人源IKK1/α的制备、结晶及结构测定指南

本实验的目的是为人类IKK1-α蛋白的制备、结晶及结构解析提供指导，以阐明其信号传导功能的作用机制，并为合理药物设计建立平台。该方法有助于研究人员确定IKK1的结构，从而解答免疫信号传导领域中的一些关键问题。本技术描述了一条简化的途径，用于获得IKK蛋白的晶体——这类蛋白通常难以结晶，并提供了克服结构解析过程中瓶颈问题的多种关键信息。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为要获得毫克量级的可溶性良好且性质稳定的蛋白质，需要在昆虫细胞中进行表达，而结晶只能在非常狭窄的条件范围内实现。在解析IKK1结构时所采用的分子置换法也可能极具挑战性，尤其是由于晶体衍射性能较差，且在缺乏合适搜索模型的情况下，非对称单元中包含多个IKK1分子，进一步增加了难度。本次实验操作将由我实验室的学生Kyle Shumate和Sonjiala Hotchkiss进行示范。

第一天，在六孔板的每个孔中加入2毫升Sf903昆虫细胞培养基，接种Sf9细胞，并在27°C下培养。当细胞在悬浮液中的密度达到每毫升2至3×10⁶个细胞时，将其稀释至新鲜培养基中传代，接种密度约为6×10⁵个细胞/毫升。第二天，将8微升Sf9转染试剂溶于100微升SF-903或Grace's昆虫培养基中。

然后短暂涡旋混合物。在另一管中，将1微克试剂盒纯化的重组bacmid溶于100微升相同培养基中进行稀释。将稀释后的DNA与转染试剂混合。

室温孵育15至30分钟后，从孔中移除培养基。然后加入1毫升新鲜培养基。接着将稀释后的DNA转染试剂混合物逐滴加入细胞中，调整液滴大小，避免冲落贴壁细胞。

六小时后，在细胞上层加入 1.5 毫升新鲜培养基。将细胞在 27 摄氏度下孵育，每 12 小时定期观察孔内细胞，检查病毒侵染迹象。感染后 60 至 72 小时，在第五天移除含有细胞的培养基。

将培养基转移至离心管后，在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。离心结束后，保留上清液，即为P1病毒浓缩液。在第一天，将先前制备的His-IKK1细胞沉淀重悬于40 mL裂解缓冲液中。

将细胞悬液置于冰上，通过超声处理裂解细胞，超声参数为60%至70%的占空比，每次30秒，共5到10次脉冲，每次间隔大于1分钟。在4摄氏度下，以不小于28,000 g的离心力离心45分钟，澄清裂解液。根据文本方案制备镍-NTA琼脂糖树脂后，使用20毫升洗脱缓冲液，通过重力流洗脱His标签的IKK1 alpha蛋白。

收集1至1.5毫升的组分。合并含有目标蛋白的组分后，在4摄氏度下用TEV蛋白酶过夜消化样品。第二天早晨，在27摄氏度下，将蛋白与1毫摩尔ATP在氯化镁、β-甘油磷酸钠、氟化钠和正钒酸钠存在条件下孵育1小时。

孵育后，将蛋白质溶液通过0.45微米滤膜过滤。然后将约六毫升样品加载到连接至自动液相色谱系统的120毫升制备级尺寸排阻色谱柱上。平衡后，以每分钟一毫升的流速进行尺寸排阻色谱分离，并收集两毫升的组分。

运行过程中，在 280 和 254 纳米处监测洗脱情况。收集纯化组分后，按照生产商说明书，使用 30 千道尔顿分子量截留值的离心浓缩管进行浓缩。随后分装 25 微升浓缩蛋白样品，并在液氮中快速冷冻。

使用机器人将 80 至 100 微升的结晶试剂移液至 96 孔板的储液池中。利用结晶机器人，将 0.2 至 0.25 微升的 IKK1 及其抑制剂复合物与等体积的储液池溶液分配并混合。设置液滴后，立即用光学透明膜密封每块板，以防止蒸发。

将一块培养皿置于18摄氏度下孵育，另一块培养皿置于低温室中的4摄氏度下孵育。在最初七天内每天使用带偏振器的体视显微镜检查每滴液滴中是否出现晶体，之后以较长的时间间隔进行检查。按照前述方法制备IKK1及其抑制剂复合物后，将各孔溶液转移至24孔板的每个孔中。

取1至1.5微升的结晶溶液置于洁净的玻璃盖玻片上。向盖玻片中加入等体积的IKK1及其抑制剂复合物，通过上下吹打3至4次轻轻混匀。在板上各孔的环上涂抹油脂后，用镊子将盖玻片翻转并放置于相应的孔上。

然后通过按压盖玻片密封孔。将24孔板中的所有液滴设置完毕后，置于冷室中避光孵育。定期在显微镜下检查液滴，观察晶体的形成与生长情况。

晶体生长完成后，轻轻取出带有晶体的玻璃盖玻片，将其晶体液滴面朝上放置于固体表面。用移液器吸取10微升冷冻液A，轻轻加在液滴上方，并通过移液操作轻轻混匀，注意不要触碰晶体。在显微镜下，缓慢移除部分液体，保留约5至8微升溶液即可。

轻轻将2.5至4微升冷冻B溶液加入液滴中，并用移液器轻柔混匀。用一个小培养皿盖住玻璃盖玻片，以避免气流直接吹拂晶体。静置5分钟后，用安装在合适基座上的冷冻环从液滴中小心挑取单个晶体。

将晶体在液氮中快速冷冻。然后将含有晶体的冷冻环置于浸没于液氮中的杜瓦瓶内的样品托上，直至准备在同步辐射光源处进行X射线衍射实验。在对多种不同的IKK1变体进行了大量试验后，仅获得了一种截短型构建体的晶体，且该晶体仅在存在IKK抑制剂XII的条件下才表现出适合X射线衍射的性质。

低分辨率X射线数据与较弱的衍射强度、非对称单元中大量的IKK1分子，以及IKK1单体-二聚体模型相对于已知IKK2模型存在的构象差异，使得通过分子置换法获得IKK1的结构解析结果并确定其结构变得十分困难。不同的IKK2结构显示其二聚体中单体间的取向存在差异，导致在四个不同的二聚体模型中，两个激酶结构域中P578位点α碳原子之间的距离在39至61埃之间变化。由于存在低分辨率的冷冻电镜图谱，以及能够基于高分辨率IKK2结构构建出高精度的IKK1结构域模型，才使得获得可用于搜索的合适模型成为可能。

初始模型显示，激酶结构域相对于IKK2单体旋转了24度，N端开口为58埃。以具有52埃开口的二聚体之一作为模型，确定了不对称单元中的六个二聚体。一旦掌握，只要操作得当，该技术可在数月内完成。

在尝试该实验流程时，重要的是要牢记，获得可溶性好、具有活性且性质稳定的蛋白质是首要的关键步骤。观看本视频后，您应能全面了解为成功结晶并解析IKK1蛋白结构所需严格遵循的各个步骤。掌握该方法后，仍可进一步解析其他IKK家族蛋白的结构，以回答有关激酶-有丝分裂原信号通路的更多科学问题。