表征细胞迁移在三维体外伤口环境
August 16th, 2017
本议定书的目标是评估 pro 和反 migratory 因素影响三维纤维蛋白矩阵内的细胞迁移。
该程序的总体目标是观察感兴趣的特定处理对三维伤口相关纤维蛋白支架中细胞迁移的影响。该方法可以帮助回答伤口愈合领域的关键问题，关于纤维网络结构的改变如何影响细胞迁移和伤口部位的纤维蛋白凝块，该技术的主要优点是它提供了一种简单且可重复的方法，用于分析 3D 纤维蛋白凝块内的细胞迁移。通常，不熟悉这种方法的人会很困难，因为转移球体可能很困难。
首先在 37 摄氏度的水浴中加热一小瓶冷冻的新生人真皮成纤维细胞。当细胞刚刚解冻时，通过离心收集它们，并将沉淀以 1 x 10 至每毫升第 6 个细胞的浓度重新悬浮在新鲜的新生儿人真皮成纤维细胞培养基中。然后将细胞接种在 T75 培养瓶中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 72 小时。
当培养物达到 80% 汇合时，用 5 毫升胰蛋白酶 EDTA 分离细胞。在 37 摄氏度下放置 5 分钟后，用 5 毫升温热的培养基中和胰蛋白酶，并将 40 微升细胞与台盼蓝以 1：1 的比例混合。保留 10 微升等分试样的细胞用于计数。
通过离心收集细胞，并以 1.25 x 10 的浓度重悬沉淀至第 5 个细胞/毫升。接下来，在 10 厘米的培养皿底部铺上 5 毫升无菌 PBS。然后倒置培养皿盖，在盖子的内表面加入多滴 20 微升细胞悬液。
放置所有液滴后，将盖子重新倒置到培养皿上，注意不要滑落悬液滴，并将培养皿轻轻放入 37 摄氏度的培养箱中 72 小时。在孵育结束时，向 48 孔板中加入每个球体 100 微升凝块溶液，然后轻轻摇动并敲击板，以确保纤维蛋白凝块混合物覆盖整个孔。将板放入培养箱中 1 小时。
当凝块层聚合后，在光学显微镜下确认悬滴培养物中存在球体，并将 48 孔板和悬滴培养皿转移到细胞培养罩中。小心地倒置培养皿盖以接触悬滴培养物，并使用配备 21 号针头的 1 毫升注射器将一滴转移到每个纤维蛋白包被的孔中。在吸取和电镀球体时，我会格外小心，因为过程中最困难和最关键的步骤是在不破坏球体的情况下转移球体。
在显微镜下检查板，以确认球体已正确接种到适当的孔中。将 100 微升新鲜制备的凝块溶液轻轻地分层到每个含有液滴的球体上，并在显微镜下重新检查球体，以确认它们仍然完整并位于每个孔的中心。然后将 48 孔板放回培养箱中，让第二层纤维蛋白聚合。
一小时后，用 500 微升相应实验球状体组的适当培养基处理每个孔，并将板放回 37 摄氏度的培养箱中。每 24 至 72 小时通过明场显微镜获取球状体的图像，使用 z 堆栈查看 3D 细胞培养物的连续横截面。然后，在适当的图像分析软件中，在每个连续时间点追踪每个球体的细胞边界，并使用测量功能访问每个球体的面积增加百分比。
在它们培养之后，在感兴趣的促迁移剂或抗迁移剂中，可以通过明场显微成像确定球体的初始区域，并用作确定在每个连续时间点从球体中随后细胞生长的程度的参考。在这个代表性实验中，与暴露于迁移抑制剂或对照剂的球体相比，暴露于促迁移剂的球体表现出从原始球体迁移的程度显着增加。相反，与对照处理的球体相比，暴露于抗迁移剂的球体表现出从原始球体迁移的程度显著降低。
一旦掌握，如果作得当，该技术可以在两个半小时内完成，不包括细胞培养时间。观看本视频后，您应该对如何培养和包埋细胞球体进行三维体外细胞迁移检测有了很好的了解。在此程序之后，可以执行其他方法，如组织学和免疫组织化学，以回答有关凝块内的纤维蛋白网络结构或球状细胞中的肌动蛋白排列如何对应于细胞迁移增加或减少的其他问题。
不要忘记，使用细胞培养物和针头可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的防护设备和在无菌培养罩中工作。
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概述
本协议旨在评估促进和抑制迁移因子对三维纤维蛋白基质中细胞迁移的影响。它提供了有关纤维网络结构的变化如何影响伤口愈合中的细胞迁移的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞迁移
- 伤口愈合
- 纤维蛋白基质分析
背景
- 细胞迁移对于伤口愈合至关重要。
- 纤维蛋白凝块在伤口愈合过程中起着重要作用。
- 了解不同治疗对细胞迁移的影响可以增强治疗策略。
- 该方法允许在三维环境中重复分析细胞行为。
研究目的
- 观察特定治疗对细胞迁移的影响。
- 调查纤维蛋白的结构变化如何影响细胞运动。
- 为在三维纤维蛋白支架中研究细胞动力学提供可靠的方法。
使用的方法
- 新生儿人皮肤成纤维细胞的解冻。
- 细胞在培养基中的离心和重新悬浮。
- 将细胞接种在T75培养瓶中进行孵育。
- 观察细胞在纤维蛋白基质中的迁移。
主要结果
- 证明了在三维纤维蛋白凝块中分析细胞迁移的可行性。
- 确定了影响伤口愈合中细胞运动的关键因素。
- 为未来的研究提供了一种可重复的方法。
- 突出了新用户在转移球体时面临的挑战。
结论
- 该协议为研究细胞迁移提供了一个有价值的工具。
- 了解细胞运动的动力学可以为治疗方法提供信息。
- 进一步的研究可以在这种方法的基础上探索影响迁移的其他因素。
常见问题
Executive Industry Relevance
This 3D fibrin-based migration assay addresses the translational gap between oversimplified 2D scratch assays and physiologically relevant wound healing models. By enabling quantitative analysis of spheroid outgrowth in a fibrin matrix, it supports mechanistic de-risking of pro- and anti-migratory compounds in preclinical discovery. The method enhances predictive confidence when prioritizing targets for wound healing and fibrosis indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on cell migration pathways within a disease-relevant extracellular matrix.
- Operational Value: Provides reproducible quantification of spheroid area changes to validate migratory phenotypes.
- Predictive Value: Enables functional target de-risking by correlating compound treatment with directional cell outgrowth in 3D.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fibrin-coated wells compatible with high-content brightfield imaging and z-stack analysis.
- Quantitative Output: Delivers time-resolved percent increase in spheroid area as a measurable migration endpoint.
- Scalability: Supports multi-well plate formats for dose-response screening of migratory modulators.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models fibroblast migration in fibrin-rich wound environments, aligning with dermal repair and fibrosis pathways.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo studies by replicating key structural and biochemical cues of wound clots.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria based on migration inhibition or stimulation thresholds in a physiologic context.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for compounds modulating cell motility in tissue repair.
- Discovery Biology: Tests mechanistic effects of genetic or pharmacological perturbations on migration in a 3D matrix.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assessment of compound effects on spheroid outgrowth over 24–72 hour intervals.
- Analytics: Provides image-based morphometric readouts (area expansion) to compare migratory responses across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro migration data to preclinical models by preserving fibrin matrix composition and cellular interactions.
- Enterprise Reuse: Establishes a plug-and-play platform for evaluating migratory phenotypes across cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases physiological relevance of migration assays, reducing false positives from 2D artifacts.
- Operational Value: Standardizes spheroid embedding and fibrin polymerization for inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves early prediction of compound efficacy in wound healing, lowering attrition in later stages.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of migratory targets based on quantifiable 3D responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hanging drop spheroid formation and fibrin handling.
- Depends on sterile technique and precise spheroid transfer using syringe and needle to avoid shear damage.
- Necessitates standardized brightfield microscopy and image analysis software for consistent morphometric tracing.
- Adaptation to other cell types may require optimization of spheroid size and fibrin concentration.
- Limited by the technical challenge of spheroid transfer, which affects throughput and reproducibility for novice users.
