Name: 神经肽 Y-pHluorin 的共焦成像: 一种完整的小鼠和人胰岛胰岛素颗粒胞的可视化技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学习利用共聚焦显微镜和pHluorin技术实时可视化完整小鼠和人胰岛中的胰岛素颗粒胞吐过程。该方法有助于深入理解胰岛素分泌的调控机制，为糖尿病研究提供重要的生理学见解。

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作者感谢DRI影像核心设施的Marcia Boulina在显微镜使用方面提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为1K01DK111757-01（JA）、F31668418（MM）、R01 DK111538、R33 ES025673 和 R56 DK084321（AC）。

迈阿密大学动物伦理委员会已批准所有实验。
1. 完整分离的人或小鼠胰岛的病毒感染
<ol>
	<li>胰岛培养：配制胰岛培养基：CMRL 1066 培养基，含 10% (v/v) 胎牛血清（FBS）和 2 mM L-谷氨酰胺。
	<ol>
		<li>人胰腺胰岛来自美国国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK, NIH）的整合胰岛分配计划（Integrated Islet Distribution Program）。收到胰岛后，将约 500 个胰岛当量（islet equivalents）转移至 35 mm 非组织培养处理的培养皿中，加入 2 mL CMRL 培养基，在 37 °C、5%/95% CO2/O2 条件下培养 24 小时，之后进行病毒感染。</li>
		<li>小鼠胰腺胰岛可通过先前建立的方案进行分离16。分离后，将约 200 个胰岛当量置于 35 mm 非组织培养处理的培养皿中，加入 2 mL CMRL 培养基，在 37 °C、5%/95% CO2/O2 条件下培养 24 小时，之后进行病毒感染。 
		注意：避免使用在胰岛中表达 GFP 或 YFP 报告基因的转基因小鼠，以防与 NPY-pHluorin 的荧光信号重叠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒制备 
	注意：NPY-pHluorin 融合基因已克隆至 pcDNA3 载体10，并亚克隆至腺病毒载体中，由重组腺病毒生产公司制备腺病毒 [腺病毒血清型 5 (DE1/E3)]。病毒分装后储存于 -80 °C。病毒原液由公司提供，滴度为 1012 至 1013 病毒颗粒（约 3 × 1010 - 3 × 1011 PFU）。
	<ol>
		<li>用于体外（in vitro）胰岛感染时，使用 106 PFU/mL，可获得约 2 的感染复数（MOI）（详见讨论部分）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胰腺胰岛的病毒感染 
	警告：操作腺病毒需遵循生物安全二级（BSL2）标准程序，并具备相应资质。请咨询所在机构的生物安全负责人，获取关于 BSL2 操作的指导和培训。
	<ol>
		<li>按上述方法准备人或小鼠胰岛。</li>
		<li>向每个含有 2 mL CMRL 培养基（含 10% FBS 和 2 mM L-谷氨酰胺）的 35 mm 培养皿中加入 5 - 10 µL 病毒原液。 
		注意：根据公司提供的病毒滴度数据表，调整所用病毒体积。</li>
		<li>将胰岛在含病毒的培养基中于 37 °C、5% CO2 条件下继续培养 24 小时。</li>
		<li>24 小时后，吸除含病毒的培养基，更换为 2 mL 新鲜 CMRL 培养基（含 10% FBS 和 2 mM L-谷氨酰胺）。</li>
		<li>将胰岛在 37 °C、5% CO2 条件下继续培养 4 - 6 天，每 3 天更换一次培养基。</li>
		<li>培养 4 - 6 天后，预计约 30% 的胰岛细胞被感染。此后胰岛可用于活细胞成像实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 感染胰岛的共聚焦成像
注意：共聚焦成像所需的材料和设备请参见材料表。
<ol>
	<li>试剂准备与实验设置
	<ol>
		<li>配制细胞外液：加入 125 mM NaCl、5.9 mM KCl、2.56 mM CaCl₂、1.2 mM NaH₂PO₄、1.2 mM MgCl₂、30 mM NaHCO₃ 和 15 mM 葡萄糖2，1 mM MgCl2，25 mM HEPES，0.1% BSA，pH 7.4，经无菌过滤。 
		注意：该缓冲液通常在不添加葡萄糖的情况下配制，可于 4 °C 保存长达 1 个月。实验当天加入葡萄糖，使其达到所需的终浓度。
		<ol>
			<li>制备基础葡萄糖（3 mM）培养基：将75 µL的2 M葡萄糖储备液加入50 mL细胞外溶液中。</li>
			<li>高糖（16 mM）培养基：向50 mL细胞外液中加入400 µL的2 M葡萄糖储备液</li>
		</ol>
		</li>
		<li>稀释任何额外的刺激物（例如，KCl 或三磷酸腺苷（ATP））置于含 3 mM 葡萄糖的细胞外溶液中。</li>
		<li>实验开始前，将30 µL聚-D-赖氨酸溶液（1 mg/mL）滴加到盖玻片上，室温孵育1小时，随后用H₂O充分冲洗盖玻片进行预处理。2O. 
		注意：多聚赖氨酸包被的盖玻片可在室温下保存长达6个月。</li>
		<li>至少在实验前1小时，使用1 mL移液器将胰岛转移至含有3 mM葡萄糖的细胞外溶液的35 mm培养皿中。将胰岛置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2. 
		注意：如有需要，可在该步骤中标记质膜。为标记质膜，将2 µM di-8-ANEPPS染料加入含3 mM葡萄糖的细胞外溶液中，将胰岛置于染料溶液中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。2质膜染料可在488 nm处激发，并在620 nm处检测。</li>
		<li>实验开始前1分钟，使用真空硅脂将盖玻片密封固定至成像室，并将成像室固定于成像平台。用移液器将20–30个胰岛置于经多聚-D-赖氨酸处理的盖玻片区域，静置20分钟使胰岛贴附于表面。 
		注意：切勿让盖玻片完全干燥，以免造成胰岛损伤。</li>
		<li>当胰岛贴附在盖玻片上时，用清水彻底冲洗灌流系统以进行准备。将每种溶液加入不同的通道：3 mM 葡萄糖（通道1）、16 mM 葡萄糖（通道2）、16 mM 葡萄糖含100 µM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和10 µM 福司柯林（通道3）、含25 mM KCl 的3 mM 葡萄糖溶液（通道4）、含10 µM ATP 的3 mM 葡萄糖溶液（通道5）。通过依次单独打开各通道并让溶液流动数分钟，以排除系统中的所有气泡，并确保流速稳定（0.5 mL/min）且管路无泄漏。</li>
		<li>将单通道 inline 溶液加热器连接至灌流出口管路，并调节流出缓冲液的温度至 37 °C。</li>
		<li>准备抽吸泵。排除系统中的所有气泡，并确保流速稳定且管路无泄漏。</li>
		<li>一旦胰岛附着到盖玻片表面，轻轻用含有3 mM葡萄糖的细胞外溶液填充成像腔室。注意避免将胰岛从盖玻片表面冲走。</li>
		<li>将含有胰岛的成像平台放置于显微镜载物台上，并连接至灌流系统和抽吸泵。</li>
		<li>打开流速，持续用3G细胞外液灌注胰岛。此时系统已准备好进行共聚焦成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共聚焦成像
	<ol>
		<li>在低倍镜下找到显微镜视野中的胰岛。一旦对准胰岛，切换至高倍物镜（例如，63倍水浸物镜（63X/0.9 数值孔径）</li>
		<li>使用软件打开采集材料表）并启动共振扫描模式。</li>
		<li>选择XYZT成像模式，并按如下配置采集参数：
		<ol>
			<li>打开氩激光器并启用488 nm激光线，将激光功率调节至50%，用于pHluorin的激发。</li>
			<li>在 505 - 555 nm 范围内收集发射光。</li>
			<li>选择 512 x 512 像素的分辨率。按下 &#34;活体&#34; 单击按钮开始成像，并调节增益水平（典型增益约为600 V）。</li>
			<li>设置z轴层叠的起始与终止位置：聚焦于胰岛顶部并选择 &#34;开始&#34; 并移动到最后一个可以聚焦的层面，然后选择 &#34;结束&#34;使用5 µm的Z轴步长。软件将自动计算共聚焦平面的数量。</li>
			<li>将每个z轴层叠图像的采集时间间隔设置为接近1.5 - 2 s，并选择相应选项 &#34;获取直至停止&#34; 用于连续成像。</li>
			<li>按压 &#34;开始&#34; 初始化按钮。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用不同的刺激方案，通过向胰岛灌注所需刺激物来诱导颗粒胞吐。刺激方案可根据特定的科研目的进行定制（见下文）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>刺激方案 
	注意：在每种刺激方案中，首先在含有3 mM葡萄糖的细胞外溶液持续灌流条件下，记录至少2分钟的胰岛基础活动。随后用刺激物灌流指定时间段。刺激物的顺序、刺激持续时间以及记录时长均可根据特定的科研目的进行调整。每次开始新的刺激前，务必使用含有3 mM葡萄糖的细胞外溶液充分洗涤胰岛。以下列出的是已用于展示该方法能力的示例性刺激方案。
	<ol>
		<li>用氯化铵（NH₄Cl）进行刺激4Cl）作为pHluorin pH敏感性和病毒感染效率的阳性对照（图3）：3 mM 葡萄糖（2 分钟）→ 50 mM NH4Cl（2 分钟）在 3 mM 葡萄糖中 → 3 mM 葡萄糖（2 分钟） 
		注意：在 NH4Cl 溶液中，以等摩尔量替换 NaCl。</li>
		<li>通过提高葡萄糖浓度刺激胰岛素颗粒的胞吐作用图5 和 图6）：3 mM 葡萄糖（2 分钟）→ 16 mM 葡萄糖（15–30 分钟）→ 3 mM 葡萄糖（2 分钟） 
		注意：为了观察到多次活动爆发，需用16G溶液持续灌注胰岛至少15分钟。 
		注意：为了提高分泌反应的一致性17，用户可在3G和16G溶液中添加提高cAMP的试剂（100 µM IBMX和10 µM forskolin）。这不会改变分泌颗粒释放的时间模式。详情见15 和 讨论.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文描述了一种利用共聚焦显微镜在完整的胰岛内可视化β细胞中胰岛素颗粒胞吐作用的技术。该技术采用NPY-pHluorin作为荧光报告分子，并将其克隆至腺病毒中，以确保高效的转染效率。
尽管该方法在我们手中效率很高，但可能需要进行一些修改，这些修改主要取决于两个参数：1）胰岛制备的质量，以及2）病毒原液的滴度及感染条件的优化。在对胰岛进行病毒感染之前，应将胰岛制备物在37 °C下过夜恢复，以缓解分离和运输过程带来的应激。在整个感染/表达期间，需在光学显微镜下观察胰岛形态，并检查细胞活力下降的迹象，例如细胞从胰岛表面突出，或胰岛中心出现缺氧细胞（颜色较深的细胞）18。每批病毒原液的滴度和感染效率可能有所不同。务必根据病毒滴度以及显微检测前的培养时间调整所用病毒的体积。最关键的步骤是优化感染条件（例如，病毒颗粒数量、检测前的培养时间），以确保报告基因充分表达，同时维持胰岛的完整性和功能响应性。在优化感染方案以及每次使用新的病毒批次时，应在不同时间点收集少量胰岛，检测是否可通过KCl（30 mM）和/或高浓度葡萄糖（16 mM...

胰岛素由胰岛β细胞产生，是葡萄糖代谢的关键调节因子1。β细胞的死亡或功能障碍会破坏葡萄糖稳态，导致糖尿病的发生2。胰岛素被包裹在致密核心颗粒中，并以依赖Ca2+的方式释放3。阐明胰岛素颗粒胞吐作用的调控机制，对于全面理解胰岛素分泌的决定因素至关重要，并为发现治疗糖尿病的新治疗靶点提供了新的途径。
胰岛素胞吐作用已通过电生理学方法（如膜电容测量）以及结合荧光分子的显微成像技术得到广泛研究。膜电容测量具有良好的时间分辨率，可实现单细胞记录。然而，电容的变化反映的是细胞膜表面积的净变化，无法捕捉单个融合事件，也不能区分胰岛素颗粒融合与其他非胰岛素分泌囊泡的融合3。显微成像技术，如结合荧光探针和囊泡内容物蛋白的双光子显微镜或全内反射荧光（TIRF）显微镜，可提供更详细的观察信息。这些技术能够记录单个胞吐事件以及胞吐前和胞吐后的各个阶段，并可用于研究细胞群体中的胞吐模式3。
荧光报告分子可分为三种类型：1）细胞外报告分子，2）细胞质报告分子，或 3）囊泡内报告分子。1）细胞外报告分子为极性示踪剂（例如，葡聚糖、磺基罗丹明B（SRB）、荧光黄、吡喃宁），可通过细胞外环境引入4。使用极性示踪剂可研究细胞群体中的融合孔，并可标记多种细胞间结构（如血管）。然而，它们无法报告囊泡内容物的行为。2）细胞质报告分子是与面向细胞质、参与锚定和胞吐作用的膜相关蛋白偶联的荧光探针。例如可溶性 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）家族成员，已在神经科学领域成功用于研究神经递质的释放5。这类蛋白具有多个结合伴侣，并非胰岛素颗粒特异性。3）囊泡内报告分子是与囊泡内容物蛋白融合的荧光探针，可用于研究特定内容物的囊泡行为。胰岛素颗粒特异性内容物蛋白包括胰岛素、C肽、胰岛淀粉样多肽以及NPY等6,7。NPY仅存在于含胰岛素的颗粒中，并与胰岛素共释放，因此是荧光报告分子的理想搭档8。
将不同的荧光蛋白与NPY融合已在此前用于研究神经内分泌细胞中胞吐作用的多个方面，例如特定突触结合蛋白亚型的需求9,10，以及释放过程的时间进程如何依赖于肌动蛋白细胞骨架和肌球蛋白II11,12。在本研究中，我们选择pHluorin作为荧光报告蛋白，这是一种经过改造的GFP，在致密核心颗粒内部的酸性pH条件下不产生荧光，但在暴露于中性细胞外pH时会变得强烈荧光13。成熟的胰岛素颗粒内部pH低于5.5。一旦颗粒与质膜融合并打开，其内容物便暴露于pH为7.4的中性细胞外环境，从而可利用pH敏感蛋白pHluorin作为报告分子7,14。
鉴于pHluorin对pH的敏感性以及NPY在胰岛素颗粒中的特异性表达，NPY-pHluorin融合构建体可用于研究胰岛素颗粒胞吐作用的多种特性。通过病毒递送该融合构建体可实现高转染效率，适用于原代β细胞、细胞系以及分离的胰岛。该方法也可作为研究任何含有NPY囊泡的其他细胞类型中胞吐作用的参考指南。此外，该方法还可与任何转基因小鼠模型联用，以研究特定条件（如基因敲低、过表达）对胞吐过程的影响。 等等。) 对胞吐作用的影响。该技术先前已被用于表征人胰岛中β细胞群体胰岛素颗粒分泌的空间和时间模式15.

<table><tbody><tr><td>直立式激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>TCS-SP5</td><td>包含图像采集软件 LAS AF</td></tr><tr><td>成像腔室</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>成像腔室平台</td><td>Warner instruments</td><td>PH-1</td><td></td></tr><tr><td>22 × 40 玻璃盖玻片</td><td>Daiggerbrand</td><td>G15972H</td><td></td></tr><tr><td>真空硅脂</td><td>Sigma</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>多通道灌流系统</td><td>Warner instruments</td><td>VC-8</td><td></td></tr><tr><td>单通道串联溶液加热器</td><td>Warner instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Warner instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>蠕动式吸液泵</td><td>Pharmacia</td><td>P-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿，非组织培养处理</td><td>VWR</td><td>10861-586</td><td></td></tr><tr><td>CMRL 培养基，不含谷氨酰胺</td><td>ThermoFisher</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>FBS，热灭活</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl 溶液</td><td>Sigma</td><td>S5150</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl 溶液</td><td>Sigma</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td>1 M CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;溶液</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;溶液</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES 溶液</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>真空滤器</td><td>VWR</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANNEP</td><td>ThermoFisher</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>佛司可林</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td></td></tr></tbody></table>

共聚焦成像观察神经肽y-phluorin：一种用于完整小鼠和人类胰岛中胰岛素颗粒胞吐可视化技术

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

在正常生理条件和疾病状态下，胰岛素分泌在葡萄糖稳态调节中起着核心作用。目前研究胰岛素颗粒胞吐作用的方法主要依赖于膜片钳电生理技术，或结合荧光报告分子表达的显微成像技术。然而，这些技术大多针对克隆细胞系优化，或需要将胰岛解离成单个细胞。相比之下，本文所介绍的方法能够在完整的胰岛组织中实时观察胰岛素颗粒的胞吐过程。在本实验方案中，我们首先描述了利用编码pH敏感性绿色荧光蛋白（GFP）pHluorin与神经肽Y（NPY）融合蛋白的腺病毒对分离的小鼠或人胰岛进行病毒感染的步骤；其次，描述了病毒感染后第五天进行共聚焦显微成像的方法，以及如何监测胰岛素颗粒的分泌过程。简言之，将感染后的胰岛置于成像腔室的盖玻片上，在直立式激光扫描共聚焦显微镜下，持续灌注含有不同刺激物的细胞外溶液，同时进行实时成像。使用高速共振扫描器对胰岛约50 µm深度范围内的区域进行时间序列图像采集。通过该方法可动态追踪胰岛素颗粒与细胞质膜的融合过程。本方法还可在单次实验中测试多种刺激因素，适用于小鼠和人胰岛，并可与多种功能染料联合使用（例如，膜电位或胞质钙离子染料）。

该技术的完整工作流程如图1所示。简言之，可将表达NPY-pHluorin的腺病毒转染至小鼠或人胰岛，并在体外培养数天后，使用共聚焦显微镜进行成像观察。当分泌颗粒与细胞膜融合并打开时，可观察到荧光信号增强，并可对其进行定量分析（图1）。为了验证NPY-pHluorin是否确实是监测胰岛素颗粒动态的合适工具，对转染后的胰岛使用抗GFP抗体以及针对不同胰岛激素（胰岛素、生长抑素或胰高血糖素）的抗体进行免疫染色。大多数表达NPY-pHluorin（GFP阳性）的细胞为β细胞，因其同时表达胰岛素（约90%；图2A、2B）。仅有少数胰高血糖素阳性的α细胞或生长抑素阳性的δ细胞呈GFP标记阳性（图2B）。重要的是，在转染细胞中，NPY融合蛋白与胰岛素共定位（GFP与胰岛素的Pearson相关系数为0.61 ± 0.0...

我们描述了一种利用pH敏感性绿色荧光蛋白pHluorin对完整胰岛中胰岛素胞吐作用进行可视化观察的实验方案。分离的胰岛被感染携带编码pHluorin的腺病毒，该pHluorin与囊泡 cargo 神经肽Y相偶联。由此可通过共聚焦显微镜检测胰岛素颗粒的融合事件。

共聚焦成像观察神经肽Y-pHluorin：一种用于完整小鼠和人类胰岛中胰岛素颗粒胞吐可视化技术

胰岛素分泌在正常生理条件以及疾病状态下对葡萄糖稳态均起着核心作用。目前研究……

本实验的总体目标是通过共聚焦显微镜实时观察完整胰岛中胰岛素颗粒的胞吐过程。该方法将解答糖尿病研究领域中的关键问题，例如，什么因素调控胰岛素的胞吐作用？这一点至关重要，因为颗粒融合是β细胞生命周期中最重要的事件。该技术的主要优势在于，我们可以利用完整的胰岛，能够在细胞的天然环境中观察到融合事件。我们实验室的博士生 Madina Mahkmutova 将演示这一技术。开始操作时，胰岛到达后，立即将其转移至50毫升离心管中，并以每分钟1,000转的速度离心胰岛悬液5分钟。胰岛将沉淀至管底，随后将胰岛用2毫升CMRL培养基转移至35毫米未经组织培养处理的培养皿中，并在37°C、5%二氧化碳条件下孵育24小时，之后进行病毒感染。胰岛分离完成后，将约相当于小鼠胰岛量的样本重新悬浮于2毫升CMRL培养基中，并转移至35毫米非组织培养级培养皿内。在病毒感染前，将组织置于37°C和5%二氧化碳环境中孵育24小时。进行病毒感染时，在每皿含有2毫升CMRL培养基的人类或小鼠胰岛的35毫米培养皿中加入5至10微升病毒原液。胰岛培养24小时后，吸除培养基，并更换为2毫升不含病毒的CMRL培养基。将胰岛培养四到六天，每三天更换一次培养基。通过混合此处列出的试剂配制细胞外溶液，然后对缓冲液进行过滤除菌。通过向50毫升细胞外溶液中加入75微升2摩尔葡萄糖储备液，配制终浓度为3毫摩尔的低糖培养基。然后，为了配制高糖培养基，使葡萄糖终浓度达到16毫摩尔/升，向50毫升细胞外液中加入400微升2摩尔/升葡萄糖储备液。将其他任何额外刺激物稀释于含3毫摩尔/升葡萄糖的细胞外液中。实验开始前，用30微升1毫克/毫升多聚-L-赖氨酸溶液预处理盖玻片，并孵育1小时。然后用清水彻底冲洗盖玻片。实验开始前至少一小时，将一组胰岛转移至含有3毫摩尔葡萄糖的细胞外溶液的35毫米培养皿中。其余胰岛在37摄氏度和5%二氧化碳条件下保存。实验开始前30分钟，使用硅脂将盖玻片密封固定到成像室上。然后将成像室固定在成像平台上。接着，用移液器将20至30个胰岛转移至经多聚-L-赖氨酸处理的盖玻片区域，并让胰岛在表面贴附20分钟。此步骤对实验的成功至关重要，需在不到 10 微升的缓冲液中收集约 20 至 30 个胰岛，并静置 20 分钟。盖玻片不可完全干燥，以免造成胰岛损伤。在胰岛贴附于盖玻片的同时，使用水彻底冲洗灌流系统以完成其准备工作。然后根据下表将每种溶液加入不同的通道中。通过依次单独打开各通道并让溶液流动数分钟，以排除系统中的所有气泡。确保流速稳定，且管路无泄漏。接下来，将单通道在线溶液加热器连接至灌流出口管路，并调节流出缓冲液的温度至37摄氏度。然后，准备抽吸泵：连接管路，打开泵开关，并确保液体正在被抽吸。将载有胰岛的成像平台放置到显微镜载物台上，并连接灌流系统和抽吸泵。随后，用含有3 mM葡萄糖的细胞外溶液轻柔地灌注成像室。进行共聚焦成像时，先用低倍镜在显微镜视野中定位胰岛。聚焦于胰岛后，切换至更高倍率的物镜。打开采集软件并激活驻留扫描模式。选择 xyzt 成像，然后配置采集参数：打开氩激光器并将其设置为 30%，随后启用 488 纳米激光线，将激光功率调整至约 50% 以激发 pHluorin。以EGFP发射光谱为参考，收集505至555纳米的发射光。选择512 × 512像素的分辨率。按下活体成像按钮开始成像，并调节增益水平。通过将焦平面聚焦到胰岛顶部并选择“开始”，然后移动到最后一个可聚焦的层面并选择“结束”，来设定z轴扫描的起始与终止位置。选择5微米的z轴步进厚度。将每个z轴扫描的采集时间间隔设置为接近1.5至2秒，并选择“持续采集直至停止”选项以进行连续成像。然后，按下启动按钮以开始成像。参见文字版实验方案中关于诱导颗粒胞吐的刺激程序。使用内置扫描仪，通过共聚焦显微镜对胰岛进行扫描，以每帧不到两秒的速度获取时间序列图像。此外，该技术可与功能成像染料联合使用，例如膜电位或胞质游离钙离子染料。为了确定NP Y-pHluorin是否确实是监测胰岛素颗粒动态的合适工具，对感染的胰岛进行了免疫染色，所用抗体针对NP Y-pHluorin的GFP以及胰岛激素胰岛素、生长抑素或胰高血糖素。表达NP Y-pHluorin的大多数细胞为β细胞，因为它们同时也表达胰岛素。仅有少数胰高血糖素阳性的α细胞或生长抑素阳性的δ细胞被GFP标记。重要的是，在感染的细胞中，NPY融合蛋白与胰岛素共定位。该图表明pHluorin是一种有效的pH传感器。使用50毫摩尔氯化铵提高细胞内pH值可使细胞内荧光增强超过500%。当分泌颗粒与细胞膜融合、融合孔打开时，颗粒内部pH值升高，此时在能够刺激胰岛素胞吐的条件下（例如用氯化钾引起膜去极化），含有NP Y-pHluorin的分泌颗粒变得可见。通过共聚焦延时成像技术对感染了NP Y-pHluorin的胰岛进行观察，可在完整胰岛内的β细胞中可视化单个分泌事件。这些现象发生在氯化钾或多种其他生理刺激引起的细胞膜直接去极化之后。在基础细胞外葡萄糖浓度下，几乎观察不到分泌活动。然而，在高葡萄糖刺激下，可触发分泌颗粒与质膜的融合。采用此方法后，还可进行免疫组织化学等其他实验，以回答更多问题，例如：为何分泌颗粒的融合发生在细胞的特定区域。该技术建立后，已被用于研究人类胰岛中β细胞群体胰岛素分泌颗粒释放的时间模式。

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科研

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生物学

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