Name: C. 线虫排泄管作为细胞内腔形态发生和体内极化膜生物在单个细胞中的模型: GFP-融合、rna 干扰界面和成像的标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 了解秀丽隐杆线虫排泄管单细胞管腔发生与极化膜生物发生的活体分析方法。该方案结合遗传学、RNAi技术与成像技术，可直观检测顶端膜2000倍扩展，为研究细胞极性与膜发育提供重要模型。

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感谢美国堪萨斯大学的 M. Buechner、美国纽约罗切斯特大学医学中心的 K. Nehrke，以及由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室资助的Caenorhabditis遗传中心（P40 OD010440）。本研究工作得到了 NIH GM078653、MGH IS 224570 和 SAA 223809 项目对 V.G. 的资助。

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

C. elegans 具有遗传多样性高、通体透明、体形结构简单以及细胞谱系恒定等特点，是研究形态发生的理想模型。本实验方案描述了如何结合常规的遗传操作与成像技术，利用仅 2 微米粗细的 C. elegans 排泄管，研究单细胞管中极性膜与细胞内腔的生物发生过程。
标记 
可通过表达荧光融合蛋白对C. elegans排泄管进行标记，从而实现活体分析（本文所述），也可通过抗体或化学染色进行标记（有关抗体染色方法，参见关于肠道管状结构形成的配套论文3）。表达两种或多种不同的荧光蛋白，或结合使用不同的标记技术，可实现对这些细长管状结构的高分辨率可视化解析（图2）。由排泄管特异性启动子驱动、靶向排泄管的荧光融合蛋白是标记排泄管的首选方法，原因包括：（1）许多排泄管蛋白的表达水平较低；（2）排泄管结构精细，若目标蛋白在排泄管外也有表达，则非特异性染色极易掩盖其真实结构。然而，排泄管对异源蛋白...

所有内部器官均由管道构成，这些管道在多种不同功能中起着关键作用，例如气体、液体和营养物质的运输与交换，以及代谢废物的排泄。这些器官具有极性特征，拥有明确的顶膜和腔膜，以适应其特定功能；而内膜系统和质膜系统的生物合成缺陷则是导致人类疾病常见的原因。1,2大多数血管和内脏器官的管道为多细胞结构，通过细胞间方式形成管腔；然而，单细胞管道则通过细胞内方式形成管腔，例如可占人类毛细血管床的30–50%2多细胞和单细胞管道的极化膜在组成上相似，尽管其微区可能因管道的具体功能而有所不同（例如，排泄管小管与肠微绒毛的比较 秀丽隐杆线虫；参见随附论文 秀丽隐杆线虫 肠道管状结构发生3极化膜生物合成与管状结构形成的原理在后生动物中是保守的，且由相似的分子机制进行调控1,2,4.
C. elegans 的排泄系统由五个细胞组成：排泄细胞（EC）、导管细胞（DC）、孔细胞（PC）以及两个腺细胞。消融 EC、DC 或 PC 会导致体腔内液体积聚，动物在早期幼虫阶段即死亡5。引人注目的是，这三个单细胞管通过三种不同的方式形成其管腔：通过细胞中空化（EC）；通过细胞包裹并伴随自细胞连接形成（PC）；以及通过细胞包裹并伴随自融合（DC）；这些管腔形态发生机制在系统发育上均具有保守性6,7。EC 位于后部咽球左侧，在此处发出两条侧向延伸结构，从中分出四条排泄管，分别向前和向后（左右两侧）延伸至线虫的头部前端和尾部末端（图1）5,6,8。EC 的长度从约 1 µm 扩展至 2 × 1,000 µm，是该生物体内最大的细胞。在亚细胞水平上，排泄管是一种简单管状结构，由朝向假体腔的基底膜发育而来，并由管腔膜（内管）贯穿形成管状通道。排泄管的管腔膜在其唯一的细胞间连接处与导管的管腔膜相连；除此之外，排泄管在其全长上无其他连接结构（图1）。排泄管的管腔膜及其膜下细胞骨架具有顶膜特性，其分子组成类似于多细胞管（如肠道）以及其他（例如，扁平）上皮细胞的顶膜和膜下细胞骨架。细胞质中的细胞器，包括内体囊泡及其他（例如，高尔基体）内膜系统，沿排泄管全长分布。此外，多种小管囊泡——或与管腔膜相连，或彼此连接，或孤立存在——贯穿于排泄管的细胞质中7,8,9,10。这种动态的质膜/小管连接进一步扩展了排泄管的膜系统，并参与管腔形态发生和渗透调节过程10。因此，排泄管几乎完全由内膜和质膜构成，是研究极化膜生物发生以及内膜与质膜界面调控的优良模型。在排泄管形态发生过程中顶膜发生的剧烈扩张——在此单细胞系统中与管腔延伸同步进行——也使得研究为稳定和居中定位细胞内管腔膜而产生的结构问题成为可能。本实验方案重点关注排泄管及管腔结构形态发生的分析，以及该过程所需的细胞内膜动态变化，而非调控细胞运动以建立 EC 在排泄系统中的位置及其与其他细胞元件复杂连接的信号通路（详见文献6综述）。
C. elegans 单细胞管状系统在分析极化膜和细胞内腔室生物发生方面的一个进一步优势在于，它能够在发育时间上分离其膜和连接结构不同组分的生成过程。排泄细胞（EC）在腹侧闭合时期诞生，并于胚胎中期定居于咽部腹侧-外侧位置5,6,8，此时侧向管的延伸和分支开始发生。随后，在胚胎发育晚期发生前后方向的管延伸，这一过程持续至L1幼虫阶段（图1）。在刚孵化的幼虫中，后部管尖端大约到达虫体中部，并在L1阶段末期完全延伸至尾部，此后管的伸长与虫体整体生长同步进行8。因此，管的主动生长速度超过动物整体生长速度的阶段在第一幼虫阶段结束，但在后续幼虫阶段（L2–4）中，管仍会随着整个动物的生长而继续伸长。这种发育设置使得研究者能够在不依赖极化细胞分裂或细胞迁移的情况下，独立分析从头极化膜生物发生的各个步骤。此外，该系统还能将这一过程与连接结构的组装相分离（连接结构在胚胎中腔室启动之前即已形成）；而连接结构在膜极化中的确切作用，目前仍是细胞极性领域中的一个未解问题。最后，该系统还能独特地将顶膜扩展与基底膜扩展区分开来，其中后者在排泄管中早于前者发生10。因此，C. elegans 排泄管模型是对肠道模型的一个极具信息价值的补充：肠道模型在分析极化膜生物发生方面也具备若干类似优势，但其过程发生于多细胞环境中（参见同期发表的关于肠道管状结构形成的论文3）。
尽管野生型导管在此微小蠕虫中为极细的管状结构，但利用该透明动物的微分干涉差显微镜（Nomarski optics）可直接观察其管腔。事实上，无需标记即可通过低倍解剖显微镜观察突变体囊状导管的形态，该方法已在正向遗传筛选中被高效用于鉴定参与管状结构形成的基因。11然而，为了更清晰地观察管道的形态，并区分其极化膜、细胞骨架组分、不同细胞器及其他亚细胞结构，需要进行标记，并采用更高倍率的荧光解剖显微镜和共聚焦显微镜观察。尽管管道的精细结构在标记和显微成像方面带来诸多挑战，但可通过各区室特有的标志性分子来区分膜结构和亚细胞组分；同时，只要采取适当预防措施以避免引入人为假象，即可安全地将线虫样本装载用于显微观察（参见 实验方案 以及 讨论可通过免疫组织化学方法在固定样本中进行标记，或通过构建转基因线虫实现在其自身启动子或排泄管特异性启动子调控下表达荧光融合蛋白进行标记 在体内 成像。本方案描述了后一种标记技术（有关抗体染色，请参见 accompanying paper on intestinal tubulogenesis）3).
结合的能力 在体内 功能缺失或功能获得研究 在体内 在整个发育过程中对单细胞水平进行成像分析使得 秀丽隐杆线虫 排泄管是进行单细胞管状发生分子与细胞分析的极具优势的模型。可利用野生型或带有标记的转基因动物开展正向或反向遗传学筛选，以鉴定管腔形态发生表型（例如囊肿）及其潜在的基因缺陷。此外，此类筛选也可从突变体表型出发例如，囊状管）并鉴定该表型的抑制因子或增强因子，以识别与导致突变表型的基因存在功能互作的基因。导致突变表型的遗传缺陷可引起功能丧失（例如, 通过 基因缺失）或获得（例如, 通过 一种激活突变或通过引入过量基因拷贝）来研究其功能。正向诱变或系统性RNA干扰（RNAi）筛选无需预先假设基因功能，可无偏倚地鉴定参与特定功能的基因。鉴于全基因组范围的RNAi饲喂文库已可获得，几乎每个基因均可通过RNAi轻松实现敲低 C. elegans，使得任何一个感兴趣的基因或任何一组基因（例如，在靶向筛选中）也可以通过反向遗传学方法快速检测其效应。为了展示多种方法的可能组合，本文描述了一项靶向RNAi相互作用筛选实验，起始于一个表达细胞质绿色荧光蛋白（GFP）标记的囊状排泄管显性获得功能突变体。该突变表型由过表达产生 erm-1，一种高度保守的 C. elegans 膜-肌动蛋白连接蛋白家族 Ezrin-Radixin-Moesin（ERM）的同源物，该家族已在多个物种中被证实参与管腔形态发生及膜结构组织12. C. elegans ERM-1 定位于内部器官（如排泄管和肠道）的管腔膜，并且在两者管腔的形成过程中均是必需的13ERM-1 过表达将过量的肌动蛋白和囊泡募集至管腔膜，增加向管腔内的物质转运，导致形成较短的囊状管腔和带有增厚肌动蛋白下涂层的皱缩管腔膜9该方案描述了如何构建表达标记融合蛋白（或其他蛋白）的排泄管转基因品系；如何利用这些品系开展靶向RNA干扰（RNAi）筛选，以鉴定影响排泄管表型的修饰因子；以及如何通过荧光解剖显微镜和共聚焦显微镜对筛选结果进行可视化分析，包括对具有信息量的管状发生表型进行简单量化的方法。有关其他标记技术及针对常致死性管状发生基因优化的RNAi实验细节，可参见同期发表的关于肠道管状发生的研究论文。3所有方法均可以不同组合方式用于探究导管管状形成过程中的其他问题。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;克隆&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>质粒 pPD95.75</td><td>Addgene</td><td>目录号 37464</td><td></td></tr><tr><td>PCR试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>目录号 27106</td><td></td></tr><tr><td>连接试剂盒</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>货号 E2611L</td><td></td></tr><tr><td>DNA标记</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 SM1331</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖 DNA 级</td><td>Fisher Scientific</td><td>目录号 BP164-100</td><td></td></tr><tr><td>感受态细胞</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat. No. C2987H</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>产品编号 BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>货号 ED-1KG</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号 A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号 BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR仪&amp;nbsp;</td><td>MJ Research</td><td>产品编号 PTG-200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>货号 5415C</td><td></td></tr><tr><td>水浴</td><td>精准科学&amp;nbsp;</td><td>货号 666A3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号 09-528-165</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳电源</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号 45-000-465</td><td></td></tr><tr><td>分子成像仪&amp;nbsp;Gel Doc XR 系统</td><td>Bio-Rad</td><td>产品编号 1708195EDU</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>产品编号 ND1000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 相关&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;参见参考文献&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt; 用于标准的 C. elegans 培养与保种操作。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LB培养基与平板&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;参见参考文献&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt; 用于实验方案。</td></tr><tr><td>胰蛋白胨&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>货号 611845000</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD Biosciences</td><td>目录号 212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>目录号 S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>目录号 214040</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>货号 A0116</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Fisher Scientific</td><td>目录号 BP912</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;M9 培养基&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;参见参考文献&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt; 用于实验方案。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>目录号 S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>目录号 P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>目录号 S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>货号 M2773</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NGM 平板 &lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;参见参考文献&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt; 用于实验方案。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>产品编号 S7653</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>目录号 211677</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>Cat. no. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>货号 214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>目录号 M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>目录号 C3881</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>目录号 C8667</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>目录号 P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>目录号 P0662</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNAi 平板&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;参见参考文献&lt;sup&gt;21&lt;/sup&gt; 用于实验方案。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>目录号 S7653</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>目录号 211677</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>货号 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>目录号 214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>产品编号 M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>产品编号 C3881</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>目录号 C8667</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>货号 P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>产品编号 P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&amp;nbsp;</td><td>US Biological</td><td>货号 I8500</td><td></td></tr><tr><td>羧苄西林</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号 BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号 SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>目录编号 50371500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细菌&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 细菌</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 细菌</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;全基因组RNAi文库&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ahringer全基因组RNAi饲喂文库（货号&lt;sup&gt;21,58,59&lt;/sup&gt;)</td><td>Source BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans ORF-RNAi 饲喂文库（参考文献&lt;sup&gt;60&lt;/sup&gt;)</td><td>Source BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;成像相关&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>利多卡因</td><td>MP Biomedicals,LLG</td><td>目录号 193917</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空润滑脂硅酮</td><td>Beckman</td><td>目录号 335148</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>目录号 4448</td><td></td></tr><tr><td>组织培养板，6 孔&amp;nbsp;</td><td>康宁公司</td><td>目录号 08-772-33</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ-U 解剖显微镜（Nikon）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX12 体视显微镜（Olympus），配备高倍立体荧光附件（Kramer Scientific）、带 Q capture 软件的 CCD 相机和 X-Cite 荧光灯（Photonic Solutions）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SL 激光扫描共聚焦显微镜（Leica Microsystem）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>安装在ECLIPSE Ti-E倒置显微镜（Nikon）上的C2激光扫描共聚焦显微系统</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

thec. elegans排泄管作为细胞内管腔形态发生和单细胞管状结构形成的模型体内单细胞中的极性膜生物发生：gfp融合蛋白标记、rnai相互作用筛选与成像

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

四个 秀丽隐杆线虫 排泄管是由单个细胞延伸出的狭窄管道，贯穿整个动物体，其内部具有几乎同等长度延伸的细胞内内管，通过具有顶膜特性的膜结构和膜下细胞骨架构建并稳定管腔。排泄细胞在形成这些管道时长度约伸长2,000倍，使该模型成为在体内研究从头极化膜生物合成、细胞内管腔形态发生及单细胞管状结构形成的独特体系 在体内 评估 从头 极性膜生物合成、细胞内管腔形态发生及单细胞管形成。本方案展示了如何结合标准标记、功能获得与功能缺失的遗传学或RNA干扰（RNAi）以及显微技术，利用该模型在分子水平上对这些过程进行可视化解析和功能分析。作为标记方法的示例，本方案概述了构建表达荧光融合蛋白的转基因动物，以实现对管形成过程的活体分析。作为遗传学方法的示例，重点介绍了基于RNAi的视觉互作筛选的关键环节，该筛选旨在修饰一种功能获得性的囊状管表型。文中具体描述的方法包括：通过表达荧光蛋白对管道进行标记与可视化；构建靶向RNAi文库并设计RNAi筛选策略，用于管道形态发生的分子分析；通过荧光显微镜观察评估管道表型的改变，并对其进行评分；利用共聚焦显微镜高分辨率地表征管道的亚细胞组分；以及对可视化参数进行定量分析。该方法适用于希望利用中国台湾产线虫（C. elegans）排泄管系统来鉴定和表征在进化上保守的细胞内管腔与单细胞管形态发生相关基因的研究人员。 秀丽隐杆线虫 利用排泄管鉴定和表征参与细胞内管腔及单细胞管形态发生这一进化保守过程的基因。

本方案描述了如何使用 秀丽隐杆线虫 排泄管用于在单个细胞中进行细胞外管状结构形成的视觉与分子分析，以及细胞内管腔形态发生的观察。在从中胚胎期到成体的延伸过程中，四条排泄管持续扩展其基底外侧膜和顶端/管腔膜，同时扩展其小管状结构及内体样内膜系统，从而为研究提供了一个独特的模型 体内 分析 从头合成 极化膜生物发生图1）。通过表达特定的荧光融合蛋白（见方案第1部分），可对顶膜、细胞质以及内体与胆小管囊泡等亚细胞结构进行可视化观察，并可在单个转基因动物中通过双标或三标方法将这些结构彼此区分开来。图2）。一种独特的排泄管表型（图3A–B) 通过过表达一种顶膜相关分子（ERM-1）而产生，用于演示如何开展靶向RNAi筛选，以鉴定在顶膜和管腔形成过程中发挥功能的基因；这作为在此模型中对极化膜形成的分子与可视化分析的一个示...

上述 秀丽隐杆线虫 排泄管是用于可视化研究的单细胞独特模型 在体内 分析 从头 极性膜生物合成。本方案描述了标准遗传学/RNAi与成像技术的结合方法，可适用于鉴定和表征调控单细胞管状发生以及顶膜和管腔生物合成的分子。

TheC. elegans排泄管作为细胞内管腔形态发生和单细胞管状结构形成的模型体内单细胞中的极性膜生物发生：GFP融合蛋白标记、RNAi相互作用筛选与成像

秀丽隐杆线虫（C. elegans）的四条排泄管是由单个细胞延伸出的细长管道，贯穿整个虫体长度，其管腔由具有顶膜特征的膜结构及膜下细胞骨架构建并维持，且细胞内管状结构几乎同步延伸至相同距离。排泄细胞的长度约伸长了2000倍以形成这些管道，使其成为在活体条件下研究从头极性膜生物合成、细胞内管腔形态发生及单细胞管状结构形成的独特模型。本实验方案展示了如何结合常规标记技术、基因功能获得与缺失、RNA干扰（RNAi）以及显微镜分析方法，利用该模型在分子水平上对上述过程进行可视化解析与功能研究。在标记方法示例中，本方案概述了构建表达荧光融合蛋白的转基因动物，用于管状结构形成的活体观察；在遗传学方法示例中，重点介绍了基于RNAi的视觉互作筛选策略，旨在调控功能获得性囊状排泄管表型。具体方法包括：通过表达荧光蛋白标记并可视化排泄管；构建靶向RNAi文库，并设计RNAi筛选策略以进行排泄管形态发生的分子分析；通过荧光显微镜观察评估排泄管表型的改变，并进行评分；利用共聚焦显微镜高分辨率地表征排泄管的亚细胞组分；以及对可视化参数进行定量分析。该方法适用于希望利用C. elegans排泄管系统鉴定和表征在进化上保守的细胞内管腔与单细胞管状结构形态发生相关基因的研究人员。

本标准实验流程组合的总体目标是展示如何利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）的排泄管进行单细胞管状结构、细胞内管腔以及全新极化膜生物发生的活体分析。该方法有助于解答管状结构形成和细胞极性研究领域中的关键问题，例如细胞内延伸的管腔是如何建立的，以及哪些分子对于顶膜的扩展至关重要。该模型系统的主要优势在于，可在单个细胞中通过活体观察直观地检测顶膜相对于基底侧膜高达2000倍的巨大扩张。通常，初次接触该模型的研究人员会遇到困难，因为秀丽隐杆线虫（C. elegans）的排泄管非常纤细，对渗透压应激以及成像所需的各种操作极为敏感。本关于排泄管管状发生过程的视频，与另一段关于肠道管状发生过程的视频相互配套，二者共同为体内极化膜生物发生的分析提供了互补的研究模型。在标记方法方面，配套的肠道管状发生视频中描述了另一种标记方案，即使用荧光标记的抗体对细胞组分进行染色。该技术同样适用于排泄管。本视频介绍了利用荧光标记融合蛋白的活体动物进行活体成像分析的方法。文中描述了如何构建包含目的基因与GFP连接的质粒，以及如何制备表达融合蛋白的转基因动物。该方案还提供了排泄管特异性膜标记物、细胞器标记物以及启动子的示例。同时提供了两种标记方法的其他资源。在本视频中，利用RNAi筛选一种转基因品系中能够修饰囊状排泄管表型的因子，该品系以GFP标记排泄管的细胞质。该表型由ERM-1（一种管腔形态发生基因）的过表达引起。从含有氨苄青霉素和四环素的平板上过夜培养的RNAi表达细菌中挑取单菌落，接种至600 µL含氨苄青霉素的液体LB培养基中。将这些试管置于37°C摇床中振荡培养6小时。从液体培养物中，取70微升等分试样，接种到六孔RNAi板的孔中，每组设置两个或三个重复。然后，在20至22摄氏度下将RNAi板过夜培养。次日早晨，挑选三个L4期线虫，分别加入RNAi板的每个孔中。每个个体应看起来健康、营养良好，并在排泄管中表达相应的标记。随后，将培养皿在20至22摄氏度下孵育三天。在摄取RNAi细菌三天后，于解剖荧光显微镜下观察F1子代的排泄管表型。为了评估导管的延伸情况，需观察L3和L4幼虫期的线虫。进行此操作时，应准备一份包含所有可能表型的筛选记录表。文本方案中描述了多种导管表型。系统性地扫描各孔，首先从对照组开始，例如以空载体RNAi细菌喂养的线虫。先在低倍镜下使用明亮光线观察，然后在高倍镜下进一步检查，以发现诸如胚胎致死、不育、通体透明以及短粗体型等一般表型。在记录表上统计这些观察结果。其次，在荧光光源下观察排泄管表型，先使用较低放大倍数，再换用较高放大倍数。放大后评估可量化的表型特征，例如排泄管的长度、管腔的宽度或囊肿的大小。使用标记质粒（如 role）有助于成像，可使动物保持在原位而不向前移动。也可通过观察动物自身翻滚的情况，更清晰地评估表型。每块平板至少评分100只动物，以进行定量

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

C. 线虫排泄管作为细胞内腔形态发生和体内极化膜生物在单个细胞中的模型: GFP-融合、rna 干扰界面和成像的标记

C. elegans 胚胎是研究细胞生物学和发育过程的有力体系。本文介绍一种利用常见的落射荧光显微镜和开源软件，通过微分干涉差（DIC）光学或荧光技术对 C. elegans...

使用落射荧光显微镜和开源软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎进行成像

本文介绍了一种用于观察线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans早期胚胎发育的延时显微成像

本方案描述了如何在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

可视化神经母细胞胞质分裂过程 秀丽隐杆线虫 胚胎发生

本文展示了如何追踪和量化 C. elegans...

使用开源工具追踪和量化 C. elegans 的发育过程

透明的 C. elegans 肠道可作为“在体内 用于在多细胞管状结构形成过程中，在单细胞和亚细胞水平上研究顶-基底膜及管腔生物发生的组织腔室。本方案描述了如何结合标准标记、基因功能缺失/RNAi以及显微镜技术，在分子水平上解析这些过程。...

TheC. elegans肠道作为细胞间管腔形态发生的模型体内极化膜在单细胞水平上的生物发生：抗体标记、RNAi功能缺失分析与成像

本实验方案演示了如何利用绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白作为标记，并结合4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，在热应激条件下追踪蛋白质的核转位过程。DAPI染色步骤快速，且能有效保留GFP及蛋白质亚细胞定位信号。...

通过绿色荧光蛋白标记与4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色检测蛋白质亚细胞定位 秀丽隐杆线虫

本文介绍了一种组合方法，结合高分辨率显微镜、计算工具以及活体秀丽线虫（C.

亚细胞分辨率下利用各向同性光片显微镜与自动化细胞谱系分析记录秀丽隐杆线虫胚胎发育

本研究描述了一种半高通量实验方案，可在一次过夜实验中同时对80–100个C.

一种用于分析的半高通量成像方法与数据可视化工具包 秀丽隐杆线虫 胚胎发育

动态微管成像方案 体内 使用荧光标记的末端结合蛋白对秀丽隐杆线虫后侧微管（PLM）神经元中动态微管进行标记、成像和分析的方法已得到描述。 秀丽隐杆线虫.

秀丽隐杆线虫神经元中微管动态与取向的活体评估

本方案描述了一种简单的微流控芯片设计及微加工方法，可用于在持续供应食物的条件下培养秀丽隐杆线虫（C.

一种用于长期培养与成像的简易微流控芯片 秀丽隐杆线虫

本方案描述了基于微流控技术的秀丽隐杆线虫（C.

高分辨率秀丽隐杆线虫（C. elegans）在所有幼虫阶段的成像

了解秀丽隐杆线虫排泄管单细胞管腔发生与极化膜生物发生的活体分析方法。该方案结合遗传学、RNAi技术与成像技术，可直观检测顶端膜2000倍扩展，为研究细胞极性与膜发育提供重要模型。

TheC. elegans排泄管作为细胞内管腔形态发生和单细胞管状结构形成的模型体内单细胞中的极性膜生物发生：GFP融合蛋白标记、RNAi相互作用筛选与成像

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