Name: 在体内人细胞 Rb 蛋白 sumo 的检测与分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学习在人细胞中检测视网膜母细胞瘤蛋白的SUMO化修饰方法。本实验使用HEK293细胞系，通过免疫沉淀和镍柱纯化技术，可在内源性和外源性条件下分析Rb蛋白的SUMO化动态变化。该方法适用于研究多种SUMO靶蛋白的翻译后修饰机制。

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本研究由上海市科学技术委员会（资助号：14411961800）和国家自然科学基金委员会（资助号：81300805）的资助项目支持。

1. 早G1期检测内源性Rb的SUMO化修饰
<ol>
	<li>细胞培养与细胞周期同步化。
	<ol>
		<li>将 HEK293 细胞维持在含有杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、1% 青霉素-链霉素（Pen-Strep）和 10% 胎牛血清（FBS）的生长培养基中，于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。</li>
		<li>将 HEK293 细胞同步至 G0 期。
		<ol>
			<li>使用血细胞计数板对 HEK293 细胞进行计数，并在处理前 24 小时，将约 1.5 ×&#160;107 个细胞接种于含 25 mL 生长培养基的 15 cm 培养皿中。当细胞融合度达到 70%–80% 时，吸除培养基，并用 5 mL 预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。</li>
			<li>加入含 1% 青霉素-链霉素的 25 mL DMEM，于 37 °C 培养 72 小时。用 3 mL 冰冷 PBS 将细胞从培养皿上洗下，转移至新的 5 mL 离心管中。</li>
			<li>取少量细胞用于流式细胞术进行细胞周期分析（步骤 1.2）；将剩余大部分细胞在室温下以 200 × g 离心 5 分钟收集，并储存于超低温冰箱中，待进行 Rb SUMO 化分析。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为获得 G1 期细胞，在完成 G0 期同步化后，移除 DMEM 并重新加入新鲜生长培养基，使 HEK293 细胞重新进入细胞周期。随后在不同 G1 期时间点（早期 G1：30 分钟；G1：2 小时）收集细胞，用于细胞周期分析及进一步的 SUMO 化检测。</li>
		<li>采用双胸苷阻断法将 HEK293 细胞同步至 S 期。
		<ol>
			<li>将 HEK293 细胞培养至约 50% 融合度，用预热 PBS 洗涤细胞，然后加入含 2.5 mM 胸苷的生长培养基，作用 18 小时（第一次阻断）。</li>
			<li>移除含胸苷的培养基，用预热 PBS 洗涤细胞两次，再加入新鲜生长培养基释放细胞，培养 14 小时。</li>
			<li>用移液器吸弃培养基，再次加入含 2.5 mM 胸苷的生长培养基，继续作用 18 小时（第二次阻断），随后进行细胞周期分析和 Rb SUMO 化检测。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于 G2/M 期同步化，将约 1.5 × 107 个 HEK293 细胞接种于含 25 mL 生长培养基的 15 cm 培养皿中，培养 24 小时。然后向培养基中加入诺考达唑，使其终浓度为 400 ng/mL。最后于 37 °C 培养 16 小时，再进行细胞周期分析和 Rb SUMO 化检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过流式细胞术进行细胞周期分析。
	<ol>
		<li>将同步化后的 HEK293 细胞重悬于 PBS 中，然后用冰上预冷的 70% 乙醇在 4 °C 固定 2 小时。注意：为尽量减少细胞聚集，应在轻柔涡旋条件下，将细胞悬液逐滴加入冰上预冷的 100% 乙醇中，以获得终浓度为 70% 的乙醇溶液。</li>
		<li>以 500 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，并用 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后重复离心步骤。</li>
		<li>向细胞中加入含 50 µg/mL 核酸染料碘化丙啶（propidium iodide）、0.1% Triton X-100 和 1 µg/mL 核糖核酸酶 A（RNase A）的 500 µL PBS，充分混匀。于 37 °C 孵育 15 分钟。</li>
		<li>将样品置于 4 °C 保存，待进行流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内源性 Rb 蛋白的免疫沉淀。
	<ol>
		<li>制备 HEK293 细胞裂解液。
		<ol>
			<li>通过将同步化后的 HEK293 细胞轻轻重悬于 1 mL 冰上预冷的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（表 1）中进行裂解，缓冲液中需新鲜添加 20 mM 的 N-乙基马来酰亚胺（N-Ethylmaleimide），该物质为异肽酶抑制剂，可抑制 SUMO 蛋白酶活性并稳定 SUMO 结合物。</li>
			<li>在冰上进一步通过 Dounce 匀浆器、超声处理或使用连接 2 mL 注射器的 21 号针头反复吹打 10 次，使细胞充分均质化。随后将样品在冰上孵育 5 分钟。 
			注意：RIPA 缓冲液中的阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）对于后续 Rb-SUMO 的检测至关重要，因其可消除 Rb 蛋白与其他非 Rb SUMO 化蛋白之间非共价相互作用所导致的非特异性 SUMO 信号。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 4 °C 下以 18,000 × g 离心 30 分钟，将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。 
		注意：本步骤可暂停。蛋白样品可在 -80 °C 下保存至少 6 个月。</li>
		<li>为后续 Western blot 实验准备各样品的输入对照（input control），取上述上清液的一小部分保存于新管中，并在 -80 °C 下储存。</li>
		<li>向上述上清液中加入 1 µg 与单克隆 Rb 抗体同种属、同亚型的非特异性小鼠免疫球蛋白 G（IgG），以及 20 µL 50% 蛋白 A/G-Sepharose 悬液。于 4 °C 轻柔旋转孵育 1 小时。</li>
		<li>在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 3 分钟，小心收集上清液，避免扰动沉淀珠，转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。向每份样品中加入 5 µL Rb 一抗和 40 µL 50% 蛋白 A/G-Sepharose 悬液，于 4 °C 轻柔旋转孵育过夜。</li>
		<li>在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 3 分钟收集沉淀珠，用移液器小心吸除上清液。注意：为避免珠子损失，切勿将珠子吸干。</li>
		<li>用 1 mL RIPA 缓冲液洗涤珠子四次，每次均在 4 °C 下旋转混匀 15 分钟。每次洗涤后以 3,000 × g 低速离心 3 分钟收集珠子，并弃去上清液。</li>
		<li>最后一次洗涤后，将珠子重悬于 30 µL 1× 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上样缓冲液（表 1）中，充分混匀。
		<ol>
			<li>将样品置于 100 °C 金属浴中加热 10 分钟。以 12,000 × g 离心 1 分钟使珠子沉淀。小心收集上清液，避免扰动珠子，转移至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过 4%–20% 梯度 SDS-PAGE 凝胶电泳和 Western blot 分析样品，或于 -20 °C 保存以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人类细胞中6XHis标签外源Rb蛋白SUMO化修饰的分析
<ol>
	<li>细胞培养与转染
	<ol>
		<li>接种约 6 × 106 在10 cm培养皿中培养HEK293细胞，在正常细胞培养条件下用生长培养基孵育24小时，使细胞融合度达到75%–85%。转染前，弃去生长培养基，加入6 mL预热的低血清培养基（参见 材料表然后将培养皿放回培养箱中。</li>
		<li>对于Rb组成型SUMO化检测，分别在1.5 mL微量离心管中，向500 µL低血清培养基加入15 µg的6XHis标签Rb-Ubc9-WT、Rb-Ubc9-C93S、Ubc9-WT和Ubc9-C93S质粒。
		<ol>
			<li>为了分析野生型 Rb 及其 SUMO 化缺陷型突变体的 SUMO 结合情况，将 10 µg 的 6XHis 标签 Rb-WT 或 Rb-K720R 质粒与 GFP-SUMO1（10 µg）在 1.5 mL 微型离心管中加入 500 µL 低血清培养基中混合13.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>同时，在另一个离心管中，混合50 µL转染试剂（参见 材料表在500 µL低血清培养基中重悬，并于室温孵育5 min。</li>
		<li>将上述两种分别制备的溶液充分混合，室温孵育15分钟。将转染试剂/质粒复合物加入细胞中，在5% CO₂条件下继续培养8小时。2 和 37 °C。</li>
		<li>将低血清培养基更换为完全培养基，转染后在正常培养条件下继续培养细胞48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>6XHis标签Rb蛋白的镍亲和沉淀
	<ol>
		<li>裂解转染的HEK293细胞，并按照第1.3.1节所述方法提取总蛋白。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 18,000 x g 离心细胞裂解液 30 分钟。小心收集上清液并转移至洁净的离心管中。 
		注意：蛋白质可在 -80 °C 冻存超过 6 个月。</li>
		<li>为后续的Western blot准备每个样本的输入对照，将上述上清液的一小部分保存至新管中，并于-80 °C保存。</li>
		<li>在1.5 mL微量离心管中，每份样品用RIPA缓冲液洗涤25 µL的50%镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖珠两次。在4 °C下以3,000 x g离心3 min，收集珠子。</li>
		<li>向每个样品中加入1 M咪唑，使其终浓度为10 mM。然后将每个样品加入含有已制备的Ni-NTA琼脂糖珠的离心管中。</li>
		<li>将珠子与裂解液在 4 °C 下轻柔旋转孵育 2 小时。在 4 °C 下以 3,000 x g 离心 3 分钟，然后用移液器小心吸除上清液。为避免珠子损失，请勿将珠子完全吸干。</li>
		<li>用含有 20 mM 咪唑的 1 mL 洗涤缓冲液洗涤珠子（表1每次在4 °C下旋转混匀15分钟。在4 °C下以3,000 x g离心3分钟收集珠子，并弃去上清液。</li>
		<li>最后一次洗涤后，加入含有 250 mM 咪唑的 30 µL 洗脱缓冲液（表1向每个样品中加入适量溶液并轻轻振荡混匀。然后在 4 °C 下孵育 20 分钟，以洗脱蛋白质。</li>
		<li>将每个样品与6× SDS-PAGE上样缓冲液混合（表1然后，将试管置于加热块中在100 °C下孵育10分钟。</li>
		<li>在12,000 × g离心1分钟以沉淀磁珠。小心收集上清液，避免扰动磁珠，并将样品转移至1.5 ml微量离心管中。样品可直接用于Western blot分析，或于-20 °C保存以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 蛋白质印迹
<ol>
	<li>将此前步骤获得的免疫沉淀或拉下样品上样至4-20%梯度SDS-PAGE凝胶中，在120 V条件下电泳90分钟，以实现蛋白质分离。</li>
	<li>采用槽式转移法，在4 °C、300 mA条件下电转印90分钟，将凝胶中的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用含5%脱脂奶粉的封闭缓冲液（表1）在室温下封闭PVDF膜1小时。</li>
	<li>在含3%牛血清白蛋白（BSA）的抗体稀释缓冲液（表1）中，4 °C孵育一抗过夜。一抗工作浓度建议为：0.5 µg/mL（抗SUMO1抗体），或1:2000（抗Rb和抗Tubulin抗体），或1:5,000（抗GFP和抗His抗体）。</li>
	<li>使用1×含Tween的Tris缓冲盐水（TBST）缓冲液（表1）洗涤膜3次，每次10分钟。将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的种属特异性二抗在含5%脱脂奶粉的封闭缓冲液（表1）中按1:5,000稀释后孵育。再次使用1× TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。</li>
	<li>将膜与增强型化学发光（ECL）工作液孵育。用保鲜膜包裹膜，并根据信号强度决定曝光X射线胶片的时间。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种在人类细胞中检测和分析内源性Rb蛋白SUMO化修饰的实验方案。由于该方法专门针对内源性Rb蛋白，且不改变整体SUMO相关信号，因此是在完全自然的生理条件下研究Rb蛋白SUMO修饰的重要工具。
为实现这一目标，需注意以下几点：1）尽管SUMO包含四种亚型（SUMO1-4，每种由不同的基因编码），但与泛素化相比，所有SUMO蛋白的丰度均显著较低；2）对于大多数SUMO靶蛋白而言，在稳态下仅有少量特定蛋白发生SUMO化修饰，这是SUMO连接酶与去连接酶之间持续竞争的结果14,21；3）SUMO靶蛋白可经历快速的SUMO化与去SUMO化循环。例如，本文作者近期获得的数据表明，Rb-SUMO1仅在G1早期存在极短的时间窗口，这与SUMO化是一种可逆且高度动态的过程这一概念一致13。上述因素均使得直接检测特定蛋白的内源性SUMO化修饰具有挑战性。因此，成功检测该修饰的关键在于明确其发生的精确条件。例如，在本方案中，细...

真核细胞中细胞周期进程的精确调控依赖于一个严密的调控网络，该网络确保特定事件按有序顺序发生1,2。该网络中的关键调控因子之一是视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白，这是首个被克隆的肿瘤抑制因子1,3。Rb蛋白被认为是一种细胞周期进程的负调控因子，尤其在G0/G1期向S期转换以及肿瘤生长过程中发挥重要作用4,5。Rb功能的缺失可直接导致儿童中最常见的眼内恶性肿瘤——视网膜母细胞瘤，或促进多种其他类型癌症的发生5。此外，Rb还参与多种细胞通路，包括细胞分化、染色质重塑以及线粒体介导的细胞凋亡3,6,7。
翻译后修饰在调控RB功能中起着关键作用8，9。磷酸化就是其中一种修饰，通常导致Rb失活。在静止的G0期细胞中，Rb处于活性状态且磷酸化水平较低。随着细胞进入G0/G1期，Rb被一系列周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDKs）和周期蛋白（如cyclin E/CDK2和cyclin D/CDK4/6）依次高度磷酸化，从而使Rb失活，并消除其抑制细胞周期相关基因表达的能力4，10。Rb还可被小泛素样修饰蛋白（SUMO）修饰11，12，13。
SUMO 是一种类泛素蛋白，可共价结合到多种靶蛋白上。它在多种细胞过程中起关键作用，包括细胞周期调控、转录、蛋白质的细胞定位与降解、转运以及 DNA 修复14,15,16,17,18。SUMO 共价修饰通路包括二聚体 SUMO E1 激活酶 SAE1/UBA2、单一的 E2 结合酶 Ubc9、多种 E3 连接酶以及特异性的 SUMO 蛋白酶。通常，新生的 SUMO 蛋白必须经过蛋白水解加工以生成成熟形式。成熟的 SUMO 由 E1 异源二聚体激活后转移至 E2 酶 Ubc9。最终，SUMO 的 C 末端甘氨酸共价连接至底物蛋白上的赖氨酸残基，该过程通常由 E3 连接酶促进。特异性的蛋白酶可将 SUMO 从修饰后的底物上切除。本文作者先前的研究表明，Rb 蛋白的 SUMO 化修饰可增强其与 CDK2 的结合，导致在 G1 早期阶段发生过度磷酸化，这一过程对细胞周期的推进至关重要13。我们还证明，Rb 蛋白 SUMO 化的缺失会导致细胞增殖能力下降。此外，最近的研究表明，Rb 的 SUMO 化修饰可保护其免遭蛋白酶体介导的降解，从而提高细胞中 Rb 蛋白的水平19。因此，SUMO 化修饰在 Rb 蛋白参与的多种细胞功能中发挥着重要作用。为了进一步研究 Rb SUMO 化修饰的功能后果及其生理相关性，建立一种有效的方法来分析人细胞或患者组织中 Rb 蛋白的 SUMO 修饰状态显得尤为重要。
SUMO化是一种可逆且高度动态的过程。因此，通常很难在完全内源性条件下检测到SUMO修饰的蛋白质。本文介绍了一种检测内源性Rb蛋白SUMO化的方法。此外，还展示了如何检测外源性Rb蛋白的SUMO化，包括野生型Rb及其SUMO缺陷型突变体11。Jacobs 等 特别描述了一种通过Ubc9融合导向SUMO化（UFDS）特异性增强特定底物SUMO修饰的方法20。基于该方法，本实验方案详细说明了如何分析强制性Rb SUMO化及其功能后果。鉴于已有数百种SUMO底物被报道，并且许多基于蛋白质组学的实验已鉴定出更多潜在的SUMO底物，本方案可用于分析这些蛋白在人源细胞中的SUMO修饰情况。

<table><tbody><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>胸腺嘧啶</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸酶A&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-乙基马来酰亚胺</td><td>Sigma</td><td>E3876&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 替代物（NP-40）</td><td>AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>小鼠免疫球蛋白G（IgG）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Rb 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9309</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G-Sepharose 琼脂糖珠</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖珠</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% 梯度 SDS-PAGE 凝胶</td><td>BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>聚偏二氟乙烯（PVDF）膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>微管蛋白抗体</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>SUMO1 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）二抗</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>增强型化学发光（ECL）试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

体内检测与分析人细胞中rb蛋白的sumo化修饰

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

蛋白质的翻译后修饰对于细胞内信号转导的精确调控至关重要。在这些修饰中，小泛素样修饰物（SUMO）是一种类似泛素的蛋白质，可共价结合到多种靶蛋白的赖氨酸残基上，从而调控基因转录、DNA修复、蛋白质相互作用与降解、亚细胞转运以及信号转导等细胞过程。检测蛋白质SUMO化最常用的方法基于在细菌中表达和纯化重组标签蛋白，以实现对SUMO化事件的分析 体外 一种简单且适用于解决机制问题的生化反应。然而，由于SUMO化过程的复杂性 体内在细胞内检测和分析蛋白质的SUMO化修饰具有较大挑战性，尤其是在内源性条件下。本文作者近期的一项研究发现，内源性的视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, Rb）蛋白——一种对细胞周期进程起负向调控作用的关键肿瘤抑制蛋白——在G1早期阶段会发生特异性的SUMO化修饰。本文介绍了一种在人源细胞中检测和分析Rb蛋白在内源性和外源性条件下SUMO化修饰的实验方案。该方案适用于在人源细胞中对Rb蛋白的SUMO化修饰进行表型与功能研究，同时也可广泛应用于其他多种SUMO化靶蛋白的相关研究。

为了检测细胞周期进程中内源性Rb蛋白的SUMO化修饰，本研究首先按照本文方案部分所述，将HEK293细胞同步于细胞周期的五个不同阶段（G0、早期G1、G1、S和G2/M）。通过使用碘化丙啶对核酸进行染色，并结合流式细胞术分析，确认了细胞同步化的质量（图1）。随后，收集细胞并用变性RIPA缓冲液裂解。实验中加入SUMO蛋白酶抑制剂N-乙基马来酰亚胺，使其终浓度为20 mM，以在实验过程中维持天然的SUMO信号。在变性条件下对内源性Rb蛋白进行免疫沉淀，以阻断非共价的非特异性相互作用，再经抗SUMO1抗体进行后续的蛋白质印迹分析，结果特异性地在早期G1阶段检测到SUMO信号（图2）。尽管在S/G2/M阶段整体SUMO化水平升高，但在Rb蛋白发生SUMO化的时间点，其修饰水平并未发生变化（图2，上样对照面板）。该结果提示，Rb蛋白的SUMO化并非全局SUMO连接活性改变的简单结果。因此，这些结果表明，...

小泛素样修饰蛋白（SUMO）家族蛋白可共价结合至靶蛋白的赖氨酸残基，从而调控多种细胞过程。本文介绍了一种在人源细胞中检测视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白在内源性和外源性条件下发生SUMO化修饰的实验方案。

体内检测与分析人细胞中Rb蛋白的SUMO化修饰

蛋白质的翻译后修饰对于细胞内信号转导的正常调控至关重要。在这些修饰中，……

本实验的总体目标是在人源细胞中检测视网膜母细胞瘤蛋白在内源性和外源性条件下的SUMO化修饰。小泛素样修饰蛋白（SUMO）家族蛋白可共价连接至靶蛋白的赖氨酸残基，从而调控多种细胞过程。通常情况下，由于SUMO化修饰在体内的复杂性，在细胞中启动蛋白质SUMO化修饰更具挑战性。本实验检测内源性和外源性Rb蛋白的SUMO化修饰。尽管该方法可用于研究Rb蛋白的SUMO化，但也适用于检测细胞中许多其他SUMO靶蛋白。首先，加入25毫升含1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，并将HEK293细胞在37°C下培养72小时。用三毫升冰冻的 PBS 将细胞从培养板上冲洗下来，然后将细胞转移至一个新的五毫升离心管中。为了在 G0 期同步化过程结束时获得处于 G1 期的细胞，需移除 DMEM 并重新加入新鲜培养基，从而使 HEK293 细胞重新进入细胞周期。然后收集处于不同G1期的细胞，用于细胞周期分析及进一步的SUMO化检测。为将HEK293细胞同步于S期，采用双胸腺嘧啶阻断法。首先，将HEK293细胞培养至50%汇合度，然后用预热的PBS洗涤细胞。加入含有2.5毫摩尔胸腺嘧啶的生长培养基，作用18小时，作为第一次阻断。移除含胸腺嘧啶的培养基，用预热的PBS洗涤细胞两次。加入新鲜生长培养基，培养14小时，以解除细胞阻断。解除第一次阻断后，用移液器弃去培养基。然后加入含有2.5毫摩尔胸腺嘧啶的生长培养基，继续培养18小时，作为第二次阻断，随后进行细胞周期和Rb蛋白SUMO化分析。对于G2或M期的细胞同步化，将约1500万个HEK293细胞接种于直径15厘米的培养皿中，加入25毫升生长培养基，培养24小时。然后向培养基中加入尼古替索，直至终浓度达到400纳克/毫升。最后，将细胞孵育16小时，随后按照文本方案中所述，通过流式细胞术分析细胞周期。通过在1毫升预冷的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液中轻轻重悬同步化的HEK293细胞来进行裂解，裂解缓冲液中需新鲜添加异肽酶抑制剂，以阻断SUMO蛋白酶并稳定SUMO偶联物。将细胞在冰上进一步匀浆，用连接2毫升注射器的21号针头反复抽吸10次。然后将细胞在冰上孵育5分钟。接下来，在4°C条件下，以18000 × g离心细胞裂解物30分钟。离心后，将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。向上清液中加入一微克与单克隆Rb抗体相同物种和同种型的非特异性小鼠免疫球蛋白G。同时加入20微升50%蛋白AG琼脂糖悬液，然后在4摄氏度下轻轻旋转孵育一小时。在 4°C 条件下，以 3000 × g 离心样品 3 分钟。小心收集上清液，避免扰动磁珠，并将其转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。向每个样品中加入 5 µL rb 一抗和 40 µL 50% 蛋白 A/G Sepharose 悬液，然后在 4°C 轻柔旋转孵育过夜。离心后，用一毫升利福平缓冲液洗涤磁珠。将离心管在4°C下旋转混匀15分钟。然后同前法进行低速离心收集磁珠，并弃去上清液。洗涤四次后，将磁珠重悬于30 µL 1×十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液中，充分混匀。将离心管置于95–100 °C金属浴中孵育10分钟。以12,000 ×g离心1分钟，使磁珠沉淀。最后，小心收集上清液，避免扰动磁珠，并将其转移至1.5 mL微量离心管中。按照文本方案所述，进行HEK293细胞的细胞培养转染及细胞裂解。然后，在1.5 mL微量离心管中，用RIPA缓冲液洗涤25 µL的50%镍-次氮基三乙酸琼脂糖珠，每个样品处理一次。在4°C条件下，以3000 × g离心3分钟收集珠子。向每个样品中加入1 M的EMYTOZOL，使其终浓度为10 mM。然后将每个样品加入含有已制备琼脂糖珠的离心管中。将珠子与裂解液在4°C下轻轻旋转孵育两小时。然后在4°C下以3,000 × g离心3分钟。离心后，用移液器小心吸去上清液。为避免磁珠损失，请勿将磁珠完全吸干。随后，用一毫升含有20毫摩尔依米唑的洗涤缓冲液洗涤磁珠。将各管在4摄氏度下旋转混合15分钟，然后通过离心收集磁珠。最后一次洗涤后，向每个样品中加入 30 微升含有 250 毫摩尔 emitozol 的 Eleusian 缓冲液，并轻轻弹击混匀。然后将样品在 4 摄氏度孵育 20 分钟，以洗脱蛋白质。每个样品用六倍体积的 SDS-PAGE 上样缓冲液混合。然后将离心管置于金属浴中，在 100 摄氏度下孵育 10 分钟。离心后，将免疫沉淀或拉下样品上样至 4% 至 20% 的梯度 SDS-PAGE 凝胶。以 120 伏电压电泳 90 分钟，以分离蛋白质。在细胞周期同步化及内源性Rb蛋白的免疫沉淀后，通过抗SUMO1抗体在G1早期特异性检测到SUMO信号。代表性结果表明，通过将SUMO E2酶UBC9直接融合至Rb蛋白的C末端，可强制实现Rb蛋白的SUMO化修饰。请注意迁移最慢的SUMO化Rb蛋白条带。通过使用rb蛋白的SUMO缺陷型突变体K720R，进一步证实了细胞中rb蛋白存在SUMO化修饰。因此，在本实验流程中，可在培养细胞中分析许多其他SUMO化靶蛋白。大多数情况下，仅有极小部分底物蛋白发生SUMO化，因此在进行该实验时，优化免疫沉淀效率至关重要。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在体内人细胞 Rb 蛋白 sumo 的检测与分析

SUMO化检测实验：一种通过免疫印迹法体外检测底物蛋白SUMO化状态的技术

比率型双分子信标（RBMBs）可用于在活细胞中对单个工程化RNA转录本进行成像。本文中，我们描述了RBMBs的制备与纯化方法，通过微孔电穿孔将RBMBs递送至细胞，以及实时荧光成像单个RNA转录本的过程。...

活细胞中利用比率型双分子信标对单个工程化RNA转录本进行实时成像

本文描述了在芽殖酵母Saccharomyces...

一种可检测出芽酵母着丝粒蛋白 Ndc10 和 Ndc80 发生 SUMO 化与泛素化修饰的蛋白质纯化技术

蛋白质-蛋白质相互作用可发生在细胞的细胞核和细胞质中。为了研究这些相互作用，通常采用传统的共免疫沉淀法和现代的邻近连接技术。在本研究中，我们比较了这两种方法，以可视化NF90-RBM3相互作用在细胞核和细胞质中的分布情况。...

通过免疫共沉淀法在核组分和胞质组分中可视化蛋白质-蛋白质相互作用 原位 邻近连接实验

我们描述了一种利用紫外光介导的光交联和质谱技术在活细胞中鉴定RNA结合蛋白并绘制其RNA结合区域的实验方案。...

基于质谱的RNA结合区域鉴定的样品制备

与泛素连接酶不同，目前已鉴定的E3 SUMO连接酶数量较少。这种修饰 体外 SUMO化实验方案能够通过以下方法鉴定新的SUMO E3连接酶 体外...

体外 SUMO化检测法用于研究SUMO E3连接酶活性

本文介绍了一种显性负性可诱导系统的构建方案，该系统可通过可逆地过表达目标蛋白的显性负性突变体，从而实现对任意蛋白的条件性失活。...

可诱导且可逆的显性负效应（DN）蛋白抑制

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利用荧光Sumo捕获蛋白定位SUMO化修饰蛋白

本文介绍了一种利用SUMO结合元件（SUBEs）从人肝癌细胞以及肝细胞癌小鼠模型获得的肝肿瘤组织中，在体内富集、分离、鉴定和表征经SUMO修饰蛋白的实验方案。...

用于肝癌中SUMO蛋白组富集、分离、鉴定与表征的SUMO结合元件（SUBEs）工具

本方案旨在建立泛素（Ub）和泛素样蛋白（Ubls）的特异性蛋白质组，以鉴定与特定条件（如处理方式或表型）相关的这类翻译后修饰（PTMs）的变化。...

泛素及泛素样蛋白依赖性翻译后修饰的分析及显著变化的鉴定

这些方案提供了在细胞中评估蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）家族各个成员酶活性的方法学。文中详细描述了利用内源性和外源性生物标志物、识别甲基化精氨酸的抗体以及抑制剂工具化合物来评估PRMT活性的具体操作指南。...

研究细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶1-9活性的定量方法

学习在人细胞中检测视网膜母细胞瘤蛋白的SUMO化修饰方法。本实验使用HEK293细胞系，通过免疫沉淀和镍柱纯化技术，可在内源性和外源性条件下分析Rb蛋白的SUMO化动态变化。该方法适用于研究多种SUMO靶蛋白的翻译后修饰机制。

体内检测与分析人细胞中Rb蛋白的SUMO化修饰

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