Name: 人的 ikkknα的生产、结晶和结构测定指南 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学习人源IKK1/α蛋白的表达、结晶与结构测定方法，用于免疫信号转导研究。本技术采用昆虫细胞表达体系，结合分子置换法解析晶体结构，为理性药物设计提供结构基础。

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我们感谢伊利诺伊州莱蒙特先进光子源（Advanced Photon Source）19ID、24ID 和 13ID 光束线的工作人员在多种晶体数据收集过程中提供的支持。我们感谢萨尔克研究所（Salk Institute）的 Dmitry Lyumkis 在电镜图谱/模型构建的早期阶段为我们提供了低分辨率的冷冻电镜图谱，该图谱被用于构建初始的 IKK1 分子置换搜索模型。本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 AI064326、CA141722 和 GM071862 对 GG 的资助。SP 目前为惠康信托基金会（Wellcome Trust）与印度生物技术部（DBT）印度中级研究员。

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

两种相关IKK蛋白的表达、结晶及结构解析 
我们着手解析IKK1/α的X射线晶体结构，原以为凭借我们在IKK2/β蛋白表达、结晶及结构测定方面的经验，这将是一项相对直接的工作。然而，我们非常惊讶地发现，这两种相关的蛋白在结晶难易程度上表现出显著差异。尽管多个高水平实验室付出了努力，IKK1结构的解析仍耗时近二十年。这在很大程度上源于几个关键的技术瓶颈。
第一个难点是获得高纯度且可溶的蛋白形式。昆虫细胞表达系统使我们能够获得毫克量级的高纯度蛋白，且其溶解性相对良好。就表达水平而言，所有IKK1/α构建体在昆虫细胞表达系统中的表达水平均显著低于IKK2/β构建体。需要注意的是，这两种蛋白在表达时均不具可溶性和功能活性，当在 E. coli在昆虫细胞表达系统中，IKK2/β片段的表达量较高，根据不同构建体，产量在每升培养物10至30 mg之间。相比之下，IKK1/α构建体的表达量仅为每升培养物0.5至2.0 mg。目前我们尚不清楚造成这种差异的原因。我们也应尝试在天然宿主细胞中表达IKK1即，尤其是在哺乳动物...

NF-κB 家族二聚体转录因子的转录活性在多种细胞功能中发挥重要作用，包括炎症与免疫反应以及细胞存活与死亡。这些活性在细胞内受到严格调控，调控失常会导致多种病理状态，如自身免疫性疾病和癌症1,2,3。在无刺激信号时，NF-κB 的活性被 IκB（κB 抑制蛋白）家族蛋白所抑制4。IκB 蛋白上特定丝氨酸（Ser）残基的磷酸化会标记其发生泛素化修饰，进而导致蛋白酶体降解或选择性加工5。两种高度同源的丝氨酸/苏氨酸激酶 IKK2/β 和 IKK1/α 通过介导上述磷酸化事件，成为 NF-κB 活性的核心调控因子6,7。
配体与受体之间的相互作用通过一系列中介分子传递信号，最终导致NF-κB因子的激活。NF-κB信号通路 broadly 可分为两条不同的途径——经典途径和非经典（替代）途径。8IKK2/β 的活性主要调控经典通路中的 NF-κB 信号转导，该通路对炎症和先天免疫反应至关重要。9该通路的一个显著特征是IKK2/β的快速且短暂的激活10 在一个迄今为止生化性质尚未明确的IKK复合物内——该复合物推测由IKK1和IKK2以及一个调节组分NEMO（NF-κB必需调节因子）组成11,12,13在IKK复合物的两个催化性IKK亚基中，IKK2主要负责14 对于典型IκB蛋白（α、-β）特定残基的磷酸化 &amp;#38; -γ) 与 NF-κB 结合，以及一种非典型的 IκB 蛋白 NF-κB1/p105，后者是 NF-κB p50 亚基的前体蛋白5磷酸化诱导的IκB泛素化及蛋白酶体降解（或p105的加工）导致特定NF-κB二聚体的释放与活化15由于IKK2功能失调导致NF-κB异常活化，已在多种癌症及自身免疫性疾病中被观察到。2,3,16.
与IKK2/β不同，IKK1/α的活性调控非经典NF-κB信号通路，该通路对发育和免疫至关重要。IKK1在其C端IκBδ区段上磷酸化NF-κB2/p100的特定残基，从而促使其加工并生成p52。转录活性p52:RelB异源二聚体的形成启动了对发育信号的缓慢而持续的响应7,17,18,19,20。有趣的是，该通路中核心NF-κB因子p52的生成高度依赖于另一个因子——NF-κB诱导激酶（NIK）21,22，而不依赖于IKK2或NEMO。在静息细胞中，NIK的水平保持较低，因其持续经历蛋白酶体依赖性降解23,24,25。当细胞受到“非经典”配体刺激或在某些恶性细胞中，NIK趋于稳定，进而招募并激活IKK1/α。NIK和IKK1的激酶活性对于p100高效加工为p52均至关重要7。IKK1和NIK在其C端IκBδ区段上磷酸化NF-κB2/p100的三个丝氨酸残基（Ser866、870和872），从而促使其加工并生成p52。非经典通路的异常激活已被发现与多种恶性肿瘤相关，包括多发性骨髓瘤26,27,28。
目前已知多种针对IKK2/β的高效且特异性抑制剂，但迄今为止尚无一种成为有效的药物。相比之下，IKK1/α的特异性抑制剂则极为稀少。这可能部分源于我们对IKK1/α的结构和生化信息了解不足，从而限制了对IKK1在细胞中激活NF-κB的分子机制的理解，以及合理药物设计的开展。IKK2/β的X射线晶体结构为我们揭示了其激活机制29；然而，这些结构未能阐明不同的上游刺激如何触发IKK1/α或IKK2/β的活化，以调控不同类型的NF-κB活性30,31。为了理解IKK1/α独特信号功能的分子机制，并建立合理药物设计的平台，我们致力于解析IKK1/α的结构。

<table><tbody><tr><td>Cellfectin/Cellfectin II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>Cellfectin 已停止生产，由 Cellfectin II 取代</td></tr><tr><td>Sf900 III 昆虫细胞培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>SF9 细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>anti-IKK1 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56704</td><td>此前由 Imgenex 销售</td></tr><tr><td>anti-PentaHis 抗体</td><td>Qiagen</td><td>34460</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>也可使用硝酸纤维素膜</td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 法蛋白检测试剂</td><td>BioRad</td><td>500001</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 浓缩管</td><td>Millipore</td><td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td><td></td></tr><tr><td>化合物 A</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbiochem IKK 抑制剂 XII</td><td>Calbiochem</td><td>401491</td><td></td></tr><tr><td>星形孢菌素（Staurosporine）</td><td>SIGMA</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>MLN120B</td><td>Millenium</td><td>赠品</td><td></td></tr><tr><td>AMPPNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647</td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖</td><td>SIGMA</td><td>51227, 42867, 31404,</td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62101</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td><td>其中部分为 SIGMA 目录中的新货号。我们原先使用的是 Fluka 生产的产品，其货号不同。</td></tr><tr><td>结晶筛选试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen I 和 II（Crystal Screen HT）</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-130</td><td></td></tr><tr><td>Index HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-134</td><td></td></tr><tr><td>PEG/Ion 和 PEG/Ion2（PEG/Ion HT）</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>PEGRX 1 和 PEGRx 2（PEGRx HT）</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-086</td><td></td></tr><tr><td>SaltRx 1 和 SaltRx 2（SaltRx HT）</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>晶体载网</td><td>Hampton Research</td><td>HR8-188, 190, 192, 194</td><td></td></tr><tr><td>同步辐射光源</td><td>美国能源部&amp;rsquo;s 阿贡国家实验室先进光子源（APS）</td><td>19 ID 光束线</td><td>美国能源部&amp;rsquo;s 阿贡国家实验室的先进光子源（APS）提供超亮、高能量的储存环产生的 X 射线束，用于几乎所有科学领域的研究。</td></tr></tbody></table>

人源ikk1/α的制备、结晶及结构测定指南

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

一类细胞外刺激需要激活IKK1/α，以通过其前体p100的加工诱导生成NF-κB亚基p52。p52可作为同源二聚体或与另一NF-κB亚基RelB形成异源二聚体发挥作用。这些二聚体进而调控数百个与炎症、细胞存活及细胞周期相关基因的表达。IKK1/α主要与IKK2/β和NEMO形成三元复合物而存在。然而，也观察到少量IKK1/α以低分子量复合物的形式存在。目前尚不清楚p100的加工活性是由较大复合物还是较小复合物中的IKK1/α激活所触发的。IKK1/α的组成性活性已在多种癌症和炎症性疾病中被检测到。为了阐明IKK1/α的激活机制，并推动其作为药物靶点的应用，我们在不同表达系统（如大肠杆菌（E. coli）、昆虫细胞和哺乳动物细胞）中表达了重组IKK1/α蛋白。我们成功在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达了可溶性IKK1/α，获得了毫克级高纯度蛋白，利用抑制剂存在条件下进行结晶，并解析了其X射线晶体结构。本文中，我们详细描述了重组蛋白的制备、结晶及其X射线晶体结构解析的具体步骤。

IKK1/α 不同构建体的克隆与表达 
将全长人源 IKK1/α 克隆至杆状病毒表达载体 pFastBacHTa 的 EcoRI 和 NotI 限制性酶切位点之间，以获得带有 N 端六聚组氨酸标签的 IKK1。该标签可通过 TEV 蛋白酶消化去除。由于全长 IKK1/α 在两端均含有柔性区域，而柔性区域通常会使蛋白质难以结晶，因此我们将多种截短形式的 IKK1/α 片段克隆至上述 pFastBacHTa 载体的相同位点。构建了多种 IKK1/α 截短突变体，其背景分别为野生型（wt）和 S176E,180E（EE）。IKK1/α EE 代表模拟持续活化状态的磷酸化激酶形式。重组杆状病毒的制备及蛋白表达按照先前发表的方案稍作修改进行43（图 1）。
IKK1/α 结晶的困难<...

IκB 激酶 1/α（IKK1/α CHUK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要通过激活 NF-κB 转录因子参与多种细胞活动。本文描述了该蛋白的制备及其晶体结构测定所需的主要步骤。

人源IKK1/α的制备、结晶及结构测定指南

一类细胞外刺激需要激活IKK1/α以通过其前体加工产生NF-κB亚基p52。

本实验的目的是为人类IKK1-α蛋白的制备、结晶及结构解析提供指导，以阐明其信号传导功能的作用机制，并为合理药物设计建立平台。该方法有助于研究人员确定IKK1的结构，从而解答免疫信号传导领域中的一些关键问题。本技术描述了一条简化的途径，用于获得IKK蛋白的晶体——这类蛋白通常难以结晶，并提供了克服结构解析过程中瓶颈问题的多种关键信息。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为要获得毫克量级的可溶性良好且性质稳定的蛋白质，需要在昆虫细胞中进行表达，而结晶只能在非常狭窄的条件范围内实现。在解析IKK1结构时所采用的分子置换法也可能极具挑战性，尤其是由于晶体衍射性能较差，且在缺乏合适搜索模型的情况下，非对称单元中包含多个IKK1分子，进一步增加了难度。本次实验操作将由我实验室的学生Kyle Shumate和Sonjiala Hotchkiss进行示范。第一天，在六孔板的每个孔中加入2毫升Sf903昆虫细胞培养基，接种Sf9细胞，并在27°C下培养。当细胞在悬浮液中的密度达到每毫升2至3×10⁶个细胞时，将其稀释至新鲜培养基中传代，接种密度约为6×10⁵个细胞/毫升。第二天，将8微升Sf9转染试剂溶于100微升SF-903或Grace's昆虫培养基中。然后短暂涡旋混合物。在另一管中，将1微克试剂盒纯化的重组bacmid溶于100微升相同培养基中进行稀释。将稀释后的DNA与转染试剂混合。室温孵育15至30分钟后，从孔中移除培养基。然后加入1毫升新鲜培养基。接着将稀释后的DNA转染试剂混合物逐滴加入细胞中，调整液滴大小，避免冲落贴壁细胞。六小时后，在细胞上层加入 1.5 毫升新鲜培养基。将细胞在 27 摄氏度下孵育，每 12 小时定期观察孔内细胞，检查病毒侵染迹象。感染后 60 至 72 小时，在第五天移除含有细胞的培养基。将培养基转移至离心管后，在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。离心结束后，保留上清液，即为P1病毒浓缩液。在第一天，将先前制备的His-IKK1细胞沉淀重悬于40 mL裂解缓冲液中。将细胞悬液置于冰上，通过超声处理裂解细胞，超声参数为60%至70%的占空比，每次30秒，共5到10次脉冲，每次间隔大于1分钟。在4摄氏度下，以不小于28,000 g的离心力离心45分钟，澄清裂解液。根据文本方案制备镍-NTA琼脂糖树脂后，使用20毫升洗脱缓冲液，通过重力流洗脱His标签的IKK1 alpha蛋白。收集1至1.5毫升的组分。合并含有目标蛋白的组分后，在4摄氏度下用TEV蛋白酶过夜消化样品。第二天早晨，在27摄氏度下，将蛋白与1毫摩尔ATP在氯化镁、β-甘油磷酸钠、氟化钠和正钒酸钠存在条件下孵育1小时。孵育后，将蛋白质溶液通过0.45微米滤膜过滤。然后将约六毫升样品加载到连接至自动液相色谱系统的120毫升制备级尺寸排阻色谱柱上。平衡后，以每分钟一毫升

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Biochemistry

生物化学

人的 ikkknα的生产、结晶和结构测定指南

基于结构的药物设计在药物研发中发挥着重要作用。并行追求多个靶点可显著提高先导化合物发现的成功率。以下文章重点介绍了西雅图传染病结构基因组学中心如何采用多靶点策略，实现流感病毒A型PB2亚基从基因到结构的测定。...

流感病毒聚合酶PB2亚基基因至结构解析的多靶点并行处理方法

蛋白质–DNA 复合物的晶体结构可为蛋白质的功能、作用机制以及特异性相互作用的性质提供深入见解。本文中，我们报道了如何优化双链 DNA 的长度、序列和末端，以实现与大肠杆菌（Escherichia coli）复制起始负调控因子 SeqA...

DNA双链的迭代优化以促进SeqA-DNA复合物的结晶

β-桶状外膜蛋白（OMPs）在革兰氏阴性菌、线粒体和叶绿体的外膜中具有多种功能。本文旨在通过提供相关实验方案，解决结构研究中已知的一个瓶颈问题，即大量制备β-桶状OMP蛋白，以满足通过X射线晶体学或核磁共振波谱法进行结构解析的需求。...

从构建体到晶体——迈向β-桶状外膜蛋白的结构解析

我们描述了一个结合了简单生化分析与计算分析的框架，用于指导大型卷曲螺旋结构域的表征与结晶。该框架可针对球状蛋白进行调整，或进一步拓展以整合多种高通量技术。...

结合湿实验与干实验技术指导含大型卷曲螺旋结构蛋白的结晶

脯氨酰-脯氨酰内肽酶-1（PPEP-1）是一种由人类病原体Clostridium...

蛋白质的制备、结晶与结构测定 C. difficile PPEP-1 的微晶种法结合锌单波长反常散射法

介绍了一种利用蛋白质微晶进行X射线晶体学的实验方案。两个分析实例 体内纯化后生长的微晶 在细胞内...

蛋白质晶体的微晶衍射分析 活细胞内 衍射

我们介绍了利用生物膜干涉技术、等温滴定热量法和X射线晶体学对具有免疫球蛋白折叠结构的糖蛋白进行生物物理和结构表征的方法。...

利用X射线晶体学与生物物理技术对具有免疫球蛋白折叠结构的糖蛋白进行表征

我们描述了通过X射线晶体学测定NEMO蛋白IKK结合域结构的实验方案。该方法包括蛋白质的表达、纯化与表征，以及获得其无配体结合形式蛋白质高质量晶体并完成结构解析的策略。...

NEMO 的 IKK 结合结构域的制备、结晶与结构测定

本方案描述了通过不同物种的β2-微球蛋白（β2m）潜在替换，获得稳定的主要组织相容性复合体（MHC）I类分子的实验方法。研究了由同源和异源β2m稳定的MHC...

蝙蝠主要组织相容性复合体I类分子与异源β2-微球蛋白结合后的稳定性与结构研究

本文介绍了一种利用微晶接种法在稀疏矩阵筛选中生成经I3C（5-氨基-2,4,6-三碘间苯二甲酸）衍生物修饰的蛋白质晶体的方法。该方法可通过液体分配机器人或手工设置结晶板。...

使用随机微晶种子矩阵筛选法对蛋白质晶体进行I3C衍生化

本文介绍了如何在晶上晶装置上设置蛋白质结晶，以及如何利用芯片结晶平台在室温下进行自动化的序列数据收集。...

片上结晶与室温大规模连续衍射

学习人源IKK1/α蛋白的表达、结晶与结构测定方法，用于免疫信号转导研究。本技术采用昆虫细胞表达体系，结合分子置换法解析晶体结构，为理性药物设计提供结构基础。

人源IKK1/α的制备、结晶及结构测定指南

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