Name: 用光学分馏塔和标准显微镜设备对小鼠黑质多巴胺能神经元数的视学估计 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学习使用标准显微镜设备对小鼠黑质多巴胺能神经元进行无偏立体学计数的方法。该技术无需专用立体学系统即可实现准确估计，为帕金森病临床前研究提供可靠的细胞定量方案。

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作者感谢Keali Röhm、Louisa Frieß和Heike Menzel提供的专业技术支持；感谢Helga Brünner在动物护理方面的帮助；以及感谢Chistopher S. Ward开发并分发用于ImageJ软件的光学分测器网格插件。

所有涉及动物的护理和使用均遵循适用的国际、国家和/或机构指南。该方案已获得德国维尔茨堡下弗兰肯行政区地方政府的批准。
1. 组织处理与免疫组织化学
<ol>
	<li>使用 CO2 或其他经批准的方法处死小鼠。</li>
	<li>使用 25 号针头和输注泵，对六只 12 周龄的 C56Bl/6N 雄性小鼠进行经心脏灌注，先用 10 mL 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，随后用 70 mL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 0.1 M PBS 灌注。 
	注意：PFA 具有毒性、致敏性及致癌性。</li>
	<li>使用脑组织切片模具，在距前囟 +0.74 mm 处的冠状面解剖小鼠脑组织（参见 Paxinos 和 Franklin 小鼠脑图谱14 中的图 25）。</li>
	<li>将包含黑质（SN）在内的脑背侧部分放入含 4% PFA 的 0.1 M PBS 溶液中，于 4 °C 浸泡固定 1 天。</li>
	<li>将 PFA 溶液更换为 30% 蔗糖/0.1 mol PBS 溶液以进行冷冻保护，并在 4 °C 下继续孵育 2 天。</li>
	<li>将脑背侧部分放入盛有最佳切割温度（OCT）包埋剂的冷冻模具中，并在液态干冰冷却的异戊烷中缓慢冷冻组织。 
	注意：干冰温度极低（-78 °C）；操作时需佩戴个人防护装备（PPE），包括手套。干冰会升华产生 CO2，因此应在通风橱内操作。</li>
	<li>在冠状面上连续切取 30-µm 厚的冷冻切片，从距前囟 2.46 mm 处开始（参见 Paxinos 和 Franklin 小鼠脑图谱14 中的图 51），至距前囟 4.04 mm 处结束（参见 Paxinos 和 Franklin 小鼠脑图谱14 中的图 64）。</li>
	<li>将四套系列切片分别储存于装有冷冻保护液（30% 甘油、30% 乙氧基乙醇和 40% PBS）的试管中，于 -20 °C 保存。在切片过程中，通过在脑干上部穿刺一个小孔来标记右侧半脑。</li>
	<li>进行免疫组织化学染色时，每只小鼠选取一套切片。将游离切片在摇床上用含 10% 正常山羊血清（NGS）、2% BSA 和 0.5% 去垢剂的 0.1 mol PBS 溶液预孵育 1 小时。然后将切片与兔抗小鼠酪氨酸羟化酶（TH；1:1,000 稀释）一抗在含 2% NGS、2% BSA 和 0.5% 去垢剂的 0.1 mol PBS 溶液中于 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>室温下加入抗兔 IgG 二抗（1:100 稀释）孵育 2 小时，随后加入亲和素/生物素试剂（1:100 稀释）。使用 3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）和 H2O2 进行显色孵育。染色后将切片贴附于涂覆载玻片上。 
	注：TH+ 多巴胺能黑质神经元见 图 1a。通过染色一套系列切片，每只动物可获得平均 13 张黑质致密部（SNpc）和网状部从前到后延伸的 SN 切片（图 1b）。各切片间隔 120 µm（1/4 系列）（图 1c）。 
	注意：DAB 为疑似致癌物，接触和吸入均有毒性。操作 DAB 时需使用个人防护装备。</li>
</ol>
2. 图像采集
<ol>
	<li>使用与显微镜连接的成像软件，对TH免疫组织化学染色的黑质切片进行数字采集。对同一系列的每张切片分别进行分析。</li>
	<li>使用成像软件的扫描切片功能。以 TIFF 格式保存，以获得高质量图像图2). 
	注意：图像分辨率为每厘米312像素。</li>
	<li>按压 &#34;获取&#34; 打开采集窗口（图2a).</li>
	<li>将 binning 设置为 &#34;2&#34; 用于灰度图像。 
	注意：采集灰度图像而非彩色图片可减小最终堆叠图像文件的大小（图2a).</li>
	<li>点击 &#34;实时展示&#34; 在采集窗口中打开一个新窗口，显示该切片的实时图像（图2a 和 b).</li>
	<li>点击 &#34;阶段&#34; 在采集窗口中选择 &#34;扫描载玻片&#34; 在下拉菜单中并勾选复选框（图2c). 
	注意：这使得能够在 x,y 平面内获取并校准高倍放大的 SN 图像（630 倍放大），以及获取连续图像间距为 1 &#181;m 在 z 平面内，覆盖一个总范围 13 &#181;m.</li>
	<li>选择 2.5X 物镜以定位 SN。</li>
	<li>将物镜更换为63倍。</li>
	<li>定义左上角（TopLeft）(图2c）和右下角（LowRight）（图 2d) 通过点击该部分 &#34;设置。&#34;</li>
	<li>点击 &#34;Z系列&#34; 并检查 &#34;Z平面序列&#34; 盒图 2e).</li>
	<li>使用成像软件，在每张切片上随机选取三个计数位点，测定切片的实际包埋厚度。具体操作为，点击 &#34;观察顶部偏移量&#34; 以确定该切片的顶部位置（图2e）然后点击 &#34;停止查看顶部视图&#34; (图2f）。然后，单击 &#34;底部视图偏移&#34; (图 2f）然后点击 &#34;停止查看底部视图&#34; (图 2g）。记录切片的厚度。</li>
	<li>减去 3 &#181;m （警戒区域）从顶部偏移量中减去，并将结果输入到顶部偏移量槽中（图 2h）。减去 13 &#181;m （光学分离器的高度）减去顶部偏移数值，并将结果输入到底部偏移参数栏中（图 2i）。选择以下参数：步数，14；大小，1.00（图2i). 
	注意：这对应于 z 平面中的厚度 13 &#181;m，使用1-&#181;m 连续图像间的距离</li>
	<li>选择保存文件的目录（图 2j).</li>
	<li>点击 &#34;序列&#34; 开始采集（图 2j).</li>
	<li>点击 &#34;处理&#34; 并选择以下参数： &#34;所有平面，&#34; 从 &#34;序列&#34; &#34;蒙太奇；&#34; 以及 &#34;快速&#34; 和 &#34;拼接&#34; 盒子，图像重叠率为10%（图 2k）。通过单击开始拼接图像 &#34;开始&#34;. 
	注意：这将生成用于分析的图像堆栈（图2l, 图3a- e).</li>
</ol>
3. 体视学评估的步骤
<ol>
	<li>使用 NIH ImageJ 软件 4.7 版对 SN 叠加图像进行分析。</li>
	<li>从 ImageJ.nih.gov 网站下载所需的两个插件： &#34;网格覆盖&#34; 插件15 以及 &#34;细胞计数仪&#34; 插件16按照所述安装这两个插件。</li>
	<li>为进行无偏倚体视学评估，定义计数参数如下：网格大小，130 x 130 &#181;m；计数框，50 x 50 &#181;m；以及光学分切器高度， 13 &#181;m.</li>
	<li>单击以打开图像 &#34;文件&#34;&#160;&#8594; &#34;开放&#34; (图4a) 使用以下方法设置图像比例尺： &#34;分析&#34;&#160;&#8594; &#34;设置比例尺&#34; 命令图4b）。在此步骤中，将定义的尺寸单位从像素更改为 &#181;m (图 4c). 
	注意：对于所分析的图像，425 像素对应于 100 &#181;m.</li>
	<li>选择 &#34;插件&#34;&#160;&#8594; &#34;网格&#34;&#160;&#8594; &#34;网格类型：线条&#34; 随机插入网格的命令。检查 &#34;随机偏移&#34; 盒。将网格中每个方格（grid-square）的尺寸定义为 130 &#181;m x 130 &#181;m = 16,900 &#181;m2 (图3b 和 图4d 和 e).</li>
	<li>将图像类型从16位更改为RGB颜色（单击 &#34;图像&#34;&#160;&#8594; &#34;类型&#34;&#160;&#8594; &#34;RGB 颜色&#34;) (图4f）。根据 Baquet 的描述定位 SNpc 等17. 用环状标记中脑黑质致密部（SNpc） &#34;画笔工具&#34; （画笔宽度：11）图3c 和 图4g-i).</li>
	<li>解开 &#34;设定比例尺&#34; 单击以执行命令 &#34;分析&#34; &#8594; &#34;设定比例尺&#34; &#8594; &#34;点击移除刻度&#34; (图 4j- l）以使计算能够以像素为单位进行，而非 &#181;m.</li>
	<li>截取屏幕截图图4m），保存图像文件，并使用 ImageJ 打开新文件（图4n）。选择 &#34;点&#34; (图4o）以及 25 的画笔宽度（图 4p). 标记所有与SN接触的网格方格，用于放置光学分离器（optical disector）图 4q）。对所有位于划定的黑质（SN）内（完全或部分）的光学分切器中的细胞数量进行分析。</li>
	<li>选择一个包含黑质（SN）部分的网格方格。在 ImageJ 中使用光标测量该方格的左上角，以确定起始的 x 和 y 坐标（图 4r). 
	注意：将插入坐标以用于使用光学分隔器定位 &#34;光学分隔器位置&#34; (图4s），如第4步所述。</li>
	<li>使用名为的电子表格模板计算光学分切器的位置 &#34;光学分隔器位置，&#34; 如步骤4所述。</li>
	<li>校准光学分离器（由 Christopher S. Ward 编写的宏） 补充文件) 通过点击 &#34;插件&#34; &#8594; &#34;宏&#34; &#8594; &#34;编辑&#34; (图 4t），打开 &#34;opt_dis_grid.txt&#34; 文件（图 4u，并定义其大小 &#34;用户网格&#34; 以像素为单位，对应光学分隔器的 x、y 维度（图4v）。选择一个尺寸 50 &#181;m x 50 &#181;m，因此用户网格一侧的尺寸定义为212.5像素（50 × 4.25像素）。</li>
	<li>通过插入定义光学分切器中心的 ImageX 和 ImageY 坐标，确定光学分切器在图像堆栈中的位置图4v）。运行宏（&#34;宏&#34; &#8594; &#34;运行宏&#34;) (图4w). 
	注意：该网格将从图像堆栈中消失（图3d 和 图4x）。当在 z 轴平面上向下移动时，光学分切器将持续存在（图 3e 和 图 4x).</li>
	<li>选择 &#34;插件&#34;&#160;&#8594; &#34;细胞计数仪&#34; 启动细胞计数插件（图4y）。启动细胞计数仪并选择一种标记类型（图4z）。放大图像（单击 &#34;+&#34;）并在200%放大倍数下进行细胞数量的体视学评估。</li>
	<li>通过其圆形或卵圆形的形态及细胞大小来鉴定多巴胺能神经元的胞体图1a）。使用体视学规则对细胞数量进行定量。 
	注意：由于光学分隔器是一个三维立方体（图 5a），将立方体的前面、左面和顶面（红色）定义为排除面。因此，不计数与红色线（左面和前面）或顶面相接触的TH+细胞。将细胞计数结果添加到已准备好的电子表格文件中，文件名为 &#34;细胞计数的计算&#34; （步骤5）。</li>
	<li>根据 SN 图像，使用与覆盖网格大小相同的 x、y 步长，计算用于下一次细胞计数的光学分视器应放置的下一个网格方格，图5b）和 &#34;光学分隔器位置&#34; 电子表格模板，如步骤 4 中所述。</li>
	<li>使用以下方法进行细胞数量估算 &#34;细胞计数的计算&#34; 电子表格（步骤 5）。</li>
</ol>
4. 使用“光学分隔器位置”电子表格模板计算光学分隔器位置
<ol>
	<li>使用“Optical disector position.xlsx”电子表格文件（图5b 和 补充文件），计算每个光学分切器在黑质（SN）轮廓内覆盖网格中所需放置的大小和位置。</li>
	<li>将“设定比例”（Set Scale）命令所定义的每微米像素数（pixel per µm）转换值，填入“Optical disector position.xlsx”文件中标记为黄色的位置（图6a 和 补充文件）。</li>
	<li>将计划使用的光学分切器尺寸以及覆盖网格中每个网格方格的尺寸（以单边长度表示，单位为 µm）填入标记为橙色的位置。 
	注意：结果将显示在橙色框旁边的红色框中。</li>
	<li>从黑质轮廓内已确定为起点的网格方格开始（如上文步骤3.9所述，选择一个网格方格作为起始点）。</li>
	<li>将步骤3.9中测得的x和y坐标填入文件中的绿色框内（通过这些数值，系统将计算出该第一个方格内光学分切器中心的x、y坐标，结果将显示在蓝色框中）。运行opt_dis_grid.txt宏（补充文件）。</li>
	<li>通过输入相对于第一个网格方格的网格方格间距（以方格数量计）来计算后续各个光学分切器的x、y坐标（填入棕色框中）。 
	注意：+x 表示网格方格位于右侧；-x 表示位于左侧；+y 表示位于下方；-y 表示位于上方。结果将显示在灰色框中。</li>
</ol>
5. 使用“细胞计数计算”电子表格估算细胞数量
<ol>
	<li>使用 West 发表的公式计算每只动物中 TH+ SN 细胞的估计数量（N） 等., 19913，其中 &#8721;Q- 定义为在一个脑切片的所有光学分隔器中计数的TH+神经元总数。 
	注意：光学分离器的高度（h）相对于所测切片厚度（t）的比值包含在该公式中。面积抽样分数（asf）定义为光学分离器（A optical disector）框的面积与网格步长（A x,y step）所构成的方形面积之比，即 A optical disector / A x,y step。图 3b），而切片采样分数（ssf）定义为整个连续切片脑组织中切片所占的比例： 
	<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/56103/56103eq1.jpg" /> 
	为确保高质量的定量估计，误差系数（CE）应低于0.10。使用Keuker提出的公式计算CE。 等., 200110: 
	<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/56103/56103eq2.jpg" /></li>
	<li>为对每只小鼠黑质（SN）内的细胞数量进行体视学估算，输入每只小鼠生成系列的总数量、光学分离器的高度以及光学分离器的x,y面积（A optical disector，单位为 &#181;m2），网格方格的 x,y 区域（A x,y 步长，以 &#181;m2），以及该切片的实测平均厚度（单位： &#181;m）在黄色框内使用 &#34;细胞计数计算.xlsx&#34; 电子表格文件 (图6b 和补充文件).</li>
	<li>按照第5步所述，分析来自同一动物的每个SN脑区切片。</li>
	<li>在每个光学分测器的灰色框中输入细胞计数，每行对应一个黑质切片，使用 &#34;细胞计数计算.xlsx&#34; 电子表格文件（补充文件). 
	注意：估计的细胞数量和计算的CE显示在蓝色框内（图6b).</li>
</ol>
6. 使用商用体视学系统估算细胞数量
<ol>
	<li>通过点击“Probes” → “Optical Fractionator Workflow”打开光学分馏器工作流程窗口，开始估算多巴胺能SNpc细胞数量。 
	注意：将弹出一个新窗口，用于确定是否将对一个新的SN系列进行计数。</li>
	<li>在弹出窗口中点击“Start a new subject”，开始一个新的TH+ SN切片系列。</li>
	<li>按照光学分馏器工作流程中的不同步骤进行操作。在第一步中设置实验对象：输入研究人员姓名、对象名称（SN组）及其他有用信息；输入该SN需计数的切片数量；输入切片的厚度；输入切片间隔，在本实验中为4；输入随机确定的起始切片编号。</li>
	<li>在第二步中，将显微镜调至低倍放大（2X物镜），并从菜单中选择“2X Mag Lens”。</li>
	<li>在第三步中，使用鼠标左键勾画感兴趣区域，即根据Baquet et al., 200917所描述的SNpc区域。</li>
	<li>在第四步中，将显微镜调至高倍放大，更换物镜至100X，并从下拉菜单中选择“100X Mag lens”。</li>
	<li>在第五步中，通过聚焦到切片的顶部和底部来测量贴片厚度。</li>
	<li>在第六步中，将计数框大小定义为50 × 50 µm；此即光学分隔器的（x,y）尺寸。</li>
	<li>在第七步中，将系统性随机采样（SRS）网格的大小设置为130 × 130 µm。</li>
	<li>在第八步中，输入3 µm的保护带区。</li>
	<li>在第九步中保存设置。</li>
	<li>最后，在光学分馏器工作流程的第十步中，对SRS网格内每个光学分隔器中的TH+多巴胺能细胞进行计数。为此，请先点击“Counting”按钮开始。</li>
	<li>完成一个切片后，点击“Begin Next Section”按钮，开始同一SN系列下一个SN切片的光学分馏器工作流程。</li>
	<li>当一个SN系列的最后一个SN切片完成定量后，点击“I've Finished Counting”。</li>
	<li>点击“View Results”按钮以显示体视学采样的结果。</li>
</ol>

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<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoarchitectonic+and+chemoarchitectonic+analysis+of+the+dopamine+cell+groups+in+the+substantia+nigra%2C+ventral+tegmental+area%2C+and+retrorubral+field+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).</li>
<li>German, D. C., Manaye, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+dopaminergic+neurons+%28nuclei+A8%2C+A9%2C+and+A10%29%3A+three-dimensional+reconstruction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat.</a> J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).</li>
<li>Smeyne, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+Effects+of+MPTP+and+Paraquat+on+Dopaminergic+Neurons+and+Microglia+in+the+Substantia+Nigra+Pars+Compacta+of+C57BL%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice.</a> PLoS One. 11 (10), e0164094(2016).</li>
</ol>

C. W. I. 曾担任 Merz Pharmaceuticals, LLC 和 TEVA 的科学委员会成员；曾获得 Ipsen、Merz Pharmaceuticals, LLC 和 Allergan, Inc. 提供的差旅资助；并在提交本研究之外，获得过来自 Merz、TEVA 和 Allergan, Inc. 的演讲酬金。J. V. 曾担任 Boston Scientific、Medtronic 和 AbbVie 的顾问，并在提交本研究之外，获得过来自 Medtronic、Boston Scientific、AbbVie、Bial、Allergan 和 GlobalKinetics 的酬金。

体视学研究始于组织处理。在对黑质组织进行连续切片时，必须小心操作，以防止在体视学分析过程中切片丢失。此外，一个关键步骤是对一侧半球进行标记，以便在进行体视学分析时区分左侧和右侧黑质。在本研究中，在脑干上部打一个微小孔洞的方法取得了最佳效果。另外，由于光学分馏法要求将组织切成约30–40 µm的厚片，而不是免疫组织化学中常用的5–10 µm切片，因此必须确保抗体及其他孵育液在免疫组织化学染色过程中能够充分渗透组织，例如可通过使用去污剂来实现。
使用TH抗体对多巴胺能神经元进行免疫组织化学染色可标记黑质（SN）神经元，以及位于SN内侧的腹侧被盖区（VTA）内的神经元和红核后区的神经元。因此，在对黑质进行体视学分析时，另一个关键点是了解小鼠黑质的解剖结构，因为仅通过标准的免疫组织化学或组织学染色无法单独可视化SN神经元。相反，识别下丘脑核、红核后区和VTA等解剖标志对于确定黑质的完整范围至关重要17,18,19</...

在临床前帕金森病研究中，神经元细胞数量的定量对于确定黑质（SN）内的神经退行性变程度至关重要1,2。对特定区域内细胞数量进行无偏倚体视学估算被认为是金标准3,4,5。
在无偏立体学出现之前，人们通过调整计数的细胞轮廓来校正神经元在切片中可见概率的差异，从而评估切片中的神经元数量。其中最常用的方法之一是采用阿伯克龙比（Abercrombie）所描述的对定量细胞计数进行校正的方法。6该方法试图考虑到，如果同一细胞的片段出现在相邻的薄切片中，则该细胞可能被多次计数。因此，Abercrombie 和其他研究者提出了需要对被计数细胞的形状、大小和方向作出假设的计算公式。7,8然而，这些假设通常无法实现，因而导致系统性误差，并偏离实际的细胞数量（即， 偏差）。此外，增加采样量也无法降低该偏差3.
使用光学分数法进行细胞数量的体视学估算时，通过应用数学原理直接在定义的三维体积内估算细胞数量。该方法的优点在于无需对所计数细胞的形状、大小和方向作出任何假设。因此，估算出的细胞数量更接近真实值，并且随着样本量的增加而愈加接近真实值。即， 无偏倚的3由于在使用体视学方法时必须遵循诸多规则以确保方法的无偏性，因此已开发出即用型商业体视学系统（综述见 Schmitz 和 Hof，2005）4）。专业的体视学系统采用基于设计的体视学方法进行 先验的 用于体视学评估的明确定义的探针和采样方案，可确保对被分析细胞的形状、大小、空间分布和方向具有独立性4,9然而，市面上可购得的体视学系统价格昂贵，这可能会限制其在新研究中的应用。
本研究的目的是开发一种实用的技术，用于基于设计的体视学方法估算小鼠黑质中多巴胺能细胞数量，采用光学分数法并使用常规显微镜设备即， 光学显微镜、标准显微镜软件和电动x、y、z载物台。为此，本文提供了处理小鼠脑组织以及使用基于设计的无偏立体学方法估算黑质（SN）细胞数量的逐步操作指南。此外，还提供了用于计算估算细胞数量和误差系数（CE）的模板。
本文所述方法不仅限于黑质的分析，还可适用于小鼠或大鼠脑内其他解剖学定义区域的研究。例如，已有研究采用无偏倚体视学方法估算海马10和蓝斑11中的神经元数量。此外，该方法也可用于评估除神经元以外的其他细胞类型，如星形胶质细胞12和小胶质细胞13。因此，对于希望在研究中应用无偏倚体视学方法但不愿花费大量资金购买体视学系统的科研人员而言，该方法具有重要应用价值。

<table><tbody><tr><td>Paxinos小鼠图谱</td><td></td><td></td><td>小鼠脑 乔治·Paxinos Keith B.J. Franklin 版权 @2001 由 Academic Press 所有 CD 光盘设计 &amp;以及由 Paul Halasz 创建</td></tr><tr><td>脑组织切片矩阵 小鼠</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS 001-1</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>默克</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖 /D(+) 蔗糖</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>默克</td><td>1040931000</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;磷酸盐缓冲盐水成分：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>默克</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>二水合磷酸氢二钠</td><td>默克</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>默克</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ml</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐/DAB片剂 10mg pH 7.0</td><td>Kem En Tec</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;30% 过氧化氢</td><td>默克</td><td>1072090250</td><td></td></tr><tr><td>亲和素/生物素试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>32050</td><td>标准超敏ABC染色试剂盒，1:100</td></tr><tr><td>兔抗小鼠酪氨酸羟化酶抗体</td><td>abcam</td><td>Ab112</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗兔IgG H+L</td><td>向量实验室</td><td>BA-1000</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StereoInvestigator 11.07 版本</td><td>MBF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX53显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>3.3.0.2</td><td></td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>版本 4.7</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-TEK OCT</td><td>樱花</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>网格覆盖插件</td><td>Wayne Rasband</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td></tr><tr><td>细胞计数插件</td><td>Kurt de Vos</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>光学分隔器宏</td><td>Christopher Ward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6N 雄性小鼠</td><td>查尔斯河实验室，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 涂层载玻片</td><td>兰根布林克，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 针头 Microlance 3</td><td>BD</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>REGLO 模拟输注泵</td><td>Ismatec</td><td>ISM 829</td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator 系统</td><td></td><td></td><td>StereoInvestigator 版本 11.07</td></tr><tr><td>BX53显微镜</td><td></td><td></td><td>BX53显微镜</td></tr><tr><td>自选立体学</td><td></td><td></td><td>Visiview</td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td></td><td></td><td>Axiophot2</td></tr></tbody></table>

使用光学分数法和标准显微镜设备对小鼠黑质中多巴胺能神经元数量进行体视学估算

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

在帕金森病的临床前研究中，分析黑质纹状体束（包括对黑质内多巴胺能神经元丢失的定量）至关重要。目前，估计多巴胺能神经元总数的金标准方法是采用光学分馏器法的无偏立体学技术。由于光学分馏器法背后的理论较为复杂，且在缺乏专用设备的情况下难以实施立体学分析，因此市面上已存在多种商业化的完整立体学系统，这些系统包含必要的软件，专门用于细胞计数。然而，由于多种原因，购置专用的立体学设备并不总是可行的。因此，本报告介绍了一种利用常规显微镜设备进行多巴胺能神经元立体学定量的方法，所需设备包括光学显微镜、配备成像软件的电动载物台（x、y、z轴）以及用于分析的计算机。本文提供了使用光学分馏器法进行立体学定量的逐步操作说明，并附有用于计算估计细胞数量的预编程文件。为评估该方法的准确性，将其结果与商业立体学仪器获得的数据进行了比较。结果显示，本方案与商业立体学设备所得细胞数量具有可比性，从而证明了该方案在无偏立体学分析中的精确性。

采用本方法，右侧黑质（SN）中TH+多巴胺能神经元的估计数量在7,363至7,987个细胞之间，左侧SN中则在7,446至7,904个细胞之间。因此，右侧SN中多巴胺能神经元的平均数量（± 标准误，SEM）为7,647 ± 83个细胞，左侧SN为7,675 ± 66个细胞。每只动物的计算CE值均低于0.08（范围：0.073–0.079）（图7）。为了验证本方法与市售专用体视学系统之间结果的可比性，还使用体视学装置对SN神经元数量进行了定量分析（图8）。计数参数如下：网格大小为130 × 130 µm；计数框为50 × 50 µm；保护带为3 µm。切片在BX53显微镜上使用100×/1.25数值孔径物镜进行分析。根据平均切片厚度估算的TH+ SN神经元数量，在右侧SN中为7,067至8,105个细胞/SN，在左侧SN中为7,164至8,015个细胞/SN。右侧SN的平均神经元数量为7,535 ± 155个细胞，左侧SN为7,699 ± 128个细胞。每...

本研究提供了一种利用标准显微镜设备对小鼠黑质中多巴胺能神经元数量进行无偏立体学估算的逐步操作方案即， 一台光学显微镜、一个电动载物台（x、y、z平面）以及用于数字图像分析的公共领域软件。

在帕金森病的临床前研究中，对黑质纹状体束的分析，包括对黑质内多巴胺能神经元丢失的定量分析……

本方案的总体目标是利用标准显微镜设备，描述基于设计的体视学方法对小鼠黑质中多巴胺能细胞数量进行估算。该方法适用于使用基于设计的无偏体视学技术，在临床前帕金森病研究中估算小鼠黑质中多巴胺能神经元的数量。该技术的主要优势在于，仅需使用标准显微镜设备即可完成，无需配备 commercially available 完整体视学系统。演示该操作的是来自我实验室的技术员 Louisa Friez。首先将经多聚甲醛固定的 小鼠脑 置于脑切片模具中，并在前囟后 0.74 毫米处进行切割。将包含黑质（SN）的尾侧脑组织转移至含 4% PFA 的 0.1 摩尔溶液中，于 4 摄氏度固定过夜。第二天，将PFA更换为含30%蔗糖的0.1摩尔PBS溶液，在4摄氏度下继续孵育两天，以对样本进行冷冻保护。两天后，当脑组织沉入蔗糖溶液中时，将其放入盛有最佳切割温度化合物的冷冻模具中，并使用液态干冰冷却的异戊烷缓慢冷冻组织。使用冷冻切片机在冠状面上连续切取30微米的冷冻切片。通过在脑干上部区域打一个小孔来标记右侧半球。从bregma前2.46毫米处开始，至bregma后4.04毫米处结束，收集四套系列切片。将每套切片转移至装有防冻剂的试管中，并在-20°C下保存。使用与显微镜相连的成像软件，对经酪氨酸羟化酶免疫组织化学染色的黑质切片进行数字图像采集。首先，在每张切片上随机选择三个计数位点，确定切片的实际安装位置和厚度。首先点击“查看顶部偏移”以定义切片的顶部。然后单击“停止查看顶部”。接着，单击“查看底部偏移”，再单击“停止查看底部”。记录该切片的厚度。通过从顶部偏移量中减去3微米来计算保护区域，并将结果输入顶部偏移量框中。然后从顶部偏移量数值中减去光学分切器的13微米高度，并将结果输入底部偏移量框中。选择以下参数：步骤14，大小1.00。选择保存文件的目录。单击序列以开始采集。图像采集完成后，单击处理并选择以下参数：序列中的所有层面、拼接图、快速拼接和图像重叠率为10%的拼接选项，然后单击开始以拼接图像。这将生成用于分析的图像堆栈。首先，通过点击“文件”并选择“打开”来打开图像。使用“分析”菜单中的“设置比例”命令来设定图像比例。从这一步开始，将定义的尺寸单位从像素更改为微米。依次选择插件，然后选择网格，再选择网格类型为线条的命令，以随机插入一个网格。勾选随机偏移复选框。将网格中每个方格的大小定义为130微米×130微米，即16,900平方微米。通过点击图像，然后选择“类型”，再选择“RGB颜色”，将图像类型从16位更改为RGB彩色。定位黑质致密部。使用画笔工具并设置画笔宽度为11，圈选该区域。通过点击“分析”，然后选择“设置尺度”，再点击“移除尺度”来撤销尺度设置命令，以便以像素而非微米为单位进行计算。截取屏幕图像，保存图像文件，并使用ImageJ打开新文件。选择画笔工具并设置画笔宽度为

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

用光学分馏塔和标准显微镜设备对小鼠黑质多巴胺能神经元数的视学估计

多巴胺在中脑核团中受到独特调控，这些核团含有多巴胺神经元的胞体和树突。本文介绍一种解剖与样本处理方法，旨在最大化对啮齿类动物黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）中脑核团内多巴胺调控研究的结果质量，从而提升结论的可靠性与科学洞察力。...

黑质与腹侧被盖区多巴胺调节的全面分析

本视频展示了在经α-突触核蛋白预形成纤维预处理的胚胎小鼠多巴胺能神经元中，定量α-突触核蛋白聚集的过程。该方法详细说明了通过免疫荧光技术对含有α-突触核蛋白聚集体的多巴胺能神经元进行固定、染色和定量分析的步骤。...

研究α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠多巴胺能神经元中的聚集

来源：Olesen, M. V.,et al．采用光学分数法估算电休克疗法大鼠模型中的细胞数量．J. Vis. Exp.（2017）．...

使用光学分馏器技术定量大鼠脑组织中新生成的神经元

本方案描述了两种不同的环境干预方法以及一种同步进行的脑内灌注方案，用于研究成年小鼠中由环境诱导的、介导适应性行为和脑修复的脑部变化。...

成年小鼠中脑多巴胺能神经元数量的环境调节

在帕金森病（Parkinson's Disease, PD）中，黑质致密部（Substantia Nigra, SNc）的多巴胺能神经元发生退化，导致运动功能障碍。本文报道了一种实验方案：从酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,...

利用RNA测序和TH启动子驱动的eGFP表达在中脑培养物中可靠鉴定活体多巴胺能神经元

本文介绍了一种体视学方法——光学分馏器法，用于定量分析电休克刺激后大鼠海马中新生神经元的形成及其存活情况。当正确实施时，体视学方法的高灵敏度和高效率可确保以固定且预先设定的精度获得准确的估算结果。...

使用光学分数法估算电休克治疗大鼠模型中的细胞数量

在伏隔核中鉴定多巴胺 D1-α 受体对于阐明中枢神经系统疾病期间 D1 受体功能障碍至关重要。我们采用了一种新型的 RNA 原位 杂交检测方法，以可视化特定脑区中的单个 RNA...

通过一种创新的RNA 原位检测技术鉴定啮齿类动物伏隔核中的多巴胺D1-α受体

本文介绍了一种定量分析方法，通过免疫荧光染色、共聚焦显微镜和计算机辅助分析，确定突触蛋白相对于标记蛋白的分布情况。...

使用免疫荧光法量化小鼠脑内突触蛋白的异质性分布

脑区三维结构中神经元纤维的长度是量化特定神经元结构完整性或退变的可靠参数。本文以小鼠梅内特基底核内胆碱能纤维长度的测量为例，详细介绍了一种体视学定量方法。...

小鼠脑基底前脑Meynert核内胆碱能纤维长度的体视学估算

本文介绍了一种用于研究原代小鼠多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集的详细实验方案。通过预先形成的α-突触核蛋白纤维诱导神经元内磷酸化α-突触核蛋白的聚集。对免疫荧光标记的细胞进行自动化成像并结合无偏倚的图像分析，使该方案成为适用于中高通量筛选抑制α-突触核蛋白聚集药物的可靠方法。...

研究预制纤维诱导的α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠中脑多巴胺能神经元中的聚集

本文介绍一种用于自动半定量测定大鼠黑质致密部多巴胺能神经元数量的方法。...

使用自动图像分析法对啮齿类动物模型黑质中多巴胺能神经元密度进行半定量测定

学习使用标准显微镜设备对小鼠黑质多巴胺能神经元进行无偏立体学计数的方法。该技术无需专用立体学系统即可实现准确估计，为帕金森病临床前研究提供可靠的细胞定量方案。

使用光学分数法和标准显微镜设备对小鼠黑质中多巴胺能神经元数量进行体视学估算

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