在三维环境中表征细胞迁移 体外 伤口环境

本实验的总体目标是观察特定处理因素对三维伤口相关纤维蛋白支架中细胞迁移的影响。该方法有助于解答伤口愈合领域中的关键问题，例如纤维网络结构的改变如何影响细胞向伤口部位纤维蛋白凝块的迁移。该技术的主要优势在于，它提供了一种简单且可重复的方法，用于分析三维环境中纤维蛋白凝块内的细胞迁移。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为类球体的转移操作较为困难。

首先，在37摄氏度水浴中复温一管冻存的新生人真皮成纤维细胞。当细胞刚刚解冻时，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于新鲜的新生人真皮成纤维细胞培养基中，调整细胞浓度为每毫升1×10⁶个细胞。随后将细胞接种至T75培养瓶中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养72小时。

当细胞培养至80%融合度时，用5毫升胰蛋白酶EDTA消化细胞。在37摄氏度作用5分钟后，加入5毫升预温的培养基中和胰蛋白酶，并将40微升细胞悬液与台盼蓝按1:1比例混合。保留10微升细胞悬液用于计数。

通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于浓度为每毫升1.25 × 10⁵个细胞的溶液中。接着，用5毫升无菌PBS铺满10厘米培养皿的底部。然后将培养皿盖子倒置，在其内表面滴加多个20微升的细胞悬液液滴。

当所有液滴放置完毕后，将皿盖重新倒扣回培养皿上，注意不要震落悬滴，并轻轻将培养皿放入37摄氏度的培养箱中孵育72小时。孵育结束后，在48孔板中每孔每个球体加入100微升凝块溶液，轻轻振荡并轻敲培养板，确保纤维蛋白凝块混合物覆盖整个孔底。将培养板放入培养箱中继续孵育1小时。

当凝块层聚合后，在光学显微镜下确认悬滴培养物中类球体的存在，并将48孔板和悬滴培养皿转移至细胞培养操作台。小心翻转培养皿盖，以接触悬滴培养物，使用配备21号针头的1毫升注射器，将每滴悬滴转移至各纤维蛋白包被的孔中。在吸取和接种类球体时需格外小心，因为该操作过程中最困难且最关键的步骤是转移类球体时避免其破坏。

在显微镜下观察培养板，确认类球体已正确接种至相应的孔中。将 100 µL 新鲜配制的凝块溶液轻轻覆盖到每个含有类球体的液滴上，然后再次在显微镜下观察类球体，以确认其仍保持完整并位于每孔中央。随后将 48 孔板放回培养箱中，使第二层纤维蛋白原凝块聚合。

孵育1小时后，向每个孔中加入500微升对应实验类球体组的适当培养基，并将培养板放回37摄氏度的培养箱中。使用z轴层扫技术，通过明场显微镜每24至72小时获取一次类球体的图像，以观察三维细胞培养物的连续横截面。随后，在合适的图像分析软件中，追踪每个类球体在各个连续时间点的细胞边界，并使用测量功能计算每个类球体面积的百分比增加量。

在含有目标促迁移或抗迁移因子的培养条件下，可通过明场显微成像确定类球体的初始面积，并以此作为参考，用于评估在各个后续时间点类球体细胞向外生长的程度。在此项代表性实验中，经促迁移因子处理的类球体，其细胞从原始类球体结构向外迁移的程度显著高于经迁移抑制剂或对照因子处理的类球体。相反，经抗迁移因子处理的类球体，其细胞从原始类球体结构向外迁移的程度显著低于经对照处理的类球体。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在两个半小时内完成（不包括细胞培养时间）。观看本视频后，您应能够充分理解如何培养并包埋细胞球体，以进行三维体外细胞迁移实验。在完成本实验步骤后，还可进一步采用组织学和免疫组织化学等方法，探究凝块中纤维蛋白网络结构或细胞球体内肌动蛋白排列方式与细胞迁移能力增强或减弱之间的关联。

请注意，操作细胞培养物和针头可能具有极高危险性，进行本实验时必须采取相应预防措施，例如佩戴适当的个人防护装备，并在无菌培养罩内操作。