TheC. elegans肠道作为细胞间管腔形态发生的模型体内极化膜在单细胞水平上的生物发生：抗体标记、RNAi功能缺失分析与成像

本套标准方法的总体目标是展示如何利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道在单细胞和亚细胞水平上进行极化膜生物合成及管腔形态发生的活体分析。该方法有助于回答细胞极性与生物合成领域的关键科学问题，例如在形态发生过程中及之后，顶膜与基底外侧膜区域以及其他亚细胞不对称结构是如何建立并维持的。该模型系统的主要优势在于，这一仅由20个细胞组成的透明单层上皮能够在活体内作为组织腔室，便于解析单个细胞中极化膜和管腔的生物合成过程。

这些技术可扩展用于分析其他 C. elegans 形态发生表型，但本文重点在于膜生物合成的分析，特别是顶膜和管腔的生物合成。实验步骤包括对固定和活体动物采用优化的成像技术，以区分膜结构域和亚细胞组分，并鉴定 C. elegans 肠道中的管腔形态发生表型。本关于肠道管状结构形成的视频，与排泄管管状结构形成的视频相辅相成，二者均为体内分析极化膜生物合成的互补模型。

关于标记，文中所述的转基因动物制备方法可通过荧光标记的融合蛋白实现活体成像，相关内容详见配套视频《排泄管管状发生过程的分析》。此类动物可直接用于RNAi实验。通常，第三代是该组合实验流程中的第一步。

本视频首先介绍用于固定动物的替代性标记方法——抗体染色法。不同的标记步骤可与免疫组织化学方法结合使用，后者通常用于最终的成像分析。本方案还提供了肠道特异性膜标记物启动子及其他对两种标记方法均有用的资源示例。

在演示免疫组织化学之后，本视频使用一种转基因品系，该品系通过ERM-1::GFP标记肠道顶膜，以利用RNAi筛选极性及管腔形态发生表型。首先准备载玻片以固定线虫。用移液器将30 µL多聚-L-赖氨酸滴加到一张载玻片上，然后将另一张载玻片覆盖其上，将两张载玻片一同轻压，使溶液均匀铺展至两者表面。

现在将两张载玻片分开，并使其在空气中干燥30分钟。接着，将一块平的金属块放入装有液氮的容器中。用M9溶液清洗样品板，并转移约10 µL含有线虫的M9溶液。

或者挑取线虫并加入M9缓冲液至载玻片上。待线虫转移后，轻轻地将盖玻片交叉覆盖在样本上，使盖玻片一侧略微悬垂于载玻片边缘。随后，在不产生侧向移动的前提下，轻压盖玻片。

立即将载玻片转移至液氮中的金属块上，使其迅速冷冻。五分钟后，利用载玻片悬垂的边缘快速弹掉盖玻片，以获得理想的角质层裂解效果。

接着将载玻片浸入盛有甲醇的玻璃染色缸中，于负20摄氏度下处理5分钟。之后将载玻片转移至盛有丙酮的玻璃染色缸中，在相同温度下继续处理5分钟。载玻片可直接进行染色，或于负20摄氏度保存备用。

将载玻片从丙酮中取出，在室温下自然晾干。接着，在载玻片的底面标记出圆形凡士林壁的位置，然后构建凡士林壁。在此过程中切勿擦除凡士林。

接下来，在一个装有湿润纸巾的容器中准备一个湿室，并将载玻片放置于其中的支架上。纸巾不得接触载玻片，相邻载玻片之间也不得相互接触。现在用移液器加入足够的 PBS 至琼脂圈内，以覆盖整个区域。

将移液器吸头轻轻置于圆圈边缘，使液体平缓地分散至线虫上。然后盖上盖子，静置五分钟。五分钟后倾斜载玻片，缓慢吸出 PBS，注意避免将线虫从载玻片上吸走。

接下来，用新配制的封闭液小心地填充琼脂糖圈，并将载玻片在室温下孵育15分钟。15分钟后，将封闭液更换为含有初级抗体的封闭液。

将载玻片在4°C下孵育过夜。次日，移除一抗，通过加入并吸去封闭液清洗载玻片三次，每次封闭液孵育10分钟。

接下来，将二抗用封闭液稀释后加入，室温孵育载玻片一小时。随后用封闭液洗涤载玻片两次，再用 PBS 洗涤一次。然后尽可能吸除 PBS，注意不要让样本干燥，并小心清除样本周围的琼脂糖凝胶。

在样品上滴加一滴封片剂，随后加盖盖玻片并用指甲油密封。然后将载玻片置于黑暗环境中，4摄氏度保存。将RNAi文库板从负80摄氏度转移至干冰中。

移除封口膜，将目标克隆转移至选择性琼脂平板上，然后划线接种克隆，并过夜培养细菌。

将文库板放回负80摄氏度冰箱前，需贴上新的密封膜。次日，从平板上挑取菌落接种至含有氨苄青霉素的一毫升液体培养基中。然后在37摄氏度下振荡培养约14小时。

第二天，将每种克隆各200微升接种到独立的RNAi平板上。让平板晾干，并在室温下过夜培养以诱导RNAi产物的生成。再过一天后，将五只L4期线虫转移至已标记有特定靶向基因的RNAi平板上。

然后将培养皿转移至通常为20摄氏度的培养箱中。首先在低倍和高倍明场光下观察对照组与RNAi处理的动物。接着在荧光显微镜下，使用适当的滤光片观察对照组与RNAi处理的动物。

系统地从整个培养皿的左上角到右下角扫描含有RNAi动物的平板，寻找表型。寻找感兴趣的动物。如需更仔细地观察选定的RNAi表型，应聚焦肠道，并使用放大功能评估管状结构形成和管腔形态发生表型。

为了在共聚焦显微镜下观察目标线虫，首先需手动将其固定。在玻璃载玻片上用真空脂或凡士林画一个细圈。脂层应非常薄，厚度不超过0.1毫米。然后，在圆圈中央加入约3.5微升的10毫摩尔叠氮化钠溶液。

然后在溶液干燥前，于解剖显微镜下迅速将目标线虫挑入溶液中。接着轻轻盖上盖玻片，并在30分钟内对样品进行成像。施加压力应轻柔，并在显微镜下确认线虫未漂浮在溶液中。

在共聚焦显微镜下，先用低倍镜找到线虫并调焦。然后使用60或100倍油镜观察和成像肠道。接着在荧光通道下观察样品，选择显示目标细胞缺陷的区域。

迅速操作以避免荧光淬灭。然后切换至激光扫描，并通过设定肠道背侧和腹侧的扫描边界，将成像范围限定于肠道。采集一系列图像，随后将这些图像合并为单个投影图像。

本方案描述了如何在发育中的秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道中对极性膜的生物发生进行分子分析和可视化解析，其中顶膜与管腔的形态发生同时进行。在整个发育过程中，可分辨出顶膜和基底外侧膜区域、膜相关连接结构以及肠道管腔，并可检测它们之间的相互关系。这些亚细胞组分可通过荧光标记的抗体或荧光融合蛋白进行标记，实现双重或三重标记，具体方法详见配套论文。

通过使用解剖荧光显微镜，可快速扫描肠腔的宏观缺陷。与GFP偶联的顶膜细胞骨架连接蛋白ERM-1是一种表达稳定的标记物，适用于RNAi筛选。使用该标记物时，发现了一系列新的肠道肠腔形态发生和极性表型及其相应的基因缺陷。

随后，通过共聚焦激光扫描显微镜获取更高倍数的图像，以更仔细地观察表型，从而更好地理解潜在的缺陷。部分表型可进行量化。通过量化可比较这些缺陷，并追踪其在发育过程中的进展。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过免疫染色标记肠道膜和内膜区室，以及如何分析极化膜和管腔生物合成中基因功能缺失（RNAi）表型的方法。