从巨大单层囊泡中拉取膜纳米管

本纳米管拉伸方法的总体目标是定量研究特定目标蛋白与高度弯曲膜之间的相互作用。该方法有助于解答细胞膜生物学中的关键问题，例如内吞作用和细胞内转运。该技术使我们能够直接量化蛋白质如何结合弯曲膜，并反过来使其发生形变。

最初，该方法用于测量脂质膜的基本力学特性。近年来，该方法已被应用于阐明蛋白质与膜相互作用中的重要机制，特别是蛋白质对膜的塑形作用。首先直接从电形成室的铂丝上收集巨大的单层囊泡。

构建实验腔室时，将两块矩形玻璃盖玻片放置在金属基底上，两者相距一毫米，并在长边方向留出足够大的开口，以便玻璃微吸管尖端能够至少伸入腔室中心。用浓度为每毫升五毫克的高纯度β-酪蛋白溶液填充实验腔室和玻璃微吸管，注意避免产生气泡。在腔室进行钝化的同时，将其安装到位于物镜上方中央的光学显微镜上，并将微吸管尖端从长边的开口插入，直至尖端位于物镜上方。

调节水箱液面，使抽吸压力接近零，并用含有目标分子的实验缓冲液（在适当的实验浓度下）填充注射微毛细管。将注射微毛细管安装到显微操作器中，并从实验腔室的另一侧插入微毛细管。孵育结束后，从腔室中移除β-酪蛋白溶液，并用实验缓冲液多次冲洗腔室。

然后，向腔室中加入数微升囊泡溶液，再加入数微升包被链霉亲和素的微珠，使微珠终浓度为每体积0.1 × 10⁻³%或更低。待囊泡和微珠沉降至腔室底部后，让实验缓冲液蒸发约15分钟，此时在光学显微镜下应可观察到囊泡明显波动。当囊泡达到适当柔软状态时，将单个囊泡吸入微移液管中，直至管内膜的长度等于或大于移液管半径。

当确定了合适尺寸的吸液尖端后，用石蜡油密封腔室的开口边缘。为设定吸液压力的零点位置，将吸液移液管末端置于微珠附近，并调节水箱高度，使微珠既不被吸入也不被吹离移液管。调节水位高度对于控制微移液管所吸持囊泡的膜张力至关重要。

吸取一个囊泡，并将微移液管向上移动至视野外，注意不要折断微移液管。使用光镊在距离腔室底部约20微米处捕获一个微珠。将囊泡移回视野，使其远离微珠并与光镊对齐，记录微珠在一到两分钟内的运动，以测量其平衡位置。

尽可能降低微移液管内的压力，但避免丢失囊泡，以减小膜张力，并小心地将囊泡与微珠接触约一秒钟，以形成链霉亲和素-生物素键。然后，使用压电驱动器轻柔地将囊泡拉回，形成纳米管。增加吸液压力以重新形成吸液舌，并将纳米管与吸液移液管的轴线对齐。

将试管和囊泡完全调至焦点，并在明场显微镜下以30赫兹的采集速度记录微珠的运动，同时记录水箱高度相对于零位置的变化，持续数分钟。当所有图像采集完成后，在不同的吸液压力和膜张力条件下再次记录微珠的运动。如需注入目标蛋白或分子，将注射用微移液管靠近纳米管，注意避免扰动光镊中的微珠，并在1至2帕斯卡的压力下缓慢注入蛋白。

在蛋白质结合达到平衡后，按照裸膜的实验方法，在加入蛋白质的情况下重复逐步测量。从100% DOPC囊泡中拉出的纳米管的力和半径测量相互独立，因为力是通过光镊中微球的位移来测量，而半径则通过荧光强度确定，从而提供了两种计算膜弯曲刚度的方法。BAR蛋白或钾离子通道蛋白在膜管上的相对富集程度高于其下方的囊泡，表明这些蛋白质更倾向于结合弯曲的膜结构。

事实上，N-BAR 蛋白 endophilin A2 与膜的结合会逐渐将管状结构的拉力降低至零，表明形成了一个三维支架，从而维持管状结构的稳定。在此实验流程基础上，可结合其他技术以回答更多科学问题，例如采用高分辨率显微镜检测膜管上蛋白质的排列组织，或利用单颗粒追踪技术测量蛋白质的运动性。