。该过程由促血管生成因子和抗血管生成因子共同进行严密调控，保持动态平衡。此系统中任何缺陷均可能导致血管维持或生长不足，从而引发严重缺血性疾病，包括心肌病、脑卒中和神经退行性疾病。然而，过度的血管发育则是癌症和炎症性疾病等病症的典型特征2。
开发旨在调控血管生成以实现理想组织再生的疗法具有重要意义。尽管已开展大量临床前和临床研究，但利用促血管生成因子和微小RNA刺激血管生成的尝试尚未达到预期效果3,4,5。其效应短暂的可能原因包括：促血管生成蛋白和核酸的存续时间有限，以及靶向生长因子的种类有限6,7。尽管可溶性促血管生成因子对启动血管生成至关重要，但脉管系统的维持及其功能依赖于周细胞和平滑肌细胞等支持性细胞类型8。目前，促血管生成治疗领域正在探索潜在的干细胞和祖细胞来源，这些细胞不仅可局部提供促血管生成因子，还能在物理上支持新生脉管系统，并具备自我更新能力，甚至可分化为内皮样细胞9,10。寻找能够满足上述功能需求的最佳促血管生成细胞类型，对于缺血组织的再生具有广阔前景。
为了成功地将潜在的细胞治疗手段转化为临床试验，临床前研究需要证明其有效性，并阐明其潜在的血管生成机制。尽管目前已建立多种血管生成检测方法，但该领域仍缺乏一种 &#34;金标准&#34; 体外 能够可靠评估潜在候选细胞类型功效的检测方法11,12,13。大多数 体外 血管生成实验（包括内皮细胞增殖、迁移和管形成实验）通常用于评估细胞或化合物对内皮细胞表型变化或分化为管状及网络结构的影响14,15尽管这些特征对血管生成至关重要，但 &#34;可翻译的&#34; 该检测还应评估：1）周细胞或平滑肌细胞等支持性细胞类型的增加或替代；2）细胞外基质和/或基底膜的加工处理；3）促进功能性微血管形成的有效性。 体内 血管生成模型，包括角膜分析法和Matrigel栓塞分析法，可重现独特的 体内 微环境，但在追踪移植细胞以观察其物理相互作用方面面临困难。此外，在 体内 模型中，在测试潜在的同种异体细胞治疗候选物时，可能发生异种免疫排斥反应16. 离体 血管生成模型，尤其是主动脉环实验，可提供：1）易于观察和定量管状结构，2）辅助支持细胞，3）来自宿主和人工补充的细胞外基质（ECM），4）排除炎症成分，以及 5）快速且低成本的建立试验体系17,18通常，主动脉环实验可用于检测小分子分泌蛋白、药理学试剂以及转基因啮齿类动物模型的促血管生成潜力。19,20,21.
间充质干细胞（MSCs）主要通过旁分泌介导的作用成为血管再生的有前景候选细胞22,23,24。研究表明，MSCs可分泌多种关键的促血管生成因子，包括血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）以及血管生成素-1（Ang-1）25,26。MSCs还能够识别并趋向缺血或炎症组织，但其确切机制仍在研究之中。越来越多的文献支持这一假说：大多数MSCs来源于血管周围细胞，共同表达周细胞标志物，并可发挥类似周细胞的功能27。人脐带血管周围细胞（HUCPVCs）是一类来源于人脐带血管周围区域的年轻MSCs来源。这类细胞代表了一群具有周细胞样特性的MSCs群体，已从早产（FTM）和足月分娩的脐带中成功分离并表征。FTM来源的HUCPVCs高表达周细胞标志物（如CD146和NG2），具有高增殖能力、多向分化潜能、免疫豁免特性，并表现出显著的旁分泌活性28。因此，FTM HUCPVCs是一类理想的候选细胞类型，可通过其类似周细胞的特性促进新生血管形成，从而推动受损组织的再生修复。
为了检测人源MSCs的促血管生成潜能及周细胞样特性，目前可用的血管生成检测方法极为有限，其中可在获得微血管结构发育定量数据的同时，研究阳性血管趋向性迁移（下文简称&#34;归巢&#34;）、细胞外基质（ECM）加工处理以及细胞类型间物理相互作用的形成。
在此，我们介绍一种描述主动脉环实验新应用的实验方案。将人源间充质干细胞（MSCs）与正在发育的大鼠主动脉来源的内皮细胞网络共培养，以评估其在管状结构形成、成熟及稳态维持中的作用。该版本的主动脉环实验可用于评估细胞治疗候选物向血管生成部位归巢的能力及其效力，检测其执行和介导细胞外基质（ECM）加工处理的功能，并通过建立类似周细胞的物理相互作用，参与内皮管状结构的发育。此外，还可定量分析MSCs对血管生成的总体效应 体外 内皮网络形成及细胞间相互作用的观察，我们还优化了从共培养体系中分离间充质干细胞（MSCs）的实验方案。通过流式细胞术和定量聚合酶链式反应（qPCR），可对共培养后MSCs的表型变化及基因表达进行表征。作为模型细胞类型，我们在主动脉环实验中比较了发育早期（产前）和晚期（成体）来源的人类MSCs，分别为胎盘绒毛膜动脉来源的HUCPVCs和骨髓来源的间充质干细胞（BMSC）。我们提出，主动脉环实验可用于研究任何具有物理支持功能的细胞类型在血管生成性再生应用中的血管生成潜能。

<table><tbody><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>用于FTM HUCPVC和BMSC培养基。</td></tr><tr><td>APC标记的抗人TRA-1-85抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB3195A</td><td>用于流式细胞术和细胞分选的人源特异性细胞标志物</td></tr><tr><td>基底膜提取物（BME）（Matrigel）</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>用于主动脉包埋</td></tr><tr><td>Bullet-kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>包含：庆大霉素/两性霉素-B&lt;br/&gt;（GA）、人表皮&lt;br/&gt;生长因子（hEGF）、血管&lt;br/&gt;内皮生长因子（VEGF）、R3-&lt;br/&gt;胰岛素样生长因子-1（R3-IGF-1）、&lt;br/&gt;抗坏血酸、氢化可的松、&lt;br/&gt;人成纤维细胞生长因子-β（hFGF-&amp;beta;）、肝素、胎牛血清&lt;br/&gt;（FBS）。用于制备EGM</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA染料</td><td>Thermo-fisher</td><td>C2925</td><td>用于MSCs染色，MSCs对绿色染料摄取效果最佳</td></tr><tr><td>CKX53培养显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>用于内皮网络发育的明场成像</td></tr><tr><td>Countess全自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>用于MSC培养、流式细胞术和qPCR的细胞计数</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td>用于解离主动脉环-MSC共培养物（使用前于37 &amp;deg;C预热）</td></tr><tr><td>一次性无菌手术刀</td><td>VWR</td><td>21909-654</td><td>用于主动脉切片</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS，1×，不含氯化钙和氯化镁</td></tr><tr><td>内皮基础培养基（EBM）</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>培养主动脉环实验-MSC共培养物所需的基础培养基（使用前于37 &amp;deg;C预热）。用于EGM和EBM-FBS的配制</td></tr><tr><td>70%乙醇，生物技术级</td><td>VWR</td><td>97064-768</td><td>用于表面消毒</td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>实验室自用荧光显微镜，用于追踪MSC迁移与整合</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）（Hyclone）</td><td>GE Healthcare</td><td>SH3039603</td><td>细胞培养基中的血清组分</td></tr><tr><td>FITC标记的抗CD31抗体</td><td>BD</td><td>558068</td><td>用于流式细胞术的人源内皮细胞标志物</td></tr><tr><td>FITC标记的抗CD146抗体</td><td>BD</td><td>560846</td><td>用于流式细胞术的人源周细胞标志物</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Almedic</td><td>7727-A10-704</td><td>用于处理大鼠组织。可使用任何类似的镊子</td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Life Technologies</td><td>14175-094</td><td>1×，不含氯化钙和氯化镁</td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026410</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>人血管生成RT2分析PCR阵列</td><td>Qiagen</td><td>PAHS-024Z</td><td>人源特异性，包含84个参与血管生成基因的引物。每个孔对应一个引物反应</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>开源图像处理软件。需安装血管生成分析插件</td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC实验平台。用于流式细胞术。</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>UHN SickKids FC实验平台。用于细胞分选。</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>缓冲液和细胞培养基中的抗生素组分</td></tr><tr><td>RNeasy Mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>用于RNA纯化。包含细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>RT&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;Easy第一链合成试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>330421</td><td>用于qPCR的cDNA制备</td></tr><tr><td>RT&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;PreAMP cDNA合成试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>330451</td><td>当RNA得率较低时用于cDNA预扩增</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>用于剪开皮肤、肌肉和主动脉</td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>VWR</td><td>3084</td><td>用于湿润和消毒胸部毛发</td></tr><tr><td>TrypleE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605036</td><td>MSC解离酶，使用前于37 &amp;deg;C预热</td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m孔径滤器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td>用于组织培养基的灭菌</td></tr><tr><td>0.25%胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>用于细胞解离，使用前于37 &amp;deg;C预热</td></tr><tr><td>10 cm组织培养皿</td><td>Corning</td><td>25382-428</td><td>用于主动脉清洗与切片以及MSC细胞培养</td></tr><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>Corning-Sigma Aldrich</td><td>CLS3513</td><td>用于建立主动脉环实验-MSC共培养体系</td></tr><tr><td>15 mL离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>用于常规组织培养操作</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m细胞筛</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>确保在流式细胞术或分选前获得单细胞悬液</td></tr></tbody></table>

主动脉环共培养实验：一种体外评估间充质基质细胞促血管生成潜能的便捷工具 in vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

血管生成是一个复杂且高度受调控的过程，负责提供并维持充足的组织灌注。血管系统维持不足或病理性结构异常可导致严重的缺血性疾病，而血管过度增生则与癌症和炎症性疾病相关。一种有前景的促血管生成治疗方法是利用促血管生成的细胞来源，这些细胞可为新生血管提供调控因子以及物理支持。
间充质基质细胞（MSCs）因其旁分泌效应以及对缺血或炎症组织的识别与归巢能力，被广泛研究作为血管再生的候选细胞。特别是孕早期人脐带血管周围细胞（FTM HUCPVCs），由于具有类似周细胞的特性、高增殖能力与多向分化潜能、免疫豁免特性以及显著的旁分泌功能，成为极具前景的候选细胞。为了有效评估潜在的促血管生成再生细胞，必须在可靠且 &#34;可翻译的&#34; 临床前实验。主动脉环实验是一种 离体 一种可轻松量化管状内皮结构、利用宿主提供的辅助支持细胞和细胞外基质（ECM）、排除炎症成分，且建立快速、成本低廉的血管生成模型。与传统方法相比，该模型具有显著优势。 体内 模型（例如角膜检测，Matrigel栓塞检测）；主动脉环检测可追踪施用的细胞并观察细胞间相互作用，同时避免异种免疫排斥。
我们介绍一种主动脉环实验的新应用方案，该方案在发育中的大鼠主动脉内皮网络与人源间充质干细胞（MSCs）共培养体系中进行。该实验可用于分析MSCs通过类似周细胞的物理相互作用对管状结构形成和发育的贡献，评估其主动迁移至血管生成位点的能力，以及检测其执行和介导细胞外基质（ECM）加工处理的功能。本方案还提供了MSCs在共培养后表型变化及基因表达改变的进一步信息。

建立主动脉环/间充质干细胞共培养实验的示意图流程见图1。主要步骤包括：大鼠主动脉的分离、主动脉环的切片与包埋、内皮细胞出芽及网络形成的监测，以及最终对间充质干细胞的标记与添加。内皮网络分析的时间线标明了共培养各阶段（第1、5和7天）可进行分析的时间窗口。附加说明以虚线框标出。
通过明场显微镜在主动脉环内皮细胞培养中识别结构上不同的区域，通常在主动脉环嵌入细胞外基质（ECM）后3-5天进行（图2）。无结构区域（图2A）表现为靠近主动脉组织直接邻近区域的高细胞增殖但低结构有序性。已形成的内皮网络（图2B）指具有高度结构有序性的区域，其中网络已完全建立，并主要由闭合环路构成，即使在添加间充质干细胞（MSCs）之前即已如此。...

本文介绍了一种主动脉环实验的新应用，其中预先标记的间充质细胞与大鼠主动脉来源的内皮网络共培养。该新方法可实现对间充质基质细胞（MSCs）归巢及其与内皮网络整合过程的可视化，对网络特性的定量分析，以及对MSC免疫表型和基因表达的评估。

主动脉环共培养实验：一种体外评估间充质基质细胞促血管生成潜能的便捷工具 In Vitro

血管生成是一个复杂且高度受调控的过程，负责提供并维持充足的组织灌注。血管系统发育不足……

本项临床前功能检测的总体目标是观察并定量评估用于再生治疗的间充质干细胞的促血管生成潜能。该方法有助于回答血管靶向再生医学领域中的一些关键问题，例如细胞治疗候选物的作用机制及其治疗效率。该技术的主要优势在于，它既提供了体内环境的关键要素，又具备体外检测所特有的可控性和易于评估的特点。这种新技术的应用前景可拓展至缺血性疾病的细胞治疗领域，因为目前该领域确实缺乏可靠且易于使用的功能检测方法。本实验操作将由本实验室的博士研究生 Farwah Iqbal 以及研究助理 Peter Szaraz 进行演示。在分离大鼠主动脉并根据文本方案配制培养基后，首先将12孔组织培养板置于冰袋等低温表面，然后对培养板进行包被处理。使用预冷的移液器，向板的每孔中加入 200 微升新鲜解冻的基底膜提取物（BME）。然后，为避免 BME 不均匀聚合，迅速轻轻摇晃，确保包被均匀。将包被好的板放入湿润培养箱中孵育 30 分钟。将1,000微升移液枪吸头放回-20摄氏度冰箱中。为减少因残留组织导致的血管环单位之间的差异，将主动脉置于含有10毫升新鲜HBSS的10厘米培养皿中，并使用两把镊子仔细分离多余的结缔组织和脂肪组织。使用手术剪分离与主动脉相连的肋间动脉的其余分支，并清除主动脉内部任何残留的凝血。将尺子或网格置于10厘米培养皿下方，使用无菌手术刀和镊子精确切割1至2毫米宽的主动脉组织段。从培养箱中取出包被有基底膜提取物（BME）的培养板后，用镊子小心夹取单个主动脉环，并将其放置在BME包被的孔板中央。使用预冷的1,000微升移液枪头，在每个主动脉环上方加入300微升BME，并均匀分布至孔内四周。当所有主动脉环均已嵌入后，将其放回加湿的培养箱中孵育30分钟。随后，在孵育结束后，将移液管枪头紧贴培养孔壁，缓慢加入1,000 µL预先配制好的内皮细胞生长培养基（EGM），以避免冲击组织。然后将组织孵育24小时。每48小时用含FBS的EGM更换培养基的同时，使用明场显微镜观察主动脉环内皮网络的发育情况。在使用明场显微镜对大鼠内皮网络进行基线成像后，准备主动脉环实验的MSC共培养体系，将10的4次方个MSC接种至每个包埋的主动脉环上。至少保留三个未接种MSC的主动脉环孔作为对照组。接下来，在主动脉环实验中观察荧光标记的间充质干细胞（MSCs）。在主动脉环实验共培养体系孵育24小时后，利用荧光显微镜观察MSC的归巢、伸长及其与内皮细胞网络的整合情况。将MSCs的荧光图像与内皮细胞的明场图像叠加，以观察两种细胞的共定位情况。在共培养的第3天、第5天和第7天，使用明场显微镜对主动脉环网络进行成像。利用这些图像量化间充质干细胞共培养对内皮网络发育的净效应。在主动脉环实验与间充质干细胞共培养一周后，移除培养基，并向每孔缓慢加入1毫升PBS。将共培养物孵育三分钟，然后移除缓冲液，并重复洗涤两次。每孔加入800微升

the-aortic-ring-co-culture-assay-convenient-tool-to-assess-angiogenic

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