Name: 体外大鼠结肠传入纤维的电生理特性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 了解大鼠结肠传入纤维的电生理特性研究方法，通过体外制备技术记录感觉神经活动。该方法可揭示内脏疼痛的神经机制，为功能性肠病和炎症性肠病研究提供关键实验手段。

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本方案得到了中国国家自然科学基金（#31171066，#81270464）和中德科学中心（GZ919）研究资助的支持。

本实验方案已获得上海交通大学医学院动物伦理委员会批准（# SYXK2013-0050）。&#160;对于熟练掌握该技术的操作者而言，完整分离结肠直肠并保留神经节和神经干至少需要15分钟。因此，在解剖过程中必须保持动物存活但处于深度麻醉状态，以确保组织在后续电生理记录中的活性。
1. 灌注液和测试化合物的制备
<ol>
	<li>配制 5 L 克雷布斯（Krebs）溶液：113 mM NaCl、5.9 mM KCl、1.2 mM NaH2PO4、1.2 mM MgSO4、25 mM NaHCO3、1.2 mM CaCl2 和 11.5 mM 葡萄糖。用 95% O2 + 5% CO2 混合气体饱和该溶液。将约 500 mL 氧合克雷布斯溶液预先在冰箱中冷却。</li>
	<li>根据需要配制储备测试化合物分装液（1 mM 辣椒素溶于乙醇，10 mM 5-羟色胺（5-HT）溶于生理盐水）。在使用前，将储备液用克雷布斯溶液稀释至终浓度（用于浴槽给药），或用生理盐水稀释（用于管腔内给药）。</li>
</ol>
2. 记录电极的制备
<ol>
	<li>使用常规电极拉制仪从无内丝的标准玻璃管（外径1.5 mm）中拉制记录电极。调整拉制仪的加热和拉伸参数，使拉制后电极的电极杆长度在20至25 mm之间。</li>
</ol>
3. 组织采集
<ol>
	<li>使用戊巴比妥钠（80 mg/kg，腹腔注射）对大鼠进行深度麻醉。&#160;</li>
	<li>在保证无菌条件下，使用手术刀沿腹壁正中线做切口，打开腹腔。将肠系膜及其他组织拨开，暴露结肠和直肠。</li>
	<li>将动物置于解剖显微镜下。通过精细解剖，找到左侧颈上神经节（PG），并辨认出与其相连的颈神经（PN）和外侧脊神经（LSN）。在距离左侧颈上神经节几毫米处切断这些神经。 
	注意：前列腺神经节（PG）位于结肠直肠交界处附近。通常有3 - 4条来自腰骶部脊髓的盆神经（PN）以及一条腹下神经（LSN）投射至PG。图1).</li>
	<li>切开耻骨联合以暴露直肠。清除周围组织（即， 膀胱 等等。在直肠上方操作时需小心，保留前列腺神经丛（PG）的完整性。</li>
	<li>通过静脉注射过量戊巴比妥处死大鼠。在距肛管约3 cm处横断结肠，使用镊子将直肠结肠组织从动物体内取出。</li>
	<li>将结直肠转移至盛有预冷克雷布斯液的培养皿中。用预冷的克雷布斯液轻轻冲洗结肠，去除粪便。仔细去除残留的膀胱及其他组织，注意不要损伤盆神经节（PG）。</li>
</ol>
4. 结肠传入神经的解剖分离
<ol>
	<li>将结肠放入记录室（20 mL）中，并持续用含碳合气的克雷布斯（Krebs）溶液灌流组织，灌流速度设定为 15 mL/min。</li>
	<li>在口腔端和肛门端对结肠直肠进行插管。以 10 mL/h 的流速从口腔向肛门方向开始结肠的腔内灌注生理盐水。</li>
	<li>在解剖显微镜下定位主要的盆神经节（PG）。使用昆虫针暴露神经节。通过精细解剖，寻找从神经节发出并延伸至结肠的一条细小神经分支（图1），并在靠近神经节处切断该神经。 
	注意：图1 展示的是位于盆神经节（PG）远端的一条神经分支的记录结果。该神经可能包含盆神经和腰交感神经内脏传入纤维的混合成分。此外，也可选择在盆神经（PN）和/或腰交感神经（LSN）位于盆神经节（PG）近端的位置进行记录。</li>
	<li>开启加热浴装置，加热克雷布斯溶液，使记录室温度维持在 34 ± 0.5 °C。</li>
</ol>
5. 吸附电极的制备
<ol>
	<li>取一支预先拉制好的玻璃移液管（步骤2），在解剖显微镜下进行检查。用一对镊子折断电极尖端，使其尺寸与待记录神经的直径相匹配。</li>
	<li>将尖端靠近打火机火焰进行斜面处理。</li>
</ol>
6. 电生理记录
<ol>
	<li>将斜面电极连接到电极夹持器上。将一个10 mL注射器连接到夹持器的侧端口，以向电极施加负压或正压。</li>
	<li>将夹持器连接到生物放大器的前置放大头级，并将头级安装到操纵器上。</li>
	<li>移动电极至组织浴槽，通过施加轻柔的负压，用Krebs溶液填充电极，直至溶液接触夹持器中的银丝。将电极尖端靠近神经的切断端，并施加负压，将神经吸入电极内。继续施加更强的负压，使约1 mm长的神经被拉入电极并形成紧密封接。</li>
	<li>打开生物放大器，将滤波器设置为300 - 3,000 Hz。在示波器上监测信号，并使用配备峰电位数据处理软件的计算机记录神经信号（采样率为20 kHz）和管腔内压力信号（采样率为100 Hz）。</li>
</ol>
7. 测试结肠传入神经敏感性
<ol>
	<li>通过关闭引流套管上的三通阀，同时持续进行管腔内灌注，对结肠施加梯度性扩张。监测管腔内压力，直至达到 60 mmHg，此时打开引流套管上的三通阀。</li>
	<li>每隔 15 分钟重复此操作。通过管腔外或管腔内给予药物，以检测传入神经的化学敏感性。</li>
</ol>

<ol><li>Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+basis+of+visceral+pain%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Biological basis of visceral pain: recent developments.</a> Pain. 96 (3), 221-225 (2002).</li>
<li>Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+spinal+distribution+and+neurochemical+phenotype+of+colonic+afferents+in+mouse+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat.</a> J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).</li>
<li>Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+mechanisms+contribute+to+mechanosensory+transduction+in+the+rat+colorectum%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum.</a> Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+the+Primary+Afferent+Nerves+in+a+Rat+Model+of+Diabetic+Visceral+Hyposensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity.</a> Mol Pain. 11, (2016).</li>
<li>Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recordings+of+afferent+fibres+with+receptive+fields+in+the+serosa%2C+muscle+and+mucosa+of+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon.</a> J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).</li>
<li>Page, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+contributions+of+ASIC+channels+1a%2C+2%2C+and+3+in+gastrointestinal+mechanosensory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function.</a> Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).</li>
<li>Hockley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y+Receptors+Sensitize+Mouse+and+Human+Colonic+Nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors.</a> J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).</li>
<li>Peiris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+afferent+recordings%3A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human visceral afferent recordings: preliminary report.</a> Gut. 60 (2), 204-208 (2011).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+silent+afferents+in+the+pelvic+and+splanchnic+innervations+of+the+mouse+colorectum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+guanylate+cyclase-C+attenuates+stretch+responses+and+sensitization+of+mouse+colorectal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents.</a> J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Functional+Characterization+of+Mouse+Colorectal+Afferent+Endings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings.</a> J Vis Exp. (95), e52310(2015).</li>
<li>Nullens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Recording+of+Mesenteric+Afferent+Nerve+Activity+in+Mouse+Jejunal+and+Colonic+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
<li>Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jejunalafferent+nerve+sensitivity+in+wild-type+and+TRPV1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice.</a> J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).</li>
<li>Brierley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+chemosensory+function+and+receptor+expression+of+splanchnic+and+pelvic+colonic+afferents+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice).</a> J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).</li>
<li>Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li>
<li>La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+expression+of+transient+receptor+potential+channel+V1%2C+transient+receptor+potential+channel+A1+and+mechanosensitive+two+pore-domain+K%2B+channels+between+the+lumbar+splanchnic+and+pelvic+nerve+innervations+of+mouse+urinary+bladder+and+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon.</a> Neuroscience. 186, 179-187 (2001).</li>
<li>Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+processing+of+noxious+colonic+input+by+thoracolumbar+and+lumbosacral+dorsal+horn+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat.</a> J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍的方案是一种相对简单的实验方法，用于评估大鼠结肠传入神经的电生理特性。该方案（从组织解剖到建立神经记录）通常需要约2小时完成。组织采集（步骤3）和制备吸附电极（步骤5）是关键步骤。在组织解剖过程中，必须能够准确定位盆神经节（PG）、下肠神经（LSN）和阴部神经（PN），并注意避免损伤神经节和神经。玻璃移液管的尖端必须折断并磨成与神经束相匹配的大小。
该制备通常可维持数小时的活性，可用于研究结直肠传入神经的机械敏感性、化学敏感性及药理学特性。与 &#34;平板式&#34; 制备11，其中通过黏膜刷拭或环向拉伸施加机械刺激，这种 &#34;管&#34; 制备方法可实现梯度或分级扩张，类似于在麻醉或清醒动物中应用结直肠扩张（CRD）来评估内脏痛。采用类似方案，Wynn 等3 研究了嘌呤能受体在大鼠结肠传入神经机械感受转导中的作用，发现结肠传入神经可被浴施ATP（P2X和P2Y受体激动剂）及α,β-meATP（P2X受体激动剂）激活，且P2受体拮抗剂可减弱扩张诱导的盆腔...

胃肠道（GIT）受到丰富的外来传入神经支配，这些神经将来自肠道的感觉信号传递至中枢神经系统，参与肠-脑相互作用。这些外来传入神经的兴奋性改变以及中枢对传入信号处理的异常，是内脏疼痛及多种胃肠道疾病（包括功能性及炎症性肠病）症状的基础1。来自结肠和直肠的感觉信息主要通过胸腰段/下腹神经以及腰骶段/盆神经（PN）传递2。近年来，研究者日益关注在啮齿类动物疾病模型中研究这些初级传入纤维的电生理特性。然而，对啮齿类动物结肠传入神经进行体内电生理记录是一项技术挑战，需要较高的外科操作技能。此外，血流动力学变化、组织运动以及麻醉药物也可能影响体内神经活动及其对测试刺激的敏感性。因此，近年来越来越多的研究采用体外（离体）制备方法，利用包括小鼠、大鼠、豚鼠以及人类在内的不同物种，来探究结肠传入神经感觉转导的机制以及疾病状态下兴奋性的改变3,4,5,6,7,8
两种类型 离体 结肠准备方法已有报道：主要的 &#34;平板式&#34; 制备5,9,10 以及 &#34;管&#34; 制备3,4. 一种视频实验方案，用于 &#34;平板式&#34; 小鼠结直肠组织制备方法已有文献报道11在本方案中，将附有盆神经（PN）或腰内脏神经（LSN）的小鼠结直肠组织取出，并置于组织浴槽中进行灌流。结直肠沿纵轴切开，神经束被引出并延伸至充满石蜡油的记录室。使用单极铂铱电极记录神经活动。该方案可通过无偏倚的电刺激识别单个传入纤维的感受野，同时可精确定位化学刺激的应用部位，以及实施不同类型的机械刺激范式例如， 局部黏膜探查和环向牵拉）传递至传入神经末梢。由于神经需从组织腔延伸至另一个独立的腔室，因此必须保持所连神经相对较长；对于初次使用该方法的研究人员而言，成功分离神经具有较大挑战性。最近，Nullens 等 发表了一项关于的视频实验方案 体外 记录小鼠空肠和结肠段的肠系膜传入神经活动12. 在此 &#34;管&#34; 准备过程中，保留附着肠系膜的肠段完整，从而允许对肠腔进行梯度扩张以及腔内和腔外给予不同化学物质。由于肠系膜神经采用吸吮电极记录，该电极可紧贴组织放置，因此即使肠系膜神经相对较短，仍可记录到传入活动。然而，肠系膜神经由混合性的迷走神经和脊髓传入纤维组成，支配空肠或胸腰段下腹神经；而支配结直肠的腰骶段盆神经传入纤维则无法在本方案中被区分。本文中，我们提供了一种利用该方法记录大鼠结肠传入神经电生理活动的详细方案 &#34;管&#34; 保留完整盆神经丛的结直肠制备。该方法可用于表征腰内脏神经（下腹神经）和腰骶盆神经传入纤维的功能特性。

<table><tbody><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>上海西唐生物科技有限公司</td><td>B558</td><td></td></tr><tr><td>辣椒素</td><td>Sigma</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>电极拉制仪</td><td>MicroData Instrument 公司</td><td>PMP107</td><td></td></tr><tr><td>神经记录系统（生物放大器）</td><td>Digitimer 公司</td><td>Neurolog System</td><td></td></tr><tr><td>A/D 转换器</td><td>剑桥电子设计公司</td><td>Micro1401</td><td></td></tr><tr><td>数据处理软件</td><td>剑桥电子设计公司</td><td>Spike2 版本 6</td><td></td></tr><tr><td>银丝</td><td>世界精密仪器公司</td><td>EP12</td><td></td></tr><tr><td>玻璃管</td><td>世界精密仪器公司</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>电极夹持器</td><td>世界精密仪器公司</td><td>MEH3SBW</td><td></td></tr><tr><td>加热浴槽</td><td>Grant</td><td>GR150</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>徕卡</td><td>Zoom2000</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>世界精密仪器公司</td><td>PZMIII-BS</td><td></td></tr><tr><td>打火机</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>手术器械</td><td>世界精密仪器公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>自制，使用 0.1 mm 不锈钢丝</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>三维操纵器</td><td>世界精密仪器公司</td><td>KITF-R</td><td></td></tr><tr><td>大鼠</td><td>任意</td><td>NA</td><td>可使用任意品系/性别。</td></tr></tbody></table>

体外 大鼠结肠传入纤维电生理特性的表征

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

结肠感觉神经功能障碍已被认为与多种常见疾病的病理生理过程相关，包括功能性肠病、炎症性肠病以及糖尿病。本文中，我们描述了一种实验方案，用于 体外 大鼠结肠传入神经电生理特性的表征。将带有完整盆腔神经节（PG）的结直肠组织从大鼠体内取出，置于记录 chamber 中并用含碳合气的克雷布斯（Krebs）溶液持续灌流，于口腔端和肛门端进行插管，以实现扩张刺激。自 PG 发出的细小神经束被识别后，使用吸电极记录多单位传入神经放电活动。结肠节段扩张可诱发多单位放电活动逐渐增加。通过主成分分析对低阈值、高阈值及宽动态范围的传入纤维进行区分。可通过浴式或管腔内给予测试化合物，研究结肠传入神经的化学敏感性。该实验方案可经修改后应用于其他物种，如小鼠和豚鼠，并可用于研究正常与病理状态下降结肠胸腰段/腹下神经与腰骶段/盆腔传入神经电生理特性的差异。

图1 实验装置示意图 离体 “管状”结肠制备，附来自盆神经节（PG）远端神经的代表性记录。该神经可能含有盆神经与腰交感干内脏传入纤维的混合成分。在正常大鼠的制备中，结肠传入神经通常表现出低水平的不规则自发性放电活动。结肠的斜坡式扩张可诱导放电频率逐渐增加图1B). 通过绘制管腔内压力-传入神经反应曲线来表示每条神经的机械感受特性（图1C）。可比较各组之间的平均压力-反应曲线（即， 对照组与处理组）以揭示处理是否改变结肠传入神经的机械感觉特性（参见 Rong 等13 有关压力-传入反应曲线的详细信息）。
或者，也可从靠近颈上神经节（PG）的颈神经（PN）或腰交感神经（LSN）近...

异常感觉功能是功能性及炎症性肠病内脏疼痛及其他症状的基础。一种用于结肠传入神经电生理记录的方案 离体 大鼠结肠和直肠的制备方法在此展示。

结肠感觉神经功能障碍已被认为与多种常见疾病的发病机制有关，包括功能性及炎性肠病……

本方案的总体目标是展示离体结直肠感觉神经电生理记录的方法学。该方法有助于回答体外研究领域中的关键问题，例如外周传出神经敏感性在正确感知痛觉过敏中的作用。该技术的主要优势在于，它能够以类似于在动物或患者体内进行颈动脉分离的方式，对结直肠进行分离操作。该方法的可视化演示至关重要，因为定位神经节并分离神经相对困难。开始此操作时，使用手术刀在深度麻醉的大鼠腹壁上做一条正中切口，以暴露腹腔。随后，将肠系膜及其他组织移开，以暴露结肠和直肠。然后将动物置于解剖显微镜下，通过精细解剖找到左侧盆神经节，并辨认与之相连的盆神经和腰内脏神经。随后，在距离盆神经节数毫米处切断这些神经。定位盆腔神经节并分离神经是本操作中最关键且最困难的步骤。接下来，切开耻骨联合以暴露直肠。清除结直肠上方的组织，并注意保持盆腔神经节完整无损。通过静脉注射过量戊巴比妥处死大鼠后，于盆腔神经节上方约三厘米处横断结肠，并用镊子将直结肠从动物体内取出。随后，将直结肠转移至盛有预冷克雷布斯（Krebs）溶液的培养皿中。通过轻柔冲洗结肠以清除粪便。接下来，仔细去除残留的膀胱及其他组织，注意不要损伤盆神经节。在此步骤中，将结肠置于记录 chamber 中，并持续用含碳合气的 Krebs 溶液灌流组织。随后，在结肠的口端和肛端分别进行插管，然后开始从口端向肛端方向向肠腔内灌注生理盐水。之后，在解剖显微镜下定位主要盆神经节，并使用昆虫针固定以暴露该神经节。仔细解剖，找到从神经节发出并延伸至结肠的一条细小神经分支，随后在靠近神经节处将其切断。在进行下一步之前，打开加热浴装置，将克雷布斯溶液维持在34摄氏度。现在，在解剖显微镜下检查一支预先拉制好的玻璃移液管。用镊子折断电极尖端，使其尺寸与待记录神经的直径相匹配。随后，通过将尖端靠近打火机火焰进行斜面处理。对于该方法的新手而言，可能难以将电极尖端打磨成与神经尺寸相匹配的斜面。接下来，将斜面电极插入电极夹持器中，然后将一个10毫升的注射器连接到夹持器的侧端口，用于向电极施加负压或正压。随后，将夹持器连接到生物放大器的前置放大头段，并将头段安装到操纵器上。接着，将电极移至组织浴槽，通过施加轻柔的负压吸力，用Krebs溶液填充电极，直至溶液与夹持器中的银丝接触。接下来，将电极尖端靠近神经的切断端，并施加负压，使神经被吸入电极内。随后增加负压，使约一毫米长的神经被拉入电极并形成紧密封接。现在打开生物放大器，将滤波器设置为300至3000赫兹。在示波器上监测信号，并使用峰电位数据处理软件记录神经信号和管腔内压力信号。接着，通过关闭出口套管上的三通阀并持续进行管腔内灌注，对结肠施加递增式扩张。监测管腔内压力，直至达到60毫米汞柱，然后打开引流套管上的三通阀。以十五分钟为间隔重复此操作，并通过管腔外或管腔内给药以检测传入神经的化学敏感性。以下是离体结肠管段制备实验装置的示意图，以及来自盆腔神经节远端神经的代表性记录。在正常大鼠的制备标本中，结肠传入神经通常表现出较低水平的规律性自发性放电活动。结肠的梯度扩张可诱导放电频率的逐渐增加。通过绘制肠腔内压力-传入神经反应曲线，可表征每条神经的机械感受特性。或者，也可从盆腔神经节近端的盆腔神经分支进行记录。近端盆腔神经的机械感觉活动特征通常与盆腔神经节远端神经的特征相似。可通过主成分分析多单位记录中的动作电位波形，以区分单个神经元的活动。以下是两个独立盆腔传入神经动作电位叠加的波形图。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解主要盆腔神经节及其他相关神经的解剖结构，并能够定位神经节以分离神经并记录传入性活动。该实验方案的一个优势在于，可实现对盆腔传入神经与内脏大神经传入神经的电生理特性及药理学特征进行比较。

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神经科学

体外大鼠结肠传入纤维的电生理特性

本视频展示了一种在离体大鼠结肠上记录结肠传入神经活动的方法。结肠两端被插管并灌注生理盐水以增加腔内压力。随着压力升高，神经信号增强，表明神经受到刺激。...

离体大鼠结肠中结肠传入神经的电生理记录

本视频展示了在离体小鼠空肠段上记录肠系膜传入神经电活动的过程，以研究组织压力和运动变化对传入神经活动的影响。...

离体小鼠空肠节段肠系膜传入神经活动记录

本视频展示了大鼠C纤维神经传导的单纤维记录。对一只麻醉的大鼠进行切口以暴露坐骨神经，该神经为下肢提供感觉和运动支配。随后暴露单个C纤维。通过植入足部的刺激电极施加电刺激，并从单根神经纤维记录反应。...

在体大鼠坐骨神经C纤维单纤维记录

来源： Fried, D. E., Gulbransen, B. D. 肠神经系统原位 Ca2+ 成像. J. Vis. Exp.

小鼠结肠肌间神经丛中肠神经元与胶质细胞活动的钙成像

来源：Lai, J., et al. 在啮齿类动物大脑中同时进行电生理记录与抑制剂微注射。J. Vis. Exp.

抑制大鼠神经元活动及其通过电生理学检测的方法

我们展示了一种用于直接研究肠神经系统中神经元和胶质细胞组分的细胞培养方案。该方法通过取自成年小鼠肌间神经丛的神经元/胶质细胞混合培养，在盖玻片上建立培养体系，从而能够利用电生理学、免疫组织化学等方法对单个神经元和胶质细胞的功能进行检测。 等等.

一个 体外 成年小鼠肌间神经丛分离肠神经元和胶质细胞的制备

本视频演示了一种在单根神经纤维上进行电生理记录的实验方案 体外 小鼠结直肠-神经制备...

体外 小鼠结直肠传入末梢的功能表征

肠系膜传入神经将来自胃肠道的信息传递至大脑，涉及正常的稳态以及病理生理状态。通过将带有附着传入神经的离体肠段固定于器官浴槽中，分离神经并记录基础状态及刺激条件下的神经放电活动，可评估胃肠道传入神经的活性。...

体外记录小鼠空肠和结肠节段肠系膜传入神经活动

轴突兴奋性技术为研究不可逆变性事件发生前的病理生理学和生物物理变化提供了强有力的工具。本文展示了在麻醉大鼠尺神经上应用这些技术的方法。...

体内大鼠尺神经轴突兴奋性测试的电生理测量

单纤维记录是一种适用于中枢和周围神经系统的有效电生理技术。结合带有附着坐骨神经的完整背根神经节制备，可检测传导阻滞的机制。这两种方案均有助于加深对周围神经系统与疼痛关系的理解。...

利用体内单纤维记录法及附着坐骨神经的完整背根神经节研究传导阻滞的机制

了解大鼠结肠传入纤维的电生理特性研究方法，通过体外制备技术记录感觉神经活动。该方法可揭示内脏疼痛的神经机制，为功能性肠病和炎症性肠病研究提供关键实验手段。

体外大鼠结肠传入纤维电生理特性的表征

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体外 大鼠结肠传入纤维电生理特性的表征

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