体外 大鼠结肠传入纤维电生理特性的表征

本方案的总体目标是展示离体记录直结肠感觉神经电生理活动的方法学。该方法有助于回答体外研究领域中的关键问题，例如外周传出神经敏感性在内脏高敏感性中的作用。该技术的主要优势在于，能够以类似于在动物或患者体内进行颈动脉分离的方式，对直结肠进行分离操作。

该方法的可视化演示至关重要，因为定位神经节并分离神经相对困难。开始操作时，使用手术刀在深度麻醉大鼠的腹壁正中线处做切口，以暴露腹腔。随后，将肠系膜及其他组织移开，以暴露结肠和直肠。

然后，将动物置于解剖显微镜下。通过精细解剖，找到左侧盆神经节，并辨认与之相连的盆神经和腰内脏神经。随后，在距离盆神经节数毫米处切断这些神经。

定位盆神经节并分离神经是本操作中最关键且最困难的步骤。接下来，切开耻骨联合以暴露直肠。清除结直肠上方的组织，并注意保持盆神经节完整无损。

通过静脉注射过量戊巴比妥处死大鼠后，于盆腔神经节上方约三厘米处横断结肠，并用镊子将直结肠从动物体内取出。随后，将直结肠转移至盛有预冷克雷布斯（Krebs）溶液的培养皿中。通过轻柔冲洗结肠以清除粪便。

接下来，仔细去除残留的膀胱及其他组织，注意不要损伤盆神经节。在此步骤中，将结肠置于记录室中，并持续用含碳合剂的克雷布斯溶液灌流组织。随后，在口腔端和肛门端对结肠直肠进行插管，然后开始从口腔向肛门方向向结肠腔内灌注生理盐水。之后，在解剖显微镜下定位主要的盆神经节，并使用昆虫针固定以暴露该神经节。

仔细解剖，找到从神经节发出并延伸至结肠的一条细小神经分支，随后在靠近神经节处将其切断。在进行下一步之前，打开加热浴装置，将克雷布斯液维持在34摄氏度。现在，在解剖显微镜下检查预先拉制好的玻璃移液管。

使用镊子折断电极尖端，使其尺寸与待记录神经的直径相匹配。随后，将电极尖端靠近打火机火焰进行斜面处理。对于初次采用该方法的研究者而言，可能难以将电极尖端打磨成与神经尺寸相匹配的斜面。

接下来，将斜面电极放入电极夹持器中，然后将一个10毫升的注射器连接到夹持器的侧端口，以便向电极施加负压或正压。随后，将夹持器连接到生物放大器的前置放大头段，并将头段安装到操纵器上。接着，将电极移至组织浴槽，并通过施加轻柔的负压吸入克雷布斯（Krebs）溶液，使溶液充满电极，直至与夹持器中的银丝接触。

接下来，将电极尖端靠近神经的切断端，并施加负压，使神经被吸入电极内。然后，进一步施加负压，使约一毫米长的神经被拉入电极并形成紧密封接。现在，打开生物放大器，并将滤波器设置为 300 至 3000 赫兹。

在示波器上监测信号，并使用峰电位数据处理软件记录神经信号和腔内压力信号。接着，通过关闭出口套管上的三通阀并持续进行腔内灌注，对结肠施加梯度扩张。监测腔内压力，直至达到60毫米汞柱，然后打开引流套管上的三通阀。

每隔十五分钟重复此操作，并通过管外或管腔内给药，以检测传入神经的化学敏感性。以下是离体结直肠管制备实验装置的示意图，以及来自盆腔神经节远端神经的代表性记录。在正常大鼠的制备标本中，结肠传入神经通常表现出较低水平的规律性自发性放电活动。

结肠的梯度扩张可诱导放电频率逐渐增加。通过绘制腔内压力-传入神经反应曲线来表征每条神经的机械感受特性。或者，也可从盆腔神经在盆腔神经节近端的分支进行记录。

近端盆腔神经的机械感觉活动特征通常与盆腔神经节远端神经的特征相似。可通过主成分分析多单位记录中的动作电位波形，以区分单个神经元的活动。以下是两个独立盆腔传入神经动作电位叠加的波形图。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解主要盆腔神经节及其他神经的解剖结构，并能够定位神经节以分离神经并记录传入神经活动。该方案的一个优势在于，它可能允许比较盆腔与内脏大神经传入神经的电生理特性及药理学特征。