使用光学分数法和标准显微镜设备对小鼠黑质中多巴胺能神经元数量进行体视学估算

本方案的总体目标是描述如何使用常规显微镜设备，通过基于设计的体视学方法对小鼠黑质中多巴胺能细胞数量进行无偏估计。该方法适用于在临床前帕金森病研究中，利用基于设计的无偏体视学技术对小鼠黑质中多巴胺能神经元数量进行估算。该技术的主要优势在于，仅需常规显微镜设备即可完成，无需配备 commercially available 完整体视学系统。

演示该操作的是来自我实验室的技术员 Louisa Friez。首先将经多聚甲醛固定的 小鼠脑 置于脑切片模具中，并在前囟后 0.74 毫米处进行切割。将包含黑质（SN）的尾侧脑组织转移至含 4% PFA 的 0.1 摩尔溶液中，于 4°C 下固定过夜。

第二天，将PFA更换为含30%蔗糖的0.1摩尔PBS溶液，在4摄氏度下继续孵育两天，以对样本进行冷冻保护。两天后，当脑组织沉入蔗糖溶液中时，将组织置于充满最佳切割温度化合物（OCT）的冷冻模具中，并使用液态干冰冷却的异戊烷缓慢冷冻组织。使用冷冻切片机在冠状面上连续切取30微米的冷冻切片。

通过在脑干上部区域打一个小孔来标记右侧半球。从bregma前2.46毫米处开始，至bregma后4.04毫米处结束，收集四套系列切片。将每套切片转移至装有防冻剂的试管中，并在-20°C下保存。

使用与显微镜连接的成像软件，采集经酪氨酸羟化酶免疫组织化学染色的黑质切片的数字图像。首先，在每张切片上随机选择三个计数位点，确定切片的实际安装位置和厚度。首先点击“查看顶部偏移”以定义切片的顶部。

然后单击“停止查看顶部”。接着，单击“查看底部偏移量”，然后单击“停止查看底部”。记录该截面的厚度。

通过从顶部偏移量中减去3微米来计算保护区域，并将结果输入到顶部偏移量框中。然后从顶部偏移量数值中减去光学分馏器的13微米高度，并将结果输入到底部偏移量框中。选择以下参数：步骤14，大小1.00。

选择保存文件的目录。单击序列以开始采集。图像采集完成后，单击处理并选择以下参数：序列中的所有层面、拼接图、快速拼接和图像重叠率为10%的拼接选项，然后单击开始以开始拼接图像。

这将生成用于分析的图像堆栈。首先，通过点击“文件”并选择“打开”来打开图像。使用“分析”菜单中的“设置标尺”命令来设定图像比例。

从这一步开始，将定义的尺寸单位从像素更改为微米。依次选择插件、网格，然后执行网格类型为线条的命令，以随机插入一个网格。勾选随机偏移复选框。

将网格中每个方格的大小定义为130微米×130微米，即16,900平方微米。通过单击图像，然后选择“类型”，再选择“RGB颜色”，将图像类型从16位更改为RGB彩色。定位黑质致密部。

使用画笔工具并设置画笔宽度为11，圈选该区域。通过点击“分析”菜单，选择“设定比例尺”，然后点击“移除比例尺”来撤销比例尺设置，以便以像素而非微米为单位进行计算。截取屏幕图像，保存图像文件，并使用ImageJ打开新文件。

选择画笔工具并设置画笔宽度为25。标记所有与黑质（SN）接触的网格方格，用于放置光学分形器。选择一个包含黑质（SN）部分的网格方格。在ImageJ中使用光标测量该方格的左上角，以确定起始的x和y坐标。

选择名为“光学分隔器位置”的电子表格模板，并计算光学分隔器的位置。然后按照实验方案文字部分所述，使用“细胞计数计算”电子表格估算细胞数量。此低倍图像显示了经酪氨酸羟化酶（TH）染色标记多巴胺能神经元后的小鼠脑组织切片。

高倍镜下显示TH阳性多巴胺能神经元。插图显示了该区域的放大视图。该图像展示了一组TH染色的黑质切片，覆盖了从小鼠黑质前部到后部的整个区域。

每个切片与相邻切片之间相隔 120 微米。通过本视频展示的方法以及商用体视学系统，分别估算了小鼠右侧和左侧黑质中酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元的数量。如图所示，两种方法得到的细胞计数结果相近，数据集之间无显著差异。

请注意，使用多聚甲醛可能具有极高危险性，因此在进行本实验操作时，必须采取预防措施，例如佩戴防护手套等个人防护装备。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用光学分割法及标准显微镜设备，对小鼠黑质中多巴胺能神经元数量进行无偏立体学估算。