共聚焦成像观察神经肽Y-pHluorin：一种用于完整小鼠和人类胰岛中胰岛素颗粒胞吐可视化技术

本实验的总体目标是通过共聚焦显微镜实时观察完整胰岛中胰岛素颗粒的胞吐过程。该方法将解答糖尿病研究领域中的关键问题，例如，什么因素调控胰岛素的胞吐作用？

这一点至关重要，因为颗粒融合是β细胞生命周期中最重要的事件。该技术的主要优势在于，我们可以利用完整的胰岛，能够在细胞的天然环境中观察到融合事件。我们实验室的博士生 Madina Mahkmutova 将演示这一技术。

开始操作时，胰岛到达后，立即将其转移至50毫升离心管中，并以每分钟1,000转的速度离心胰岛悬液5分钟。胰岛将沉淀至管底，随后将胰岛用2毫升CMRL培养基转移至35毫米未经组织培养处理的培养皿中，并在37°C、5%二氧化碳条件下孵育24小时，之后进行病毒感染。胰岛分离完成后，将约相当于小鼠胰岛量的样本重新悬浮于2毫升CMRL培养基中，并转移至35毫米非组织培养级培养皿内。

在病毒感染前，将组织置于37°C和5%二氧化碳环境中孵育24小时。进行病毒感染时，在每皿含有2毫升CMRL培养基的人类或小鼠胰岛的35毫米培养皿中加入5至10微升病毒原液。胰岛培养24小时后，吸除培养基，并更换为2毫升不含病毒的CMRL培养基。

将胰岛培养四到六天，每三天更换一次培养基。通过混合此处列出的试剂配制细胞外溶液，然后对缓冲液进行过滤除菌。通过向50毫升细胞外溶液中加入75微升2摩尔葡萄糖储备液，配制终浓度为3毫摩尔的低糖培养基。

然后，为了配制高糖培养基，使葡萄糖终浓度达到16毫摩尔/升，向50毫升细胞外液中加入400微升2摩尔/升葡萄糖储备液。将其他任何额外刺激物稀释于含3毫摩尔/升葡萄糖的细胞外液中。实验开始前，用30微升1毫克/毫升多聚-L-赖氨酸溶液预处理盖玻片，并孵育1小时。

然后用清水彻底冲洗盖玻片。实验开始前至少一小时，将一组胰岛转移至含有3毫摩尔葡萄糖的细胞外溶液的35毫米培养皿中。其余胰岛在37摄氏度和5%二氧化碳条件下保存。

实验开始前30分钟，使用硅脂将盖玻片密封固定到成像室上。然后将成像室固定在成像平台上。接着，用移液器将20至30个胰岛转移至经多聚-L-赖氨酸处理的盖玻片区域，并让胰岛在表面贴附20分钟。

此步骤对实验的成功至关重要，需在不到 10 微升的缓冲液中收集约 20 至 30 个胰岛，并静置 20 分钟。盖玻片不可完全干燥，以免造成胰岛损伤。在胰岛贴附于盖玻片的同时，使用水彻底冲洗灌流系统以完成其准备工作。

然后根据下表将每种溶液加入不同的通道中。通过依次单独打开各通道并让溶液流动数分钟，以排除系统中的所有气泡。确保流速稳定，且管路无泄漏。

接下来，将单通道在线溶液加热器连接至灌流出口管路，并调节流出缓冲液的温度至37摄氏度。然后，准备抽吸泵：连接管路，打开泵开关，并确保液体正在被抽吸。

将载有胰岛的成像平台放置到显微镜载物台上，并连接灌流系统和抽吸泵。随后，用含有3 mM葡萄糖的细胞外溶液轻柔地灌注成像室。进行共聚焦成像时，先用低倍镜在显微镜视野中定位胰岛。

聚焦于胰岛后，切换至更高倍率的物镜。打开采集软件并激活驻留扫描模式。选择 xyzt 成像，然后配置采集参数：打开氩激光器并将其设置为 30%，随后启用 488 纳米激光线，将激光功率调整至约 50% 以激发 pHluorin。

以EGFP发射光谱为参考，收集505至555纳米的发射光。选择512 × 512像素的分辨率。按下活体成像按钮开始成像，并调节增益水平。

通过将焦平面聚焦到胰岛顶部并选择“开始”，然后移动到最后一个可聚焦的层面并选择“结束”，来设定z轴扫描的起始与终止位置。选择5微米的z轴步进厚度。将每个z轴扫描的采集时间间隔设置为接近1.5至2秒，并选择“持续采集直至停止”选项以进行连续成像。

然后，按下启动按钮以开始成像。参见文字版实验方案中关于诱导颗粒胞吐的刺激程序。使用内置扫描仪，通过共聚焦显微镜对胰岛进行扫描，以每帧不到两秒的速度获取时间序列图像。

此外，该技术可与功能成像染料联合使用，例如膜电位或胞质游离钙离子染料。为了确定NP Y-pHluorin是否确实是监测胰岛素颗粒动态的合适工具，对感染的胰岛进行了免疫染色，所用抗体针对NP Y-pHluorin的GFP以及胰岛激素胰岛素、生长抑素或胰高血糖素。表达NP Y-pHluorin的大多数细胞为β细胞，因为它们同时也表达胰岛素。

仅有少数胰高血糖素阳性的α细胞或生长抑素阳性的δ细胞被GFP标记。重要的是，在感染的细胞中，NPY融合蛋白与胰岛素共定位。该图表明pHluorin是一种有效的pH传感器。

使用50毫摩尔氯化铵提高细胞内pH值可使细胞内荧光增强超过500%。当分泌颗粒与细胞膜融合、融合孔打开时，颗粒内部pH值升高，此时在能够刺激胰岛素胞吐的条件下（例如用氯化钾引起膜去极化），含有NP Y-pHluorin的分泌颗粒变得可见。通过共聚焦延时成像技术对感染了NP Y-pHluorin的胰岛进行观察，可在完整胰岛内的β细胞中可视化单个分泌事件。

这些现象发生在氯化钾或多种其他生理刺激引起的细胞膜直接去极化之后。在基础细胞外葡萄糖浓度下，几乎观察不到分泌活动。然而，在高葡萄糖刺激下，可触发分泌颗粒与质膜的融合。

采用此方法后，还可进行免疫组织化学等其他实验，以回答更多问题，例如：为何分泌颗粒的融合发生在细胞的特定区域。该技术建立后，已被用于研究人类胰岛中β细胞群体胰岛素分泌颗粒释放的时间模式。