人的 ikkknα的生产、结晶和结构测定指南

本程序的目标是为人类 IKK1-alpha 的生产、结晶和结构测定提供指导，以了解其信号功能的机械基础，并建立合理药物设计平台。这种方法应该帮助研究人员确定 IKK1 的结构，它将为免疫信号领域的关键查询提供答案。该技术描述了获得 IKK 蛋白晶体的简化路径，这些晶体对结晶相当难耐，在克服确定结构的瓶颈方面提供了各种关键信息。

一般来说，新方法的个体将难以为之，因为产生千毫克的可溶性、表现良好的蛋白质，需要它在昆虫细胞中表达，而结晶只能在极窄的条件下进行。用于确定 IKK1 结构的分子替换程序也可能非常棘手，特别是由于晶体的偏转性能较差，在缺乏适当搜索模型的情况下，不在包含许多 IKK1 分子的不对称单元的位点。演示程序将是凯尔舒马特和桑贾拉霍奇基斯，学生从我的实验室。

第一天，在Sf903昆虫细胞培养的两毫升中，在六井板的每个井中，在27摄氏度下孵育。当细胞达到每毫升悬浮细胞的2到3倍的密度，通过稀释到新鲜介质，其密度约为6倍10至5。第二天，在SF-903或格雷斯昆虫介质的100微升中稀释8微升Sf9转染试剂。

然后短暂地涡旋混合物。在单独的管中，用同一介质的100微升稀释1微克的套件纯化重组百花。将稀释的DNA和转染试剂结合。

在室温下孵育15至30分钟后，将介质从井中取出。然后加入一毫升新鲜介质。接下来，将稀释的DNA转染试剂混合物滴入细胞，调整滴体大小，使粘附细胞不脱。

六小时后，在细胞顶部加入1.5毫升的新鲜介质。在27摄氏度下孵育细胞，每12小时定期检查一次井中是否有病毒感染的迹象。第五天，在感染后60至72小时取出含有细胞的介质。

将介质转移到管中后，在500倍g和4摄氏度下离心5分钟。完成后，保存上一点，这是P1病毒堆栈。在第一天，将先前准备的 His-IKK1 细胞颗粒重新在 40 毫升的解解缓冲液中重新暂停。

将细胞悬浮液放在冰上，以60%至70%的占空比和5到10个30秒持续时间的脉冲，以超过1分钟的间隔，通过声波对细胞进行悬浮。在4摄氏度下，在大于或等于28，000g的离心下澄清酸盐，45分钟。在制备镍-NTA阿加罗斯树脂后，根据文本协议，使用20毫升的洗脱缓冲液在重力流下洗脱他标记的 IKK1α 蛋白。

收集一到1.5毫升的分数。将含有蛋白质的馏分结合后，在4摄氏度下将样品与TEV蛋白酶一起消化过夜。第二天早上，在27摄氏度的亚硫酸镁、β-甘油磷酸盐、氟化钠和正极酯钠的温度下，用ATP一毫升孵育蛋白质一小时。

孵育后，通过0.45微米过滤器过滤蛋白质溶液。然后将大约 6 毫升的样品装到 120 毫升的制备尺寸排除柱上，该列连接到自动液相色谱系统。平衡后，以每分钟一毫升的流速运行大小排除色谱，并收集两毫升的分数。

在运行过程中，监测洗脱 280 和 254 纳米。拉纯馏分后，按照制造商的指示，浓缩在30千元分子量截止离心浓缩器中。然后分配25微升的浓缩蛋白等分，并在液氮中闪冻。

使用机器人将结晶试剂的 80 到 100 微升移液器放入 96 井板的储液罐中。使用结晶机器人，分配和混合0.2至0.25微升的 IKK1 及其抑制剂复合物，其储液罐溶液体积相同。设置跌落后，立即用光学透明薄膜密封每个板，以避免蒸发。

在18摄氏度下孵育一个板，在寒冷的房间里孵育一个4摄氏度的盘子。使用带偏振器的立体显微镜，每天检查每滴晶体的外观，前七天，然后以更长的间隔。在准备 IKK1 及其抑制剂复合物后，将井溶液转移到 24 井板的每个井中。

将 1 至 1.5 微升的井溶液放在干净的玻璃盖玻片上。将同等体积的 IKK1 及其抑制剂复合物添加到玻璃盖玻片中，通过上下移液三到四次轻轻混合。在板的每个井的环上涂抹润滑脂后，将玻璃盖玻片翻过来，用钳子放在相应的井上。

然后按压玻璃盖玻片，密封井。在24井板中设置所有滴水后，在黑暗中在寒冷的房间里孵育。偶尔检查显微镜下的滴，晶体的外观和生长。

一旦晶体生长完成，轻轻取下含有晶体的玻璃盖玻片，并将其放在固体表面上，晶体滴朝上。轻轻添加 10 微升低温 A 溶液，通过移液轻轻混合，使晶体不接触。使用显微镜慢慢去除晶体中的一些液体，并保持约五到八微升溶液。

轻轻将 2.5 至 4 微升的低温 B 溶液添加到落液上，然后通过移液轻轻混合。用小 Petrie 盘盖住玻璃盖玻片，以避免直接气流在晶体上。等待五分钟后，在适当的基座上，从掉落的晶体中仔细挑选一个晶体。

在液氮中闪冻结晶体。然后将含有低温环的晶体存放在浸在德瓦瓶中的液氮中，直到同步加速器上准备进行 X 射线衍射。经过对几种不同IKK1变种的广泛试验，晶体通过一个截断构造获得，只有在IKK抑制剂XII存在的情况下才显示合适的X射线特性。

与已知的 IKK2 模型相比，低分辨率 X 射线数据与弱强度、非对称单元中的大量 IKK1 分子和 IKK1 单体-二元模型的构象变化相结合，使得难以获得分子替代溶液 IKK1 并确定其结构。不同的 IKK2 结构在其二元中指示不同的单体间向方向，因此，在两个不同的二元模型中，P578 的α碳之间的距离在 39 到 61 个焦虑之间变化。由于低分辨率的低温显微镜图和基于高分辨率 IKK2 结构生成的 IKK1 域的高精度模型，因此有可能获得有用的搜索模型。

初始模型显示激酶域相对于 IKK2 单体旋转 24 度的方向和 58 个焦虑的 N 端子开口方向。使用其中一个以 52- angstrom 开口作为模型的二元，在非对称单元中找到了六个二元。一旦掌握，这项技术可以在几个月内执行，如果它执行得当。

在尝试此程序时，重要的是要记住，获得可溶性、活性和良好表现的蛋白质是第一个关键步骤。看完这段视频后，您应该对需要详细遵循的所有步骤有一个良好的一般理解，以便成功地结晶和确定 IKK1 蛋白的结构。学习这个程序，仍然有其他EKK家族蛋白质的结构，也可以确定，以回答有关激酶-米托源信号的其他问题。