Name: 表征细胞迁移在三维体外伤口环境 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 了解三维纤维蛋白基质中细胞迁移的分析方法，用于研究伤口愈合过程中纤维网络结构变化对细胞运动的影响。该技术为研究细胞动态行为提供了可重复的实验工具。

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本研究工作由美国心脏协会（16SDG29870005）和北卡罗来纳州立大学研究与创新种子基金资助。

1. 第1天：细胞与试剂准备
注意：所有细胞和试剂的准备均应在生物安全柜中进行，以防止样本污染。
<ol>
	<li>将过滤后的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素置于 37 °C 水浴中预热。</li>
	<li>通过向预热的 DMEM 中添加 10% FBS、1% 青霉素/链霉素和 1% L-谷氨酰胺，配制新生人真皮成纤维细胞（HDFn）培养基。</li>
	<li>解冻一管冻存的 HDFn 细胞，在 200 × g 条件下离心 8 分钟以去除冷冻保存液。将细胞重悬于已配制的 HDFn 培养基中，细胞密度为 1 × 106 个细胞/mL，并接种至 T-75 培养瓶中。</li>
	<li>将培养瓶放入培养箱（37 °C，5% CO2）中，使细胞增殖。</li>
	<li>将 HDFn 培养基储存在 4 °C。</li>
	<li>根据需要配制促迁移和抗迁移试剂。</li>
</ol>
2. 第3天：类球体准备
<ol>
	<li>在超净工作台中进行以下操作，以防止样品污染。</li>
	<li>当细胞达到80%融合度时，吸除培养基，并加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。将培养瓶置于37 °C培养箱中孵育5分钟，使细胞完全从培养瓶表面脱落。</li>
	<li>向培养瓶中加入5 mL预热的培养基以中和胰蛋白酶。</li>
	<li>在微量离心管中，混合10 μL台盼蓝与10 μL细胞悬液。</li>
	<li>将原始细胞悬液在200 × g条件下离心8分钟。</li>
	<li>在细胞悬液离心的同时，取10 μL台盼蓝细胞悬液加入血细胞计数板，进行细胞计数。</li>
	<li>离心结束后，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于培养基中，调整细胞浓度至1.25 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>向10 cm培养皿底部加入5 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS），以维持球体生长期间的湿润环境。</li>
	<li>将培养皿盖倒置，在其内表面滴加数滴20 μL的细胞悬液。</li>
	<li>迅速再次将皿盖翻转并放回培养皿底部，注意避免震落悬滴。图1展示了成功形成的悬滴。</li>
	<li>小心将培养皿放入37 °C培养箱中，使球体在悬滴培养体系中生长72小时。</li>
</ol>
3. 第6天：将类器官包埋至3D基质中
<ol>
	<li>在培养罩内进行以下操作，以防止样品污染。</li>
	<li>为形成第一层纤维蛋白，配制足够体积的凝血溶液，按每孔100 μL的量加入所需数量的孔中（每孔一个类球体）。凝血溶液由10%体积的10X HEPES缓冲液（250 mM HEPES、1500 mM NaCl、50 mM CaCl2，pH 7.4）、2 mg/mL人纤维蛋白原和0.1 U/mL人α凝血酶组成。凝血溶液的其余部分由超纯水组成。
	<ol>
		<li>最后加入凝血酶，并迅速将溶液加入48孔板中所需孔内，以防止凝块在加入孔板前发生聚合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻轻振荡或轻敲孔板，确保纤维蛋白凝块混合物覆盖整个孔底，然后将孔板放入培养箱中孵育1小时，使底层凝块充分聚合。振荡时力度不宜过大以免产生气泡；只需适当摇动孔板，直至孔的整个表面被覆盖即可。若使用较大体积的凝块，此步骤可能无需进行。</li>
	<li>将类球体转移至纤维蛋白层上。
	<ol>
		<li>从培养箱中取出孔板以及含有悬滴培养类球体的培养皿，在显微镜下观察类球体，然后将培养皿放入培养罩内。</li>
		<li>小心地将培养皿盖翻转，以便接触悬滴培养液滴。</li>
		<li>使用连接1 mL注射器的21 G针头，小心地将一个液滴从翻转的皿盖转移至每个孔的中央，注意不要刺破已聚合的纤维蛋白层。为有效转移液滴，应缓慢将液滴吸入针头内。一旦整个液滴完全进入针头，即停止回抽活塞；回抽过度可能引入气泡，从而影响类球体的有效转移或后续成像。</li>
		<li>在显微镜下检查孔板，确认类球体已成功转移至所有目标孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为形成第二层纤维蛋白，使用与上述第一层纤维蛋白制备相同的方法（步骤3.2）配制另一份凝血溶液。小心地用移液器将100 μL溶液加至每个含有类球体的液滴上，再次在显微镜下观察，确保类球体仍保持完整，未被推至孔边缘。</li>
	<li>将孔板放回培养箱，孵育1小时，使第二层充分聚合。</li>
</ol>
4. 第6天：添加促迁移或抑制因子
<ol>
	<li>将HDFn培养基预热至37 °C。</li>
	<li>在生物安全柜中进行以下步骤，以防止污染。</li>
	<li>为每组准备培养基，包含待评估的促迁移或抗迁移试剂的适当浓度。</li>
	<li>从培养箱中取出培养板，放入细胞培养柜中。</li>
	<li>向对照类球体组的每个孔中加入500 μL标准培养基，向迁移抑制类球体组的每个孔中加入500 μL抑制性培养基，向促迁移类球体组的每个孔中加入500 μL促迁移培养基。</li>
	<li>将培养板放回培养箱中。</li>
	<li>每48小时更换一次培养基。</li>
</ol>
5. 第6-9天：细胞迁移和增殖的评估
<ol>
	<li>使用明场显微镜在添加培养基后立即（0 h）以及此后每24小时对类球体进行成像，持续72小时。可选：在每个时间点采集z轴层扫图像，以确定是否存在超出主要对焦平面的迁移现象。根据我们的经验，此类情况并未发生；然而，建议在每次实验中确认此现象不存在。</li>
	<li>使用 ImageJ 通过分析每个类球体在连续时间点的面积百分比增加来确定每个孔中的细胞外延生长，具体方法为追踪每个类球体在每个时间点的细胞边界，并利用该数据 &#34;测量&#34; 用于获取面积的函数。</li>
</ol>

<ol><li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li>
<li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+during+wound+repair%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案可用于通过伤口愈合相关细胞外基质研究细胞迁移 体外 三维模型。正确实施该操作的关键步骤是成纤维细胞球体的充分发育；在制备过程中，细胞浓度经过优化，使每滴初始浓度为2,500个细胞，从而在72小时的培养期内稳定形成球体。若使用的细胞数量不足，球体可能无法有效聚集，在转移并嵌入纤维蛋白层时易发生解体。若使用不同类型的细胞，可能需要调整初始细胞浓度和/或球体成熟时间，以实现一致且稳定的球体形成。对于增殖速度较成纤维细胞更慢的细胞类型，可能需要更高的初始细胞浓度，以确保在72小时内形成适当的球体。由于在培养过程中无法更换培养基，细胞在悬滴培养中的时间不应超过72小时。由于固有的生物学变异性，初始球体大小存在差异是正常现象；为应对这一变异性，我们通过以一致的细胞数量启动球体形成，尽可能减小大小差异，并通过随时间归一化生长数据，实现结果间的可比性。 
该方法实施过程中的主要挑战是将类球体从悬滴培养体系转移至凝块基质中。本方案采用针头和注射器从倒置的培养皿盖中吸取含有类球体的液滴，但也可使用其他方法，例如镊子或连接修整过枪头的微量移液器，有效实现类球体从悬滴到基质的转移。...

伤口愈合是一个复杂的过程，可在组织受损后恢复其完整性。该过程分为四个相互重叠的阶段：止血、炎症、增殖和重塑，每个阶段均由可溶性信号分子、细胞-基质相互作用和细胞间通讯的复杂组合所调控。1,2 这些信号的协调控制着伤口愈合过程中的多种细胞反应，其中尤为重要的是细胞迁移。3,4 细胞迁移是一个高度动态的过程，依赖于细胞表型以及细胞外基质微环境的生物化学和生物物理特性。5 细胞通过整合素介导的通路持续探测其细胞外基质环境，该过程使细胞能够感知多种基质特性，包括拓扑结构、刚度和空间限制。对细胞迁移的二维（2D）分析表明，迁移由前缘处片状伪足的形成所驱动，该过程依赖于肌动蛋白丝束的生成。随后在前缘形成局灶性黏附，结合肌动蛋白-肌球蛋白介导的收缩以及尾端回缩，共同推动细胞向前运动。6 三维（3D）细胞迁移目前尚不被充分理解，然而，最近的研究表明，3D迁移与前述的二维（2D）迁移机制存在显著差异，可能由不同的机制驱动。例如，Petrie等人的近期研究显示 等研究表明，根据细胞外基质（ECM）的特性，三维基质中的细胞可在片状伪足和叶状伪足驱动的迁移机制之间转换。7 由于细胞迁移是伤口愈合反应的关键组成部分，因此细胞迁移的三维模型对于理解伤口愈合过程中对各种刺激的生理反应至关重要。尽管已有研究表明，细胞在二维表面的迁移行为与在三维基质中的迁移存在显著差异，但目前大多数 体外 在伤口愈合过程中研究细胞迁移的模型，包括已广泛使用的划痕实验，均采用二维单层细胞培养。5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 近年来开发的检测方法虽已采用三维基质，但仍将细胞以单层形式培养于基质表面，因而限制了对细胞所处三维环境的真实再现能力 体内15
本文所述方法的目的是在具有生理相关性的三维模型中研究细胞迁移，而非在二维表面进行，以更深入地理解与施加刺激相关的迁移反应。该方法可用于评估在激活或抑制与细胞迁移相关信号通路的因素存在下，细胞在三维纤维蛋白凝块基质中的迁移情况。本方法选择纤维蛋白基质，是因为纤维蛋白在伤口愈合早期阶段具有关键作用；损伤发生后，伤口环境中会形成纤维蛋白凝块以阻止血液流失，并作为组织修复与重塑过程中初始细胞浸润的支架。2,16,17,18,19,20 此外，纤维蛋白在临床上被用作外科封闭剂，其封闭剂的组成已被证实与细胞迁移及最终愈合结果密切相关。Cox et al. 之前的一项研究通过使用不同浓度纤维蛋白和凝血酶构成的纤维蛋白凝块，研究成纤维细胞的迁移，旨在优化纤维蛋白封闭剂的性能。在这些研究中，定量分析了细胞从纤维蛋白凝块迁移至塑料培养皿的过程。20 本文介绍了一种可在三维纤维蛋白环境中定量分析细胞迁移的方法。尽管本方案中具体使用的是纤维蛋白，但该模型可轻松修改以使用其他基质材料，如胶原蛋白或其他三维基质。此外，本实验采用成纤维细胞球体，因为成纤维细胞向伤口床的迁移对细胞外基质合成及组织修复/重塑至关重要。然而，在修复过程中，中性粒细胞是首先进入伤口床的细胞类型，随后是巨噬细胞。成纤维细胞则在初始损伤约48小时后开始浸润伤口环境，即进入伤口愈合过程的增殖期初期。19 本实验方法可轻松调整，以包含中性粒细胞、巨噬细胞或其他细胞类型，用于评估纤维蛋白凝块结构变化对这些细胞类型迁移的影响。21
为实施该检测，首先采用对既往报道的干细胞培养技术进行改良的方法制备成纤维细胞球体。22 成纤维细胞球体随后被转移至三维纤维蛋白基质中，其外向生长可在数天内轻松监测和定量。该方案通过将三维细胞球体嵌入纤维蛋白基质中，充分考虑了生理系统的三维特性，从而避免了使用二维生长表面和细胞单层来模拟迁移行为时所存在的相关性局限，同时仍可在高度可控的条件下评估细胞行为。 体外 环境

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;材料&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含丙酮酸钠、不含L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基，4.5 g/L葡萄糖</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>含有L-谷氨酰胺的DMEM也可使用</td></tr><tr><td>100 mm 组织培养皿，未处理，无菌，无热原</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>任何尺寸的培养皿均可用于悬滴培养&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>来自美国农业部批准国家的胎牛血清，经热灭活、无菌过滤，细胞培养测试合格</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>如果使用已含 L-谷氨酰胺的 DMEM，则无需添加&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，稳定化，经无菌过滤，含10,000单位青霉素和10 mg链霉素/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>人新生儿真皮成纤维细胞</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>可用其他感兴趣的细胞类型替代</td></tr><tr><td>21 G × 1 1/2 英寸针头</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305167</td><td>22 G x 1 1/2 的针头也可使用</td></tr><tr><td>1 mL注射器</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>任何体积的注射器均可使用</td></tr><tr><td>细胞培养多孔板，聚苯乙烯，Greiner Bio-One（独立包装）（48孔）</td><td>VWR</td><td>82051-004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>人纤维蛋白原 - 胺原酶原、血管性血友病因子和纤维连接蛋白耗竭型</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB 3</td><td>可用感兴趣的基质蛋白替代</td></tr><tr><td>人凝血酶 α</td><td>酶研究实验室</td><td>HT 1002a</td><td>根据所研究的基质蛋白，此步骤可能非必需</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;设备&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSL2 细胞培养罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备10倍物镜的倒置显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>可兼容15 mL离心管的离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在三维环境中表征细胞迁移 体外 伤口环境

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

目前，大多数 体外 伤口愈合模型，例如已广泛建立的划痕实验，涉及在二维表面上研究细胞迁移和伤口闭合。然而，其生理环境 体内 伤口愈合发生在三维而非二维环境中。越来越多的研究表明，细胞在二维与三维环境中的行为存在显著差异；因此，迫切需要更符合生理实际情况的 体外 用于研究细胞迁移行为在伤口闭合中的模型。本文所述方法可实现对三维模型中细胞迁移的研究，相较于传统的二维划痕实验，该模型更接近生理条件。本模型旨在通过检测细胞从嵌入纤维蛋白基质中的球状体向外迁移的情况，评估促迁移或抗迁移因素存在下的细胞外向生长。利用该方法，可在三维基质中观察球状体的细胞外向生长，并通过明场显微镜观察及对球状体面积的分析，实现随时间变化的简便定量。该系统还可用于评估促迁移和/或抑制性因素对细胞迁移的影响。该方法为研究人员提供了一种简单有效的手段，用于分析细胞在三维伤口相关基质中的迁移行为 体外，从而提高其相关性 体外 使用前的细胞研究 体内 动物模型

类球体培养可用于在体外有效评估促迁移和抗迁移因子对成纤维细胞迁移的影响 
3D 成纤维细胞球体可通过悬滴培养法在 72 小时内形成（图1）。培养一段时间后，将类球体包埋于凝块基质中，并采用明场显微镜进行成像（图2）。类球体的初始区域（图中以白色边框所围区域表示）使用 ImageJ 确定，并作为参考点用于评估类球体后续的细胞外延生长程度。类球体的初始平均面积测定为 4.3 x 104 μm2 ± 1.1 × 104 μm2 对于对照组类球体，4.4 x 104 μm2 ± 1.1 x 104 μm2 用于促迁移类球体，以及 4.5 x 104 ± 7.7 × 103 μm2 用于...

本实验方案的目的是评估促迁移和抗迁移因子对细胞在三维纤维蛋白基质中迁移的影响。

目前，大多数体外伤口愈合模型（例如成熟的划痕实验）涉及研究细胞迁移和伤口闭合过程中的……

本实验的总体目标是观察特定处理因素对三维伤口相关纤维蛋白支架中细胞迁移的影响。该方法有助于解答伤口愈合领域中的关键问题，例如纤维网络结构的改变如何影响细胞向伤口部位纤维蛋白凝块的迁移。该技术的主要优势在于，它提供了一种简单且可重复的方法，用于分析三维环境下细胞在纤维蛋白凝块内的迁移行为。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为类球体的转移操作较为困难。首先，在37摄氏度水浴中复温一管冻存的新生人真皮成纤维细胞。当细胞刚刚解冻时，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于新鲜的新生人真皮成纤维细胞培养基中，调整细胞浓度为每毫升1 × 10⁶个细胞。随后将细胞接种至T75培养瓶中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养72小时。当细胞培养至80%融合度时，用5毫升胰蛋白酶EDTA消化细胞。在37摄氏度作用5分钟后，加入5毫升预温的培养基中和胰蛋白酶，并将40微升细胞悬液与台盼蓝按1:1比例混合。保留10微升细胞悬液用于计数。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于浓度为每毫升1.25 × 10⁵个细胞的溶液中。接着，用5毫升无菌PBS铺满10厘米培养皿的底部。然后将培养皿盖子倒置，在其内表面滴加多个20 µL的细胞悬液液滴。当所有液滴放置完毕后，将培养皿盖重新倒扣回培养皿上，注意不要震落悬滴，并轻轻将培养皿放入37°C培养箱中孵育72小时。孵育结束后，向48孔板中每个孔的每个球体加入100 µL凝块溶液，并轻轻振荡和轻敲培养板，确保纤维蛋白凝块混合物覆盖整个孔底。将培养板放入培养箱中继续孵育1小时。当凝块层聚合后，在光学显微镜下确认悬滴培养物中类球体的存在，并将48孔板和悬滴培养皿转移至细胞培养超净台中。小心翻转培养皿盖子以接触悬滴培养物，使用配备21号针头的1毫升注射器，将每滴悬滴转移至纤维蛋白包被的孔中。在吸取和接种类球体时需格外小心，因为该过程中最困难且最关键的步骤是转移类球体而不破坏其结构。在显微镜下观察培养板，确认类球体已正确接种至相应孔中。将100微升新鲜配制的凝块溶液轻轻覆盖至每个含有类球体的液滴上，再次在显微镜下观察类球体，以确认其仍保持完整且位于各孔中央。随后将48孔板放回培养箱，使第二层纤维蛋白原凝胶聚合。孵育1小时后，向每个孔中加入500微升对应实验类球体组的适当培养基，并将培养板放回37摄氏度的培养箱中。使用z轴层扫技术，通过明场显微镜每24至72小时对类球体进行成像，以观察三维细胞培养物的连续横截面。随后，在合适的图像分析软件中，追踪每个类球体在各个连续时间点的细胞边界，并使用测量功能获取每个类球体面积增加的百分比。在培养过程中，将类球体暴露于促迁移或抗迁移的待测试剂后，可通过明场显微成像确定类球体的初始面积，并以此作为参考，用于评估在后续每个时间点类球体细胞从球体主体向外扩展的程度。在此项代表性实验中，经促迁移试剂处理的类球体，其细胞从原始类球

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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在三维环境中表征细胞迁移体外伤口环境

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