Name: 从巨 Unilamellar 泡中提取膜纳米管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 了解从巨型单层囊泡中提取膜纳米管的方法，用于研究蛋白质与弯曲膜的相互作用。该技术可量化蛋白质结合特性，揭示内吞作用和细胞内运输的机制。

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作者感谢 Benoit Sorre、Damien Cuvelier、Pierre Nassoy、François Quemeneur 和 Gil Toombes 为在本课题组建立纳米管方法所做出的重要贡献。P.B. 课题组隶属于法国国家科学研究中心（CNRS）的 CellTiss 联盟、CelTisPhyBio 实验室卓越计划（ANR-11-LABX0038）以及巴黎科学与文学大学（Paris Sciences et Lettres，ANR-10-IDEX-0001-02）。F.-C. Tsai 的研究得到了欧洲分子生物学组织（EMBO）长期博士后奖学金（ALTF 1527-2014）和玛丽·居里行动计划（Marie Curie actions，H2020-MSCA-IF-2014，项目 membrane-ezrin-actin）的资助。M.S. 是西蒙斯研究员学会（Simons Society of Fellows）的青年研究员。

作者无任何利益冲突需要披露。

通过从GUVs中拉出膜管的方法，可以获取关于膜-蛋白系统的丰富信息，因为该方法不仅能用于测量膜的基本力学特性，还有助于揭示蛋白质与膜曲率之间的耦合作用。如引言中所述，已有其他技术可用于测量膜弯曲蛋白的影响，例如将蛋白质与固定在钝化表面上的亚微米脂质体共同孵育18,19，或通过向微管吸吮的GUVs中注入蛋白质后观察膜管的自发形成20,21。本文所述方法不仅与内吞作用具有直接的几何关联，而且独特之处在于可同时提供系统的重要物理参数测量结果，例如蛋白质密度、膜张力和膜作用力。
该方法的一个重要局限性在于，构建和校准实验所涉及的所有组件并非易事。然而，尽管共聚焦显微镜、光镊和微操作系统的组合能够提供最丰富的信息，但根据所需获取的系统信息，某些组件可如引言中所述进行替代。成功探测一种蛋白质或任何其他潜在的曲率耦合分子的曲率耦合特性所需的最低限度组件包括一个微吸...

许多细胞过程，例如内吞作用、转运、丝状伪足的形成、感染等 等等。伴随着细胞膜形态的显著变化1,2在细胞内，多种蛋白质通过与膜结合并改变其自身形状来参与这些过程。其中最典型的例子是 Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) 蛋白家族成员，其含有一个特征性的内在弯曲的 BAR 结构域。3,4,5,6,7通常，它们通过将BAR结构域粘附到膜表面，并在许多情况下将两亲性螺旋浅插入双分子层来与膜相互作用。BAR结构域的形状、大小和电荷，以及两亲性螺旋的数量共同决定了：（1）膜曲率的方向即，无论它们会诱导膜内陷还是外凸）以及（2）膜曲率的大小5,8值得注意的是，此处正曲率定义为弯曲膜的凸面一侧， 即，朝向相互作用粒子的凸起部分为正，否则为负。此外，对BAR蛋白的定量研究表明，其对膜的影响取决于一组物理参数：蛋白质的表面密度、膜张力以及膜的形状（平坦） 与 管状的 与 球形7根据这些参数，BAR 蛋白可以：（1）作为膜曲率的感应器，（2）弯曲膜结构，或（3）诱导膜断裂7.
由于细胞中参与膜重塑的组分数量众多，研究内吞等现象的定量特征 体内 极具挑战性。 体外 重建模拟细胞中弯曲膜的最小组分，为深入理解膜曲率蛋白的作用机制提供了途径。本文介绍了一种重建膜纳米管的实验方案。 体外 使用显微操作、共聚焦显微镜和光镊技术。该方法可用于定量研究蛋白质、脂质或小分子如何与弯曲膜相互作用。脂质大单层囊泡（GUVs）被用作细胞膜模型，其曲率相对于相互作用的膜弯曲分子的尺寸可忽略不计。这些囊泡通过电形成法制备。9 其中囊泡通过在交流电（AC）作用下水合脂质膜并使其溶胀形成GUVs10最常见的用于制备GUV的基底是涂有氧化铟锡（ITO）的半导体板或铂丝（Pt-wires）。11在此项工作中，GUV 在铂丝上生长，因为与替代方法相比，该方法在缓冲液含有盐类时制备 GUV 的效果显著更优。12尽管本文已对电形成法的操作流程进行了足够详细的描述以供重复实验，但我们建议读者参考以往的文献，其中对类似及其他制备GUVs的方法已有详尽描述。13,14在我们实验室的操作中，采用铂丝进行电形成法已成功在含有约100 mM NaCl的缓冲液中，由合成脂质混合物或天然脂质提取物制备出GUVs。此外，在GUVs生长过程中还可实现蛋白质的包封。一种典型的电形成装置如图所示 图1A；它由两根长约10厘米的铂丝组成，插入一个由聚四氟乙烯（PTFE）制成的 holder 中，两侧可用玻璃盖玻片密封，盖玻片间距约为1–2厘米（图1A).
<img alt="用于蛋白质分析与分离的电泳装置，配备微量移液器和光谱系统。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：实验装置 (A) 带有连接至铂丝的电极接头的GUV电形成腔室。B左侧：实验系统示意图，显示显微镜、物镜上方的实验腔室，以及连接在显微操作器上并插入实验腔室中的两根微玻璃针（左侧和右侧），用于管状结构拉制和蛋白质注射。右侧：安装在物镜上方的实验腔室的近距离视图，显示插入的吸液和注射微玻璃针的尖端。C) 一支注射器，其后端插入微量移液器中，并配备一个细小的分配器。底部为微量移液器内部分配器的特写图，蓝色虚线标示出微量移液器的轮廓。该系统用于向微量移液器中填充酪蛋白，以钝化玻璃表面，必要时也可用于反向填充矿物油。D用于吸取的系统 µL 蛋白溶液的用量。针头连接注射器和导管，导管再连接至注射移液毛细管。将移液毛细管尖端小心浸入蛋白溶液中，并进行抽吸，使溶液充满毛细管尖端。然后使用图C所示系统，用矿物油从后端填充移液毛细管。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
膜纳米管的半径范围从7 nm到数百nm不等，可通过外力从GUV上拉出。该方法最初设计用于测量细胞膜和囊泡的弹性性质，例如弯曲刚度。15,16在最近的多数研究中，该方法已扩展用于研究蛋白质与弯曲膜的相互作用，通过将蛋白质微量注射至拉出的纳米管附近实现。7,17. 研究膜弯曲蛋白的其他方法也已开发出来。其中一种方法是将蛋白质与固定在钝化表面上的不同尺寸脂质体共同孵育。通过共聚焦显微镜测量蛋白质结合量随脂质体直径的变化，从而反映由曲率诱导的蛋白分选效应18,19在另一种方法中，将蛋白质注射到微吸管吸附的GUV附近，以检测其自发诱导形成管状结构的能力20,21本方案所述方法特别适用于研究参与内吞作用的膜弯曲蛋白，因为在内吞过程中，大多数蛋白质通常会遇到预先形成的膜纳米管，这些纳米管连接着含有货物的膜凹陷区域与下方平坦的质膜。此外，与使用固定小脂质体的检测方法不同，本方法中的膜纳米管持续与膜相连，因此其与GUV处于力学平衡状态，这种情况符合预期 体内因此，基本的膜物理原理适用，我们可以从测量结果中推断出大量的力学性质22,23,24.
要完整实施本方法，所需的设备包括共聚焦显微镜、光镊以及一个或两个连接至水箱的微移液管（图1B）。通过结合这三种技术，可同时测量膜张力、膜曲率、膜蛋白表面密度以及纳米管受力25。微移液管抽吸是必不可少的步骤，可通过将玻璃微移液管插入连接至水箱的持针器中实现，利用静水压来控制抽吸压力26。微移液管及其持针器由显微操作仪控制，理想情况下在单一方向上使用压电驱动器以实现精确移动。为拉出纳米管，先将微抽吸的GUV短暂黏附于一个微米级小球上，然后将其拉离以形成纳米管。在此实施方案中，小球由光镊固定，光镊可依据已发表的方案构建27。也可不使用光镊而采用其他方式拉取纳米管，但会牺牲力的精确测量。若构建光阱存在困难，或无需进行力的测量（例如仅需检测蛋白质对弯曲膜的偏好性），则可使用第二个微移液管尖端抽吸的小球来拉取纳米管28。此外，也可利用重力29或流体剪切力30,31来拉取纳米管。共聚焦显微镜同样并非绝对必需，但因其可用于测量蛋白表面密度而被优先选用。它还可通过检测纳米管中脂质的荧光强度来测定纳米管半径，从而独立于膜受力与张力进行测量。当由于膜结合蛋白的存在导致相关物理量之间的关系偏离已确立的方程时，通过荧光推断纳米管半径尤为重要25。需要特别注意的是，不能同时省略光阱和共聚焦显微镜，否则将无法测量纳米管的曲率。
本方案所述方法已用于研究各种外周膜蛋白在纳米管上的曲率诱导分选，主要是BAR家族蛋白25,32,33,34还发现，呈圆锥形的跨膜钾离子通道KvAP与BAR蛋白一样，在弯曲的纳米管上富集。35通过优化将蛋白质包裹在GUVs内的方法，近期也对蛋白质与负曲率之间的相互作用进行了研究36此外，该方法已被用于阐明蛋白质支架的形成机制。25,37 并研究由线张力介导的膜断裂机制38蛋白动力蛋白39，或由 BAR 蛋白40,41除了蛋白质外，小分子或离子也能诱导膜曲率。利用该方法，在无盐条件下证实钙离子可诱导正曲率。42有趣的是，已有研究表明，脂质也能发生曲率分选，但仅限于接近相分离临界点的组分。43,44总之，该方法可供致力于研究整膜组分如何发挥作用的研究人员使用（例如，脂质或跨膜蛋白）或外周结合分子（位于GUV内部或外部）从力学和定量角度与柱面曲率膜的相互作用。也适用于对测量膜本身力学性质感兴趣的研究者22,23,45.

<table><tbody><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>图3数据中使用的示例脂质</td></tr><tr><td>1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[生物素基-聚乙二醇-2000] [DSPE-PEG(2000)-生物素]</td><td>Avanti</td><td>880129</td><td>生物素化脂质</td></tr><tr><td>BODIPY-TR-C5-神经酰胺</td><td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td><td>D7540</td><td>荧光脂质</td></tr><tr><td>BODIPY-FL C5-十六酰基磷脂酰胆碱（HPC*）</td><td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td><td></td><td>用于蛋白质密度校准的荧光脂质</td></tr><tr><td>鸡蛋L-&amp;alpha;-磷脂酰胆碱（eggPC）</td><td>Avanti</td><td>840051</td><td>用于校准管半径常数</td></tr><tr><td>牛乳&amp;beta;-酪蛋白（&gt;99%）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td>用于钝化微移液管和实验腔室</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>D(+)葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>渗透压计</td><td>Loser</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>铂丝，直径0.5 mm，纯度99.99%</td><td>Goodfellow USA</td><td>PT005139</td><td>用于GUV电形成</td></tr><tr><td>函数发生器</td><td></td><td>n/a</td><td>用于产生GUV电形成所需的电流</td></tr><tr><td>密封腻子</td><td>Vitrex (来自CML France)</td><td>CRIT 140013</td><td>用于密封电形成腔室</td></tr><tr><td>水浴超声仪</td><td></td><td>n/a</td><td>有助于清洁电形成腔室，但非关键</td></tr><tr><td>Nikon TE2000倒置显微镜，eC1共聚焦系统（Nikon），配备两条激光线（&amp;lambda; = 488 nm 和 543 nm）；由5 W镱光纤连续波激光器（&amp;lambda; &gt; 1070 nm；IPG GmBH Germany）诱导的光镊系统</td><td></td><td></td><td>一种配备光镊的共聚焦显微系统的示例</td></tr><tr><td>微操纵器</td><td></td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管（内径和外径分别为0.78 mm和1 mm）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0036</td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2100</td><td></td></tr><tr><td>微加工仪</td><td>Narishige</td><td>MF-800</td><td></td></tr><tr><td>压电驱动器</td><td>Physik Instrumente</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯链霉亲和素包被微球（直径3.2 &amp;micro;m）</td><td>Spherotech</td><td>SVP-30-5</td><td></td></tr></tbody></table>

从巨大单层囊泡中拉取膜纳米管

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

细胞膜的重塑是许多细胞现象的重要组成部分，例如内吞作用、囊泡运输以及丝状伪足的形成 等等许多不同的蛋白质由于能够感知或诱导膜曲率而与弯曲的膜结合。通常，这些过程涉及多种蛋白质，使得在细胞内对其进行定量研究过于复杂。本文描述了一种重建弯曲膜的实验方案。 体外模拟弯曲的细胞结构，例如内吞作用颈部。使用 giant unilamellar vesicle（GUV）作为细胞膜模型，通过微管吸吮技术控制其内部压力和表面张力。利用光镊在 GUV 上施加点拉力，可形成一个高曲率的纳米管，连接于平坦的膜结构。该方法传统上用于测量脂质膜的基本力学性质，例如弯曲刚度。近年来，该技术已扩展至研究蛋白质如何与膜曲率相互作用，以及它们如何影响膜的形态与力学特性。结合微操作、显微注射、光镊与共聚焦显微镜的系统，可同时测量膜曲率、膜张力以及膜上蛋白质的表面密度。基于这些测量结果，可推断出蛋白质-膜系统多种重要的力学与形态学特性。此外，我们还提供了在生理盐浓度条件下制备 GUV 的实验方案，以及通过标记的蛋白质和脂质的荧光强度定量膜上蛋白质表面密度的方法。

拉管实验可提供关于膜的重要力学信息。在不存在与膜曲率耦合的蛋白质或其他分子的情况下，可通过将Canham-Helfrich哈密顿方程应用于从GUV中拉出的管状结构，建立膜力、管半径与膜张力之间的关系50,51
<img alt="力平衡方程，\( \mathscr{F} = \frac{\kappa}{2} \left( \frac{1}{r} - \frac{1}{R_0} \right)^2 A + \sigma A - f L \) 公式。" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq3v6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 3"> （方程 1）
<p class="jove_c...

细胞中有许多蛋白质能够感知并诱导膜曲率。本文介绍一种从脂质囊泡中拉取膜纳米管的方法，用于研究蛋白质或任何具有曲率活性的分子与弯曲膜之间的相互作用 体外.

细胞膜的重塑是许多细胞现象的重要组成部分，例如内吞作用、囊泡运输、丝状伪足的形成等。许多……

本纳米管拉伸方法的总体目标是定量研究特定目标蛋白与高度弯曲膜之间的相互作用。该方法有助于解答细胞膜生物学中的关键问题，例如内吞作用和细胞内转运。该技术使我们能够直接量化蛋白质如何结合弯曲膜，并反过来使其发生形变。最初，该方法用于测量脂质膜的基本力学特性。近年来，该方法已被应用于阐明蛋白质与膜相互作用中的重要机制，特别是蛋白质对膜的塑形作用。首先直接从电形成室的铂丝上收集巨大的单层囊泡。构建实验腔室时，将两块矩形玻璃盖玻片放置在金属基底上，两者相距一毫米，并在长边方向留出足够大的开口，以便玻璃微吸管尖端能够至少伸入腔室中心。用浓度为每毫升五毫克的高纯度β-酪蛋白溶液填充实验腔室和玻璃微吸管，注意避免产生气泡。在腔室进行钝化的同时，将其安装到位于物镜上方中央的光学显微镜上，并将微吸管尖端从长边的开口插入，直至尖端位于物镜上方。调节水箱液面，使抽吸压力接近零，并用含有目标分子的实验缓冲液（在适当的实验浓度下）填充注射微毛细管。将注射微毛细管安装到显微操作器中，并从实验腔室的另一侧插入微毛细管。孵育结束后，从腔室中移除β-酪蛋白溶液，并用实验缓冲液多次冲洗腔室。然后，向腔室中加入数微升囊泡溶液，再加入数微升包被链霉亲和素的微珠，使微珠终浓度为每体积0.1 × 10⁻³%或更低。待囊泡和微珠沉降至腔室底部后，让实验缓冲液蒸发约15分钟，此时在光学显微镜下应可观察到囊泡明显波动。当囊泡达到适当柔软状态时，将单个囊泡吸入微移液管中，直至管内膜的长度等于或大于移液管半径。当确定了合适尺寸的吸液尖端后，用石蜡油密封腔室的开口边缘。为设定吸液压力的零点位置，将吸液移液管末端置于微珠附近，并调节水箱高度，使微珠既不被吸入也不被吹离移液管。调节水位高度对于控制微移液管所吸持囊泡的膜张力至关重要。吸取一个囊泡，并将微移液管向上移动至视野外，注意不要折断微移液管。使用光镊在距离腔室底部约20微米处捕获一个微珠。将囊泡移回视野，使其远离微珠并与光镊对齐，记录微珠在一到两分钟内的运动，以测量其平衡位置。尽可能降低微移液管内的压力，但避免丢失囊泡，以减小膜张力，并小心地将囊泡与微珠接触约一秒钟，以形成链霉亲和素-生物素键。然后，使用压电驱动器轻柔地将囊泡拉回，形成纳米管。增加吸液压力以重新形成吸液舌，并将纳米管与吸液移液管的轴线对齐。将试管和囊泡完全调至焦点，并在明场显微镜下以30赫兹的采集速度记录微珠的运动，同时记录水箱高度相对于零位置的变化，持续数分钟。当所有图像采集完成后，在不同的吸液压力和膜张力条件下再次记录微珠的运动。如需注入目标蛋白或分子，将注射用微移液管靠近纳米管，注意避免扰动光镊中的微珠，并在1至2帕斯卡的压力下缓慢注入蛋白。在蛋白质结合达到平衡后，按照裸膜的实验方法，在加入蛋白质的情况下重复逐步测量。从100% DOPC囊泡中拉出的纳米管的力和半径测量相互独立，因为力是通过光镊中微球的位移来测量，而半径则通过荧光强度确定，从而提供了两种计算膜弯曲刚度的方法。BAR蛋白或钾离子通道蛋白在膜管上的相对富集程度高于其下方的囊泡，表明这些蛋白质更倾向于结合弯曲的膜结构。事实上，N-BAR 蛋白 endophilin A2 与膜的结合会逐渐将管状结构的拉力降低至零，表明形成了一个三维支架，从而维持管状结构的稳定。在此实验流程基础上，可结合其他技术以回答更多科学问题，例如采用高分辨率显微镜检测膜管上蛋白质的排列组织，或利用单颗粒追踪技术测量蛋白质的运动性。

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从巨 Unilamellar 泡中提取膜纳米管

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关于相分离巨型单层囊泡（GUVs）的实验常常忽略了生理溶液条件。本研究提出了一种方法，用于探究高盐缓冲液对带电多组分GUVs中液-液相分离的影响，该影响随跨膜溶液不对称性和温度的变化而变化。...

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