Name: C. 线虫小肠作为细胞间腔形态发生和体内极化膜生物单细胞水平的模型: 抗体染色、rna 干扰功能分析和成像标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 了解利用秀丽隐杆线虫肠道进行体内极化膜生物发生和管腔形态发生分析的方法。本方案结合抗体染色、RNA干扰和成像技术，可在单细胞和亚细胞水平研究膜极性建立与维持机制。

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我们感谢 Mario 去 Bono（英国剑桥，MRC分子生物学实验室），Kenneth J. Kemphues（美国伊萨卡，康奈尔大学），Michel Labouesse（法国斯特拉斯堡， Institut de 巴黎西学生物学，Universite&#769; 皮埃尔和玛丽·居里大学，法国巴黎，Grégoire Michaux（斯特拉斯堡大学） 去感谢 Rennes 1（法国雷恩）、由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助的秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）提供菌株和抗体。本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH GM078653）、麻省总医院（MGH IS 224570）以及 SAA（223809）向 V.G. 提供的资助。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案描述了如何结合标准的基因功能缺失/RNAi与成像（标记与显微镜）技术，以充分利用 C. elegans 肠上皮作为可视化与分子解析的模型 在体内 极化膜与管腔发生
标记
本方案重点介绍抗体染色。原位抗体标记是荧光融合蛋白标记的一种高特异性替代方法（荧光融合蛋白标记方法详见配套论文中关于排泄管膜生物合成的部分）2。尽管抗体染色无法实现活体成像，但它可用于验证目标蛋白的定位（两种标记方法均可能存在局限性）。此外，有关形态发生和/或蛋白亚细胞定位的问题通常可在固定后的动物样本中进行评估。免疫染色适用于双重及多重标记，若荧光融合蛋白在所需的固定和通透处理过程中得以保留，则可与荧光融合蛋白标记联合使用。本文所述方案通常允许实现这种联合标记（图2）。对固定样本使用抗体或化学染料进行原位标记，也可能有利于超分辨率显微技术（如...

细胞和亚细胞不对称性的形成，例如极化膜结构域的建立，对于细胞、组织和器官的形态发生及其功能至关重要1上皮细胞中极化膜的生物发生研究仍面临技术挑战，因为亚细胞组分定位的方向性变化依赖于多个连续且同时发生的胞外和胞内信号，这些信号在大多数模型中难以分离，并高度依赖于特定的模型系统。本文介绍的模型——单层 秀丽隐杆线虫 肠道——是一种结构极为简单的组织。与单细胞 C. elegans 排泄管（参见随附的关于极化膜生物发生的论文） 秀丽隐杆线虫 排泄管2，它为鉴定和表征极化膜生物合成所需分子提供了若干独特优势。从酵母到人类，分子极性信号的高度保守性使得这一简单的无脊椎动物器官成为研究极化膜生物发生的理想模型 &#34;在体内 组织培养腔室&#34; 以解决与人类系统直接相关但目前仍过于复杂而无法在单细胞水平上进行可视化解析的上皮细胞极性问题 在体内.
尽管已鉴定出多个保守的极性信号，这些信号来源于（1）细胞外基质，（2）质膜及其连接结构，以及（3）细胞内囊泡运输3，但这些组分在极化上皮膜和组织发生过程中的整合机制仍不清楚4. 经典的单细胞 在体 模型（例如：S. cerevisiae 以及 C. elegans 合子）在阐明极化细胞分裂和前-后极性的基本原理方面发挥了关键作用，并鉴定了重要的膜相关极性决定因子（小GTP酶/CDC-42、分裂缺陷蛋白PAR家族）。5,6，但它们依赖于独特的对称性破缺信号（芽痕、精子进入点），且缺乏由细胞连接固定的顶-基底侧膜区室，以及可能相应的细胞内顶-基底侧分选机制。然而，目前我们对上皮细胞中极化膜运输组织机制的认识主要依赖于哺乳动物的二维单层培养细胞模型7，缺乏能够改变膜结构域位置和膜 trafficking 路径方向的生理性和细胞外环境及发育信号（从二维到三维的转变） 体外 仅培养系统就足以逆转MDCK（Madin-Darby犬肾）细胞的膜极性）8. 在体 在无脊椎动物模型生物中，上皮细胞极性的发育研究最初是在扁平上皮中进行的，例如在 黑腹果蝇 表皮，他们在其中确定了连接结构动态对极化细胞迁移和细胞层运动的关键作用9以及内吞运输在极性维持中的作用10三维 体外 和 在体内 在 MDCK 细胞及管状上皮中对管腔形态发生进行分析 C. elegans 肠和肠分别最近已鉴定出细胞内运输对 从头 （顶膜）结构域与管腔的生成及定位11,12,13管状（相对于扁平）上皮细胞的厚度有利于对细胞内不对称结构进行三维分析，因为它能更清晰地区分顶膜-管腔膜、顶侧连接、侧膜以及细胞器的定位。除了这些视觉优势外， C. elegans 模型增加了 在体内 环境，发育轴，透明性，体型结构的简洁性，不变且明确的细胞谱系，分析（遗传）及其他下述优势。
C. elegans 其本身是一种具有管状结构的线虫，其透明性和简单的解剖结构使得其同样呈管状的内部器官可直接用于管腔和腔室形态发生的可视化分析。其肠道由二十个细胞组成（偶尔为21或22个细胞）14 源自一个单一的前体细胞（E），并通过一次嵌合过程由双层上皮发育为由九个肠环（INT环）组成的双侧对称管状结构（第一个环包含四个细胞）； 图1 示意图14,15,16. 通过微分干涉差显微镜（DIC）根据细胞核特征确定的肠道谱系与组织分析17并通过标记膜进行荧光显微镜观察，为理解其形态发生过程提供了关键见解，特别是揭示了细胞自主性和非自主性在定向细胞分裂与迁移中的作用需求（例如，嵌合，左右不对称性，前后管旋转14,18早期内胚层细胞命运决定及其调控该克隆模式器官发育的基因调控网络已得到充分表征19,20但本文的重点在于单个管状细胞中极化膜和管腔的生物发生过程，以及伴随该过程的内膜系统、细胞骨架结构和细胞器的细胞内不对称性的分析。这种管状结构的简单性为分析提供了便利：在超微结构水平上，所有具有微绒毛的顶膜均朝向管腔，所有基底膜均朝向外侧管壁表面，侧膜彼此接触，并通过连接结构与顶膜分隔开来图1 示意图；参见参考文献16,21）用于 C. elegans紧密连接和黏附连接组分的特异性排列）。因此，顶膜的生物合成与管腔形态发生同时进行。此外，成年肠道细胞的大小——除排泄细胞外，这种小型动物中最大的细胞——接近哺乳动物细胞的大小，便于 在体内 亚细胞组分的可视化追踪 例如 囊泡轨迹，即通常尝试的 体外 在培养皿中。
对于本项细胞和亚细胞分析而言，适当的标记至关重要。通过标记特定的分子组分，可对肠道内膜或质膜区域、细胞连接、细胞骨架结构、细胞核及其他亚细胞器进行可视化观察。许多此类组分已被鉴定，并且仍在持续发现中。Table 1 列举了一些实例并提到了相关资源。例如，已鉴定出多种分子，这些分子可区分肠内膜系统中从内质网到高尔基体、再经由高尔基后囊泡至质膜的管状和/或囊泡区室。22特定蛋白质（以及脂质和糖类）可通过直接标记或通过结合蛋白进行间接标记。本方案重点介绍 原位 固定样本的抗体染色，是两种标准标记技术之一（另一种技术的描述参见关于排泄管管状发生的相关论文）2 - 在体内 通过荧光蛋白融合进行标记——可直接应用于肠道； Table 2 提供了可用于驱动此类融合蛋白在肠道中特异性表达的肠道特异性启动子示例）。采用上述任一方法进行双重或多重标记，或结合两种方法并辅以其他化学染色，可实现更深入的可视化分辨率，并可用于分析特定分子或亚细胞组分在空间和时间上的共定位及招募变化。图2）。本方案中所述的固定和染色程序可在免疫染色过程中有效保存绿色荧光蛋白（GFP）标记。在成像方面，描述了通过标准显微技术（荧光体视显微镜和共聚焦显微镜）检测和表征管状结构形成表型的关键步骤。 (图3, 4这些方法可扩展至更高分辨率的成像技术，例如超分辨率显微镜和透射电子显微镜（本文未作描述）。
该系统的一个关键优势在于能够从胚胎发育期到成体期的不同发育阶段，在单个细胞水平上分析细胞极性。例如，可通过标记Ezrin-Radixin-Moesin家族中高度保守的膜-肌动蛋白连接蛋白ERM-1，在整个发育过程中于单细胞水平追踪顶膜结构域和管腔的形成过程。23,24ERM-1 可用于观察胚胎管状结构形态发生过程中的顶膜生物合成（1），此时顶膜生物合成与极化细胞分裂和迁移同时发生（细胞在嵌合过程中围绕管腔向顶侧移动）。15；（2）在细胞不分裂也不迁移的晚期胚胎和幼虫期管腔延伸过程中；以及（3）在成体肠道中，极化膜结构域得以维持（图1在不断扩增的有丝分裂后幼虫上皮中， 从头 因此，极化膜的生物发生可以与极化组织形态发生相分离，而这一点在大多数模型中是无法实现的 在体内 和 体外 上皮细胞极性模型，包括具有单细胞分辨率的模型（例如 3D MDCK 囊肿模型8）。通过标记其他组分，该体系在L1幼虫阶段（此时细胞的胞质/细胞核比例较高）尤其有助于区分那些特异性参与极化膜生物合成的细胞内变化。例如 从那些与极化细胞分裂和迁移同时所需的机制中，分离出膜运输轨迹重定向的过程。
C. elegans 的遗传多样性广为人知25，使其成为对任何生物学问题进行分子分析的有力模型系统。例如，一项关于形态发生的研究可以从野生型菌株、转基因菌株（其中感兴趣的结构（例如 细胞膜）被荧光标记）或该结构存在缺陷的失活或获得功能突变体开始。典型的反向遗传学研究可能产生一种突变体，其中目标基因在生殖系中被删除（例如 通过靶向缺失）、通过诱变被修饰（通常产生点突变，导致基因功能的丧失、减弱或获得），或其转录本通过 RNAi 被降低。通过喂食方式进行 RNAi 在 C. elegans 中操作简便26，也适用于设计靶向筛选，以检测一组较大的目标基因。遗传模式生物最显著的优势之一是能够进行 体内 正向筛选（例如 诱变、系统性或全基因组范围的 RNAi 筛选），从而无偏倚地探究特定表型的分子成因。例如，一项始于表达 ERM-1 标记顶膜的转基因动物的无偏倚视觉 C. elegans RNAi 管状结构形成筛选，发现了一种引人注目的可逆性肠道极性转换和异位管腔表型，本文即以此为例说明此类分析。该筛选确定了糖鞘脂（GSLs；必需的膜脂，通过其 GSL 生物合成酶鉴定）以及包被小泡的网格蛋白及其 AP-1 衔接蛋白组分的耗竭是导致该极性转换表型的特定分子缺陷，从而将这些运输分子定义为 体内 顶膜极性和管腔定位的信号分子12,13。当从特定的遗传突变/形态发生表型出发时，此类筛选（或单个遗传/RNAi 相互作用实验）也可用于研究两个或多个目标基因之间的功能相互作用（参见关于排泄管的配套论文以了解此类分析的示例）2。本方案聚焦于 RNAi，除了其在正向筛选中可直接鉴定导致表型的基因外，还为形态发生分析提供了特定优势。由于指导形态发生的基因产物通常以剂量依赖方式发挥作用，RNAi 通常能够产生一系列表型。能够产生具有信息量的部分功能缺失表型也有助于解决一个重要问题：大多数关键的管状结构形成基因是必需的，其完全缺失会导致不育和早期胚胎致死。本方案包括条件性 RNAi 策略以克服这一困难，并建议优化方法以产生更广泛的表型谱，例如通过诱变产生的等位基因系列。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;抗体染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-213-612</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Sigma</td><td>MT409-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MH27（小鼠）</td><td></td><td></td><td>浓度：1:20 资源：发育研究杂交瘤库</td></tr><tr><td>MH33（小鼠）</td><td></td><td></td><td>浓度：1:10 资源：发育研究杂交瘤库</td></tr><tr><td>抗-ICB4（兔）</td><td></td><td></td><td>浓度：1:5 资源：由 Mario 惠赠 &lt;em&gt;去&lt;/em&gt; Bono（英国医学研究理事会）</td></tr><tr><td>抗PAR-3（兔）</td><td></td><td></td><td>浓度：1:50 
资源：由康奈尔大学 Kenneth J. Kemphues 惠赠</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Floor 568（抗兔）</td><td>ABCam</td><td>AB175471</td><td>浓度：1:200</td></tr><tr><td>Cy5（抗小鼠）</td><td>Life technologies</td><td>A10524</td><td>浓度：1:200</td></tr><tr><td>TRITC（抗兔）</td><td>Invitrogen</td><td>T2769</td><td>浓度：1:200</td></tr><tr><td>FITC（抗小鼠）</td><td>Sigma</td><td>F9006</td><td>浓度：1:100</td></tr><tr><td>标记的化学品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-Phalloidin</td><td></td><td></td><td>浓度：1:100 资源：Molecular Probes-T7471</td></tr><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空润滑脂 硅酮</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>4448</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片（22×22-1）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 相关&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>参见参考文献&lt;sup&gt;29 &lt;/sup&gt;用于标准 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 培养与保种方法。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LB 培养基与平板&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>参见参考文献&lt;sup&gt;29&lt;/sup&gt; 用于实验方案。</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>A0116</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;M9 培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>参见参考文献&lt;sup&gt;29&lt;/sup&gt; 用于实验方案。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NGM 平板&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>参见参考文献&lt;sup&gt;29&lt;/sup&gt; 用于实验方案。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>阿克罗斯有机</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNAi 平板&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>参见参考文献&lt;sup&gt;30&lt;/sup&gt; 用于实验方案。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>阿克罗斯有机</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biological</td><td>I8500</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细菌&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 细菌</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 细菌</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>全基因组RNAi文库 Ahringer全基因组RNAi饲喂文库（参考文献&lt;sup&gt; 30,49,50&lt;/sup&gt;)</td><td>Source BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; ORF-RNAi 饲喂文库（参考文献&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;)</td><td>Source BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;成像相关&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9221-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>尼康</td><td>SMZ-U</td><td></td></tr><tr><td>配备高倍体视荧光附件（Kramer Scientific）、CCD 相机与 Q capture 软件以及 X-Cite 荧光灯（Photonic Solutions）的解剖显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>搭载于ECLIPSE Ti-E倒置显微镜的激光扫描共聚焦显微镜</td><td>尼康</td><td>C2</td><td></td></tr></tbody></table>

thec. elegans肠道作为细胞间管腔形态发生的模型体内极化膜在单细胞水平上的生物发生：抗体标记、rnai功能缺失分析与成像

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

多细胞管状结构是所有内脏器官的基本单位，由极化的上皮或内皮细胞构成，其顶端膜衬于管腔内侧，而基底外侧膜则相互接触和/或与细胞外基质相连。在器官形态发生过程中，这种独特的膜不对称性如何建立并维持，仍是细胞生物学中尚未解决的问题。本实验方案以秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道为模型，研究管状结构形态发生过程中极性膜的生物生成，重点聚焦于顶端膜与管腔的形成。秀丽隐杆线虫的肠道由二十个单层排列的上皮细胞组成，形成一个简单的两侧对称管状结构，便于在单细胞水平上进行分析。膜的极性化在胚胎早期伴随极性细胞分裂和细胞迁移同步发生，但全新的极性膜生物生成过程在整个幼虫生长期持续进行，此时细胞已停止增殖和移动。后一情形使得研究者能够将介导不同极性化过程的亚细胞变化分离开来，而这些过程在大多数极性模型中难以区分。在整个发育过程中，可通过绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白标记或原位抗体染色，对顶端膜、基底外侧膜、细胞连接、细胞骨架及内膜系统的组分进行标记与追踪。结合该生物体丰富的遗传可操作性，秀丽隐杆线虫肠道因而为极性膜与管状结构生物生成的可视化、发育学及分子遗传学分析提供了独特的体内模型。本文所述具体方法（均为常规技术）包括：通过抗体染色标记肠道亚细胞组分；利用适用于通常为必需的管状结构形成基因的基因功能缺失研究方法，分析参与极性膜生物生成的基因；评估不同发育阶段的极性缺陷；通过落射荧光、微分干涉相差（DIC）及共聚焦显微镜观察解析表型；对视觉缺陷进行量化分析。本实验方案可适用于分析参与上皮极性、膜生物生成、管腔与管状结构形态发生过程中常高度保守的各类分子。 C. elegans 肠道作为&#160;用于研究管状结构形态发生过程中极化膜生物合成的模型，重点在于顶膜和管腔的生物合成。该 C. elegans 由二十个细胞组成的单层肠上皮排列成一个简单的两侧对称管状结构，允许在单细胞水平上进行分析。膜极化的建立与早期胚胎发生过程中的极性细胞分裂和细胞迁移同时发生，但在幼虫生长期中，当细胞停止增殖和移动后，从头开始的极性膜生成仍持续进行。 从头 极化膜的生物合成在幼虫生长期持续进行，此时细胞已不再增殖和迁移。这一特性使得研究者能够将同时介导不同极化过程的亚细胞变化分离开来，而在大多数极性模型中，这些过程往往难以区分。顶膜、基底外侧膜、细胞连接、细胞骨架以及内膜系统的组分均可通过GFP融合蛋白在发育过程中进行标记和追踪，或通过 原位 抗体染色。结合该生物体的遗传多样性， C. elegans 肠道因此提供了一个独特的 在体内 用于极化膜和管状结构发生的可视化、发育及分子遗传学分析的模型。本文所述的具体方法（均为常规方法）包括：通过抗体染色标记肠道亚细胞组分；利用针对通常为必需的管状结构形成基因而优化的基因功能缺失研究，分析参与极化膜生物合成的基因；评估不同发育阶段的极性缺陷；通过落射荧光、微分干涉差（DIC）和共聚焦显微镜解析表型；量化视觉缺陷。本实验方案可适用于分析参与上皮细胞极性、膜生物合成、管状结构及管腔形态发生的众多高度保守分子中的任意一种。

本实验方案描述了如何在分子水平上分析和可视化极化膜生物合成及管腔形态发生过程 C. elegans 肠道，单细胞及亚细胞水平。二十细胞单层 秀丽隐杆线虫 肠道在胚胎中期通过定向的细胞分裂和迁移形成。此时，极化的膜结构域逐渐建立，然而 从头合成 极化膜生物发生过程在成熟但持续扩展的上皮组织中持续进行，贯穿四个幼虫阶段直至成体，从而可将分析重点集中于极化膜的生物发生图1A).
为了可视化 秀丽隐杆线虫 细胞和亚细胞组分，通常采用两种策略：免疫荧光（本方案第1部分详述）； 图2, 图 4D- F）以及荧光融合蛋白的表达（详见随附论文中关于排泄管...

透明的 C. elegans 肠道可作为“在体内 用于在多细胞管状结构形成过程中，在单细胞和亚细胞水平上研究顶-基底膜及管腔生物发生的组织腔室。本方案描述了如何结合标准标记、基因功能缺失/RNAi以及显微镜技术，在分子水平上解析这些过程。

TheC. elegans肠道作为细胞间管腔形态发生的模型体内极化膜在单细胞水平上的生物发生：抗体标记、RNAi功能缺失分析与成像

多细胞管状结构是所有内脏器官的基本单位，由极化的上皮或内皮细胞构成，其顶端膜衬于管腔内侧，基底外侧膜则相互接触和/或与细胞外基质相连。在器官形态发生过程中，这种独特的膜不对称性如何建立并维持，仍是细胞生物学中尚未解决的问题。本实验方案以秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道为模型，研究管状结构形态发生过程中极化膜的生物合成，重点聚焦于顶端膜与管腔的形成。秀丽隐杆线虫的肠道由二十个单层肠上皮细胞组成，排列成简单的两侧对称管状结构，可在单细胞水平上进行分析。膜极化的建立与早期胚胎发育过程中的极化细胞分裂和细胞迁移同步发生；而在幼虫生长期，尽管细胞不再增殖和移动，从头开始的极化膜生物合成仍持续进行。后一情形使得研究者能够将介导不同极化过程的亚细胞变化分离开来，而在大多数极性模型中这些过程往往难以区分。在整个发育过程中，可通过绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白标记或原位抗体染色方法，对顶端膜、基底外侧膜、细胞连接、细胞骨架及内膜系统的组分进行标记与追踪。结合该生物体丰富的遗传操作手段，秀丽隐杆线虫肠道因而成为在活体条件下可视化研究极化膜与管状结构生物合成的发育过程及分子遗传机制的独特模型。本文所述的具体方法（均为常规技术）包括：通过抗体染色标记肠道细胞的亚细胞组分；利用适用于通常为必需基因的管状结构形成相关基因的基因功能缺失研究方法分析参与极化膜生物合成的基因；评估不同发育阶段的极性缺陷；通过落射荧光显微镜、微分干涉差（DIC）显微镜和共聚焦显微镜解析表型；对可视化缺陷进行定量分析。本实验方案可适用于分析参与上皮极性、膜生物合成、管腔与管状结构形态发生过程中众多高度保守的分子。

本方法组合的整体目标是展示如何利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道在单细胞和亚细胞水平上进行极化膜生物发生和管腔形态发生的体内分析。该方法有助于回答细胞极性和生物发生领域的关键问题，例如顶膜与基底外侧膜区室以及其他亚细胞不对称性在形态发生过程中及之后是如何建立和维持的。该模型系统的主要优势在于，这一仅由20个细胞组成的透明单层结构可在体内组织腔室中存活，从而便于解析单个细胞的极化膜和管腔的生物发生过程。这些技术可扩展应用于其他秀丽隐杆线虫（C. elegans）形态发生表型的分析，但本文重点在于膜生物发生的分析，特别是顶膜和管腔的生物发生。实验流程包括对固定及活体动物进行优化的成像技术，用以区分膜结构域和亚细胞组分，并鉴定秀丽隐杆线虫肠道中的管腔形态发生表型。本关于肠道管腔形成的视频，与另一段关于排泄管管腔形成的视频互为补充，共同提供了在体内分析极化膜生物发生的模型系统。关于标记转基因动物的制备，伴随的视频中描述了用于活体成像的荧光标记融合蛋白在排泄管管状发生分析中的应用。此类动物可直接用于RNAi实验。在这一系列联合操作中，第三代通常是第一步。本视频首先介绍用于动物固定的替代性标记方法——抗体染色。不同的标记步骤可与免疫组织化学方法结合使用，后者通常用于最终的成像分析。本方案还提供了肠道特异性膜标记物启动子及其他对两种标记方法均有用的资源示例。在演示免疫组织化学之后，本视频使用一种转基因品系，该品系通过ERM-1::GFP标记肠道顶端膜，以利用RNAi筛选极性和管腔形态发生表型。首先准备用于固定线虫的载玻片。将30微升聚-L-赖氨酸滴加到一张载玻片上，然后将另一张载玻片覆盖其上，将两张载玻片一同轻轻按压，使溶液均匀分布在两张载玻片表面。现在将两张载玻片分开，并让其风干30分钟。接着将一块平的金属块放入装有液氮的容器中。用M9溶液清洗样品板，并转移约10 µL含有线虫的M9溶液。或者用挑虫针挑取线虫，并在载玻片上加入 M9 溶液。转移线虫后，将盖玻片交叉方向轻轻盖在样本上，使盖玻片一侧边缘悬空突出。随后，在不进行任何横向移动的情况下，轻压盖玻片。立即将载玻片转移至液氮中的金属块上，使其迅速冷冻。五分钟后，利用盖玻片悬空的一端快速将其弹去，以获得理想的角质层裂开效果。接下来，将载玻片浸入盛有甲醇的玻璃染色缸中，于负20摄氏度下处理5分钟。随后将载玻片转移至盛有丙酮的玻璃染色缸中，在相同温度下继续处理5分钟。载玻片可直接进行染色，或于负20摄氏度保存备用。将载玻片从丙酮中取出，在室温下自然晾干。接着，在载玻片的背面标记出圆形石蜡油墙的位置，然后构建石蜡油墙。在此过程中切勿擦除石蜡油。接下来，在容器中用湿润的纸巾制备一个湿盒，并将载玻片放置于盒内的支架上。注意纸巾不能接触载玻片，相邻载玻片之间也不得相互接触。随后用移液器加入足量 PBS 至琼脂圈内，以完全覆盖该区域。轻轻将移液器吸头置于圆圈边缘，使液体平缓扩散至线虫上。然后盖上盖子，静置五分钟。五分钟后倾斜载玻片，缓慢吸除PBS，注意避免线虫随液体丢失。接下来，用新配制的封闭液小心地填充琼脂糖圈。将载玻片在室温下孵育15分钟。15分钟后，用含有初级抗体的封闭液替换原有的封闭液。在4°C下将载玻片孵育过夜。次日，移除一抗，通过加入并吸出封闭液清洗载玻片三次，每次封闭液孵育10分钟。接着加入用封闭液稀释的二抗，室温孵育载玻片1小时。随后用封闭液洗涤载玻片两次，再用PBS洗涤一次。然后尽可能吸除PBS，注意不要使样本干燥，并小心移除样本周围的封片胶。在样本上滴加一滴封片剂，随后加盖盖玻片并用指甲油密封。然后将载玻片置于4°C避光保存。将RNAi文库板从-80°C转移至干冰中。移除封口膜，将目的克隆转移至选择性琼脂平板上，然后划线接种克隆，并过夜培养细菌。将文库板放回负80摄氏度冰箱前，需贴上新的密封膜。次日，从平板上挑取菌落接种至含有氨苄青霉素的一毫升液体培养基中。然后在37摄氏度下振荡培养约14小时。次日，将每个克隆分别接种 200 微升至不同的 RNAi 平板上。让平板干燥，并在室温下过夜孵育以诱导 RNAi 表达。一天后，将五条 L4 期线虫转移至标有相应靶基因的 RNAi 平板上。然后将培养板转移至通常设定为20摄氏度的培养箱中。首先在明场光线下，于低倍和高倍镜下观察对照组与RNAi处理组动物。接着在荧光显微镜下，使用适当的滤光片观察对照组与RNAi处理组动物。从培养板的左上角到右下角系统性地扫描进行RNAi处理的线虫，寻找表型变化。注意观察感兴趣的个体。对选定的RNAi表型进行更细致的观察时，应重点关注肠道，并利用显微镜缩放功能评估管状结构形成和管腔形态发生相关的表型。为了在共聚焦显微镜下观察目标线虫，首先需手动将线虫固定。在玻璃载玻片上用真空脂或凡士林制作一个薄圈，脂层应尽可能薄，厚度不超过0.1毫米。然后，在圆圈中央加入约3.5 µL的10 mM叠氮化钠溶液。然后在溶液干燥前，于解剖显微镜下迅速将目标线虫挑入溶液中。随后轻轻盖上盖玻片，并在30分钟内对动物进行成像。施加轻微压力，并在显微镜下确认线虫未在溶液中漂浮。在共聚焦显微镜下，先用低倍镜找到线虫并调焦。然后使用 60 或 100 倍油镜观察和成像肠道。接着在荧光光源下，使用适当的荧光通道观察动物，筛选出显示目标细胞缺陷的区域。迅速操作以避免荧光漂白。随后切换至激光扫描模式，并通过设定肠道背侧和腹侧的扫描边界，将成像范围限制于肠道区域。采集一系列图像，之后将这些图像合并为一幅单一的投影图像。本方案描述了如何在发育中的秀丽隐杆线虫（C.elegans）肠道中对极性膜的生物发生进行分子分析和可视化解剖，其中顶膜和管腔的形态发生同时进行。在整个发育过程中，可分辨出顶膜和基底外侧膜区域、膜相关连接结构以及肠道管腔，并可检测它们之间的相互关系。这些亚细胞组分可通过荧光标记的抗体或荧光融合蛋白进行双标或三标，具体方法见配套论文。通过使用解剖荧光显微镜，可快速扫描肠腔的宏观缺陷。与GFP偶联的顶膜细胞骨架连接蛋白ERM-1是一种表达稳定的标记物，适用于RNAi筛选。利用该标记物，研究人员发现了一系列新的肠道腔形态发生和极性表型及其相应的基因缺陷。然后采用共聚焦激光扫描显微镜获取更高倍数的图像，以更仔细地观察表型，从而更好地理解潜在的缺陷。某些表型可进行定量分析。通过定量分析可比较这些缺陷，并追踪其在发育过程中的进展。观看本视频后，您应能较好地掌握如何通过免疫染色标记肠道膜和内膜区室，以及如何分析极性膜和管腔发生过程中的功能性RNAi表型。

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