Name: 干膜 Photoresist-based 电化学微流控生物传感器平台: 器件制备、片上检测制备及系统运行 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: 学习基于干膜光刻胶技术的电化学微流控生物传感器平台的制备方法，用于快速检测多种分析物。该技术采用停流法进行酶联测定，适用于即时诊断和药物定量分析。

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作者感谢德国研究基金会（DFG）对本工作的部分资助，资助编号为 UR 70/10-01 和 UR 70/12-01。

1. 使用 DFR 技术制备微流控生物传感器
<ol>
	<li>PI晶圆的制备。
	<ol>
		<li>将聚酰亚胺（PI）基底切割成直径6英寸的圆形晶片。将PI晶片置于120 °C烘箱中烘烤约1小时，进行脱水处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剥离工艺的第一次光刻步骤。
	<ol>
		<li>将匀胶机程序设置为3,000 rpm转速下旋转30秒，加速度为2,000 rpm/s。将PI晶圆放置于匀胶机上并固定，施加真空。滴加2 mL可用于剥离工艺的光刻胶，启动匀胶机程序。将晶圆从匀胶机上取下，并在热板上于100 °C条件下进行前烘2分钟。</li>
		<li>用肉眼调整所需的掩膜以在PI晶圆上进行电极图案化，然后以400 mJ/cm²曝光2 紫外光（365 nm）。将晶圆放入盛有与光刻胶匹配的显影液的容器中，置于旋转摇床轻微振荡1分钟。</li>
		<li>去除多余的光刻胶后，在湿法台用去离子水（DI-water）冲洗聚酰亚胺晶圆，然后用压缩空气吹干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>铂电极的沉积制备。
	<ol>
		<li>使用标准的物理气相沉积工艺在晶圆上沉积200 nm的铂19.</li>
		<li>将晶圆放入烧杯中，加入相应的剥离剂，置于轨道摇床上轻微振荡，以去除 lift-off 电阻，直至所有多余的铂完全去除。按照步骤 1.2.3 中所述方法冲洗并干燥 PI 晶圆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二次光刻步骤：形成绝缘层。
	<ol>
		<li>将PI晶圆放入预热至120 °C的烘箱中加热5分钟以去除水分。</li>
		<li>将旋涂仪的第一步程序设定为500 rpm转速下旋转5秒。第二步程序设定为4,000 rpm转速下旋转30秒，加速度为700 rpm/s。</li>
		<li>将PI晶圆放置在旋涂仪上并固定，施加真空。在启动旋涂程序前，滴加4 mL适当的环氧基光刻胶。</li>
		<li>在热板上于 95 °C 对涂覆的晶圆进行软烘 3 分钟。</li>
		<li>使用相应的对准标记和目镜调整晶圆上绝缘层的掩模。将晶圆暴露于 100 mJ/cm2 紫外光（365 nm）。</li>
		<li>曝光后烘烤时，将晶圆置于预热至95 °C的热板上，加热2分钟。</li>
		<li>将晶圆放入烧杯中，用适当的显影液显影光刻胶（例如， 在轨道摇床上用1-甲氧基-2-丙基乙酸酯处理2分钟（适用于SU-8情况）。</li>
		<li>先用异丙醇冲洗PI晶圆，然后按照步骤1.2.3所述进行冲洗并干燥。</li>
		<li>在150 °C的烘箱中对光刻胶进行3小时的硬烘焙。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等离子体辅助电极清洗。
	<ol>
		<li>为去除光刻胶残留物，使用标准等离子体设备进行氧气等离子体处理。启动清洗程序，采用200 W低频功率和100% O₂2 流速为250 sccm，总时间为3 min。</li>
		<li>将PI晶圆放入等离子体腔室，使用玻璃盖将其固定在接地板上，然后启动等离子体处理程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>银和氯化银沉积：片上参比电极的制备
	<ol>
		<li>使用对紫外线敏感的粘合胶带对晶圆上的铂接触垫进行钝化。将金属箔切割成5 mm宽、11 cm长的条状，并将其粘附到晶圆上，以保护不需要沉积银的区域。</li>
		<li>进行银沉积时，将超声波清洗仪（35 kHz）放入通风橱中，并将盛有银电解液（100 g/L Ag，pH 12.5）的容器置于清洗仪内。将超声波清洗仪温度设为室温，功率设为10%。 
		注意：银电解液具有高毒性，须极其小心地操作。切勿吸入其烟雾。</li>
		<li>将参比电极的主体接触端连接至恒流电源。使用标准连接线将对电极（浸入银电解液溶液中的银丝）连接至电流源。</li>
		<li>将电流源设置为直流电，电流密度为 -4.5 mA/cm²2，得到约0.3 µm/min的银沉积速率。开启超声波清洗仪，使电流源持续运行10分钟。用去离子水冲洗晶圆</li>
		<li>将盛有0.1 M氯化钾（KCl）溶液的容器放入超声波清洗仪中，用于参比电极的氯化处理。将晶圆的体接触端与浸入KCl溶液中的铂电极连接至恒流电源。</li>
		<li>将电流源设置为直流电，电流密度为 +0.6 mA/cm²2，沉积速率约为 0.075 µm/min。启动超声波清洗仪，使电流源持续运行 7.5 分钟。</li>
		<li>用步骤1.2.3中所述的方法清洗并干燥PI晶圆。</li>
		<li>300 mJ/cm² 紫外线（365 nm）照射后，移除紫外敏感胶带2 并按照步骤1.2.3中所述方法再次清洗和干燥PI晶圆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第三次光刻步骤：使用DFRs制作微流控通道。
	<ol>
		<li>将所需的DFR层裁剪至与晶圆尺寸相近的大小（20 × 20 cm）2）。将所需的掩膜固定到曝光装置上，并用肉眼将DFR层与掩膜对齐。用250 mJ/cm²的光照曝光光刻胶2 紫外光（365 nm）。</li>
		<li>去除光刻胶的保护膜，并将其在1%碳酸钠（Na₂CO₃）溶液中显影约2分钟（具体时间根据结构而定）2CO3使用预热至 42 °C 的标准超声浴（35 kHz）并设置超声功率为 100%，进行处理。为立即终止反应，将光刻胶在 1% HCl 溶液中于旋转摇床中震荡 1 分钟。按照步骤 1.2.3 所述，清洗并干燥每层 DFR。 
		注意：总共需要处理四层 DFR，如步骤 1.7 中所述：一层通道层、一层覆盖层和两层背面层（用于防止生物传感器末端弯曲）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PI基底上DFR层的层压。
	<ol>
		<li>将PI晶圆放置在透明投影胶片上，并使用标准胶带固定。在显微镜下，通过相应的对准结构将DFR层通道调整至PI晶圆上。</li>
		<li>对于层压，使用标准的热辊层压机，将上辊预热至100 °C，下辊预热至60 °C。设定压力为3 bar，前进速度为0.3 m/min。将带有固定DFR层的晶圆置于层压机中央并启动设备，使DFR通过层压机。将晶圆旋转180°后重复此步骤。</li>
		<li>为防止生物传感器弯曲，按照步骤1.8.1–1.8.2将两个制备好的背面层覆合到晶圆上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用疏水性阻断屏障并密封芯片。
	<ol>
		<li>从DFR通道层的前端移除保护层：将标准胶带贴在DFR一端，向上拉起以剥离保护层。使用装有0.004英寸管的手动点样器，将溶解的聚四氟乙烯液滴点入绝缘层的孔穴中。按照步骤1.8所述方法，将覆盖用DFR层与通道层进行覆膜，以密封微流控芯片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微流控生物传感器的硬烘
	<ol>
		<li>移除盖层和背面DFR层上的所有保护膜。使用普通剪刀将生物传感器裁切成条状。将芯片置于160 °C烘箱中固化3 h。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 芯片上检测固定化步骤
<ol>
	<li>在通道的固定区域吸附亲和素。
	<ol>
		<li>在 pH 7.4 的 10 mM 磷酸盐缓冲液（PBS）中配制浓度为 100 µg/mL 的亲和素溶液。</li>
		<li>将 2 µL 亲和素溶液加入生物传感器的入口。 
		注意：液体通过毛细作用力充满通道，直至到达疏水性阻断屏障。</li>
		<li>为确保在整个孵育过程中液体始终停留在屏障处，在芯片出口处加入 2 µL 去离子水。将芯片置于密闭容器中，在 25 °C 下孵育 1 小时。</li>
		<li>通过施加真空从芯片入口处移除多余试剂。在施加真空的同时，从出口处加入 50 µL 洗涤缓冲液（含 0.05% Tween 20 的 PBS）清洗通道。在持续抽真空条件下干燥通道 30 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭通道表面以抑制非特异性结合。
	<ol>
		<li>在 pH 7.4 的 10 mM PBS 中配制浓度为 1% 的牛血清白蛋白（BSA）溶液。</li>
		<li>用移液器将 2 µL 1% BSA 溶液加入通道入口，同时在出口处加入 2 µL 去离子水。将芯片置于密闭容器中，在 25 °C 下孵育 1 小时。按照步骤 2.1.4 的方法去除多余试剂并干燥通道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育带有生物素和 6-FAM 标记的 DNA 寡核苷酸。
	<ol>
		<li>在 pH 7.4 的 10 mM PBS 中配制不同浓度（0.001–5 µM）的 DNA 溶液。</li>
		<li>将 2 µL 某一浓度的 DNA 溶液加入入口，同时在出口处加入 2 µL 去离子水。将芯片置于密闭容器中，在 25 °C 下孵育 15 分钟。</li>
		<li>使用额外的生物传感器芯片，对其他 DNA 浓度重复步骤 2.3.2。</li>
		<li>按照步骤 2.1.4 的方法去除多余试剂并干燥通道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定带有 GOx 标记的 6-FAM 抗体。
	<ol>
		<li>在 pH 7.4 的 10 mM PBS 中配制浓度为 5 µg/mL 的 6-FAM 抗体溶液。</li>
		<li>将 2 µL 抗体溶液加入通道入口，同时向出口加入 2 µL 去离子水。将标记的抗体在密闭容器中于 25 °C 下孵育 15 分钟。按照步骤 2.1.4 的方法去除多余试剂。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用停流技术进行安培信号检测
<ol>
	<li>电化学检测用底物溶液的制备。
	<ol>
		<li>在超纯水中，用 pH 7.4 的 0.1 M PBS 配制 40 mM 葡萄糖溶液。</li>
		<li>进行预处理时，在超纯水中配制 pH 7.4 的 0.1 M PBS 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>工作电极的预处理。
	<ol>
		<li>使用定制的芯片支架，以便于芯片的放置以及流体和电连接。</li>
		<li>将生物传感器与恒电位仪进行电连接。使用定制的适配器和管路，确保微流控通道与注射泵及试剂储液罐之间的流体连接。启动连接恒电位仪的笔记本电脑，并启动注射泵控制器，以控制流经芯片的流体流速。</li>
		<li>手动启动注射泵，以 20 µL/min 的流速通入 0.1 M PBS。在工作电极相对于片上参比电极之间，交替施加 0.8 V 和 -0.05 V 的电压，每次持续 5 秒，共进行 30 个循环。随后，在工作电极上施加 0.8 V 电压，持续 60 秒，以实现电极的氧化处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用停流技术进行检测信号读取。
	<ol>
		<li>开始检测信号读取时，等待测量电流信号稳定。停止注射泵，将试剂从 0.1 M PBS 切换为 40 mM 葡萄糖溶液，并启动注射泵控制器中的软件；软件将自动停止流动 1、2 或 5 分钟，然后重新启动流动。观察由此产生的电流峰。 
		注：数据分析时可考虑电流峰或峰电荷量，具体如电化学信号读取模型所述（图 2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍的微流控电化学生物传感器制备方案，可实现一种低成本、小型化且易于使用的生物分子检测平台。根据在生物传感器上后续采用的不同检测方法，可检测多种不同的生物标志物。这使得该平台具有很高的通用性，可广泛应用于多个领域，从常规诊断检测（例如，在医生诊所中检测特定疾病的有无）到即时检测应用（例如，对患者进行治疗药物监测以实现个体化用药）。尤其在即时诊断领域，微型化生物传感器相较于传统方法具有诸多优势，后者通常需要复杂的实验室设备、专业技术人员以及大量的试剂和样本用量，且检测周期较长。
该生物传感器的制备必须严格遵循操作规程，否则可能出现制造问题。最常出现的问题之一是各层之间的错位。通过使用更先进的制备设备，可轻松解决这一问题，此类设备有助于更简便、更精确地对齐各层。
DFR 技术具有快速且低成本制造的优势。然而，该技术在分辨率方面存在局限性。例如，使用本文所述方案无法实现尺寸非常小的微流控通道（小于 100 µm）。在此情况下，必须使用高精度掩模对准仪和玻璃光掩模进行光刻。此外，通道过宽也可能带...

在过去的二十年中，诊断技术的应用已成为深入研究全球公共卫生发展的基础。传统上，实验室诊断工具被用于疾病检测。尽管这些工具在疾病诊断中仍发挥着关键作用，但近年来，由患者本人或在患者身边进行的即时检测（POCT）已变得越来越普遍。特别是在需要立即治疗的情况下，例如急性心肌梗死或糖尿病监测，快速确认临床发现至关重要。因此，人们日益需要那些可由非专业人员操作、同时能够在短时间内精确完成体外诊断检测的POCT设备1,2,3,4。
在即时检测（POCT）领域，已经取得了显著的进展。然而，仍有许多挑战需要克服5,6,7,8。为了使一种POCT平台能够成功推向市场，并具备与实验室诊断相竞争的能力，该设备必须严格满足以下要求：（i）提供精确且定量的检测结果，且结果需与实验室检测结果一致；（ii）具备较短的样本检测时间，以实现对患者的即时治疗；（iii）操作简单、易于使用，即使未经培训的人员也能操作，并尽量减少用户干预；（iv）包含低成本的传感器单元，专为一次性使用而设计。此外，在资源匮乏的环境中，无设备依赖的诊断方式更受青睐3,4,6。
由于这些严格的要求，迄今为止仅有两种基于电化学检测（例如，血糖试纸）和基于侧向流动免疫分析（例如，家用妊娠检测试纸）的即时检测（POCT）系统成功上市。然而，这两种系统均存在缺陷，例如性能不佳（即，血糖监测结果不准确，侧向流动分析仅能提供定性（阳性或阴性）检测结果）4,6。传统POCT系统的这些缺点促使人们越来越迫切地需要探索能够在即时检测场景下实现快速、低成本且定量检测的新技术4,5。
为应对POCT设备面临的这些挑战，干膜光刻胶（DFR）技术 recently 已被用于制造一次性且低成本的生物传感器9,10,11,12,13,14。与PDMS或SU-8等软质和液态光刻材料相比，DFR具有诸多优势：（i）可提供多种组分和厚度（从几微米到数毫米）；（ii）表面粗糙度高，有利于与多种材料粘附；（iii）厚度均匀性优异；（iv）适合低成本、简便且高通量的大规模生产制造；（v）可使用多种低成本工具（如普通剪刀）轻松裁切；（vi）通过将多层DFR堆叠在一起，可构建三维结构（如微流控通道）。
另一方面，与液态光刻胶相比，干膜光刻胶（DFR）的分辨率通常较低，这主要是由于膜层厚度以及因保护膜的存在导致掩模与DFR之间的距离增加，进而加剧了光散射所致。尽管如此，在集成式微流控生物传感器的制造中，DFR非常适用于低成本的大规模生产。
因此，本文介绍了基于DFR的电化学生物传感器微流控芯片的制备及其应用。详细实验方案描述了该生物传感器平台的每一步制备过程、基于DNA的模型检测方法在芯片上的固定化，以及利用停流技术进行电化学信号读取的过程。该通用型平台可结合不同的检测技术（例如，基因组学、细胞组学和蛋白质组学）或检测模式（例如，竞争型、夹心型或直接型），实现对多种生物分子的检测。基于此类DFR平台，我们课题组此前已成功实现了对多种分析物的快速、高灵敏度定量检测，包括抗生素13,15,16（四环素、普那霉素和β-内酰胺类抗生素）、肌钙蛋白I17以及P物质18。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>AP8525R</td><td>用作聚酰亚胺基底</td></tr><tr><td>MA-N 1420</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MA-N1420</td><td>用于定义铂沉积的剥离型光刻胶</td></tr><tr><td>Ma-D 533s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaD533S</td><td>MA-N1420 的显影液</td></tr><tr><td>Platinum</td><td>-</td><td>-</td><td>电极和焊盘材料</td></tr><tr><td>Ma-R 404s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaR404S</td><td>MA-N1420 的去除剂</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8-3005</td><td>用于定义电极区域并作为绝缘层的光刻胶</td></tr><tr><td>1-methoxy-2-propanol acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-65-6</td><td>SU-8 3005 的显影液</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>8.18766.2500</td><td>去除 SU-8 显影液</td></tr><tr><td>1020R</td><td>Ultron Systems Inc.</td><td>1020R</td><td>用于保护焊盘的紫外光敏胶带</td></tr><tr><td>Arguna S</td><td>Degussa</td><td>1935</td><td>用于参比电极上的银沉积</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Methrom</td><td>62308.020</td><td>用于银参比电极的氯化处理</td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>PC1025</td><td>干膜光刻胶</td></tr><tr><td>Sodium carbonat</td><td>Fluka</td><td>71352</td><td>Pyralux PC1025 的显影液</td></tr><tr><td>Hydrogen chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30720</td><td>用于终止干膜光刻胶的显影过程</td></tr><tr><td>Teflon AF 1600</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td>用于构建阻挡层</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA104</td><td>Mega Electronics</td><td>-</td><td>鼓泡蚀刻槽</td></tr><tr><td>FED 53</td><td>Binder</td><td>9010-0018</td><td>烘箱</td></tr><tr><td>SPIN150</td><td>APT</td><td>-</td><td>旋涂仪</td></tr><tr><td>Pr&amp;auml;zitherm</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>PZ 28-2</td><td>热板</td></tr><tr><td>Hellas</td><td>Bungard Elektronik</td><td>40000</td><td>曝光仪</td></tr><tr><td>Tetra30-LF-PC</td><td>Diener</td><td>-</td><td>等离子体处理仪</td></tr><tr><td>Univex 500</td><td>Leybold</td><td>-</td><td>物理气相沉积仪</td></tr><tr><td>Shaker S4</td><td>ELMI</td><td>-</td><td>轨道摇床</td></tr><tr><td>Sonorex Super 10 P</td><td>Bandelin</td><td>783</td><td>超声波清洗仪</td></tr><tr><td>6221 DC and AC</td><td>Keithley</td><td>-</td><td>直流与交流电流源</td></tr><tr><td>HRL 350</td><td>Ozatec</td><td>-</td><td>覆膜仪</td></tr><tr><td>Vaccum pen</td><td>EFD</td><td>-</td><td>真空吸笔</td></tr></tbody></table>

基于干膜光刻胶的电化学微流控生物传感器平台：器件制备、芯片上检测构建与系统操作

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

近年来，生物标志物诊断已成为人类疾病诊断不可或缺的工具，尤其是在即时检测诊断中。人们迫切需要一种易于使用且成本低廉的传感器平台，以实现对多种分析物（例如，生物标志物、激素和药物）进行定量且特异性的检测。为此，本研究采用了干膜光刻胶技术——该技术具有成本低、操作简便和高通量制造的优势——用于制备本文所展示的微流控生物传感器。根据后续所采用的生物测定方法，该多功能平台能够检测多种类型的生物分子。在器件制备过程中，铂电极通过唯一的一次洁净室工艺步骤被构图于柔性聚酰亚胺（PI）薄膜上。该PI薄膜作为电极的基底，并以环氧基光刻胶对电极进行绝缘封装。随后，通过将干膜光刻胶（DFR）薄膜在PI晶圆上进行显影和层压，形成微流控通道。在通道中引入疏水性止流屏障后，通道被分隔为两个特定区域：用于酶联测定的固定化区和用于安培信号读出的电化学检测池。
芯片上的生物测定固定化通过生物分子在通道表面的吸附来实现。葡萄糖氧化酶作为换能器用于产生电化学信号。在底物葡萄糖存在的情况下，会产生过氧化氢，并在铂工作电极上被检测到。采用停止流动技术以实现信号放大并实现快速检测。通过所介绍的微流控系统，可对不同的生物分子进行定量测量，从而提示不同类型的疾病，或在治疗药物监测方面，有助于实现个体化治疗。

微流控生物传感器平台的设计与制备：
微流控生物传感器芯片的制备采用标准光刻技术，在晶圆级上通过多层干膜光刻胶（DFR）实现。该制备策略依赖于将已图形化的DFR层层压到带有铂图案的聚酰亚胺（PI）基底上，从而形成微流控通道。不同制备步骤的简要概述见图1。单个6英寸晶圆包含130个微流控生物传感器，每个传感器的尺寸为8 × 10 mm2。
<img alt="微流控器件制备流程图；紫外曝光、电极、铂沉积步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56105/56105fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1. ...

采用低成本干膜光刻胶技术设计并制备了一种微流控生物传感器平台，用于多种分析物的快速、高灵敏度定量检测。该一次性使用系统通过停流技术实现对芯片上固定的酶联检测方法进行电化学读出。

近年来，生物标志物诊断已成为人类疾病诊断不可或缺的工具，尤其在即时检测诊断中发挥着重要作用。

本实验的总体目标是介绍一种基于低成本干膜光刻胶技术的多功能电化学微流控生物传感器平台，该平台可根据后续使用的固定化酶联分析方法检测多种类型的分析物。该方法有助于解决即时检测领域中的关键问题，例如不同药物（如抗生素）的定量分析，或癌症等多种疾病的诊断。该技术的主要优势在于，此处介绍的生物传感器主要由低成本材料制成，使用简便，并且在应用方面具有高度的多功能性。该方法的可视化演示至关重要，因为与干膜光刻胶相关的操作步骤较难掌握，其操作需要大量训练和实践经验。芯片上检测的固定与测量操作将由本课题组的学生助理 Eva Grether 进行演示。首先，将聚酰亚胺（PI）基底切割成六英寸的圆形晶圆。然后，将PI晶圆放入烘箱中，在120摄氏度下加热约一小时，进行脱水烘烤。为进行剥离工艺的第一次光刻步骤，将匀胶机程序设置为3000 rpm转速下旋转30秒，加速度为每秒2000 rpm。将PI晶圆放置在匀胶机上，并通过施加真空固定。然后启动旋涂程序，加入两毫升光刻胶，以实现剥离工艺。从旋涂机中取出晶圆，并将PI晶圆在热板上于100摄氏度下预烘两分钟。用肉眼调整所需掩模，用于在PI晶圆上对电极进行图形化，然后用400毫焦每平方厘米的紫外光进行曝光。然后将晶圆放入装有与光刻胶匹配的显影液的烧杯中，置于轨道摇床上，轻轻摇动一分钟。光刻胶去除后，在湿法台用去离子水冲洗聚酰亚胺（PI）晶圆，随后用压缩空气吹干。接下来，采用标准的物理气相沉积工艺，在晶圆上沉积200纳米厚的铂，以形成电极。将晶圆放入烧杯后，加入相应的去除剂，去除剥离型光刻胶，同时在轨道摇床上轻轻摇动晶圆，直至所有多余的铂完全去除。随后按照前述方法冲洗并干燥聚酰亚胺（PI）晶圆，进行第二次光刻步骤，并按照文本方案中的描述清洗电极。接下来，使用对紫外光敏感的粘合胶带对晶圆上的铂接触焊盘进行钝化处理。为此，将铝箔切成宽五毫米、长11厘米的条状，并将其贴附在晶圆上，以保护不需要镀银的区域。进行银沉积时，将超声波清洗槽放入通风橱中，并将盛有银电解液的容器放入清洗槽内。将超声波清洗槽设置为室温，并将功率调至10%。将参比电极的体相接触端连接至恒流电源。然后，使用标准连接线将对电极（一根浸入银电解液溶液中的银丝）连接到电流源。将电流源设置为直流（DC）模式，电流密度约为4.5毫安/平方厘米，以实现约0.3微米/分钟的银沉积速率。启动超声波清洗仪，并让电流源持续运行10分钟。10分钟后，用去离子水冲洗晶圆。进行第三次光刻步骤时，首先将干膜光刻胶层裁剪至与晶圆尺寸相近。将所需的掩膜固定在曝光装置上，并用肉眼将干膜光刻胶层与掩膜对准。然后，用 250 毫焦每平方厘米的紫外光照射光刻胶。去除光刻胶的保护膜后，在预热至 42 摄氏度、超声功率为 100% 的标准超声波浴中，使用 1% 碳酸钠溶液显影光刻胶约两分钟。为立即终止反应，在轨道摇床上用 1% 盐酸溶液振荡光刻胶一分钟。随后，像之前一样冲洗并干燥每一层 DFR。为了将DFR层压到PI基底上，先将PI晶圆放置在透明投影胶片上，并使用标准胶带固定。在显微镜下，利用相应的对准结构将DFR通道层调整至PI晶圆上的正确位置。进行压合时，使用标准热辊压合机，将上辊预热至100摄氏度，下辊预热至60摄氏度。将压力设置为3 bar，前进速度为0.3米/分钟。将带有固定DFR层的晶圆置于覆膜机中央，启动设备，使DFR随晶圆通过覆膜机。将晶圆旋转180度后，重复此步骤。接下来，将标准胶带贴在DFR的前端，向上拉扯，以去除DFR通道层正面的保护层。使用带有0.004英寸管的手动分配器，将溶解的聚四氟乙烯小液滴加入绝缘层的孔中。为密封微流控芯片，将覆盖用DFR层像之前一样覆合到通道层上。然后，通过首先移除覆盖层和背面DFR层上的所有保护膜，对微流控生物传感器进行硬烘焙。使用普通剪刀将生物传感器切割成条状。最后，在160摄氏度的烘箱中固化芯片3小时。为了将亲和素吸附到通道的固定区域，向生物传感器的进样口加入两微升亲和素溶液。为确保在整个孵育期间液体始终停留在屏障处，在芯片的出样口加入两微升去离子水。将芯片置于密闭容器中，在25摄氏度下孵育一小时。通过芯片的入口施加真空以去除多余的试剂。然后，在施加真空的同时，将50 µL洗涤缓冲液加入出口处洗涤通道。再用真空干燥通道30秒。通过在通道入口处加入两微升1% BSA溶液、出口处加入两微升去离子水，以封闭通道表面，抑制非特异性结合。将芯片置于密闭容器中，在25°C下孵育一小时，随后去除残留试剂，并按前述方法干燥通道。接着，将生物素和六个FAM标记的DNA寡核苷酸进行孵育：在入口处加入两微升特定浓度的DNA溶液，在出口处加入两微升去离子水。将芯片置于密闭容器中，在 25 摄氏度下孵育 15 分钟，然后移除接触的试剂并干燥通道。为了固定标记六羧基荧光素（FAM）的葡萄糖氧化酶抗体，向通道入口加入 2 微升抗体溶液，向出口加入 2 微升去离子水。再次将标记的抗体置于密闭容器中，在 25 摄氏度下孵育 15 分钟，然后移除多余的试剂。将流体PMMA垫片安装到生物传感器上，并将生物传感器与恒电位仪进行电连接。使用流体适配器实现注射泵与生物传感器之间的流体连接。手动启动注射泵，以0.1摩尔的PPS溶液、20微升/分钟的流速进行操作。在工作电极相对于芯片上的参比电极施加30个循环的交变电压，分别为0.8伏和0.05伏，每个电压持续5秒。随后，施加0.8伏电压60秒，以氧化工作电极。为开始检测信号读数，请等待测量电流信号稳定。在启动注射泵控制器上的软件之前，停止注射泵并将试剂从 0.1 摩尔 PPS 换为 40 毫摩尔葡萄糖溶液。在自动停止流动 1、2 或 5 分钟后，注射泵将重新启动流动。观察由此产生的电流峰值。电化学生物传感器包含一个具有两个不同区域的单一微流控通道，这两个区域由疏水性止流屏障隔开。其中一个区域为固定化区，通过生物分子的简单吸附将检测物质固定在此处；另一个区域为电化学池，用于进行生物传感器的安培法读数。对于生物传感器的安培法读数，采用所谓的停止流动技术。首先，施加酶底物葡萄糖的恒定流。待信号稳定后，停止流动。在停止流动阶段，葡萄糖被转化为过氧化氢并在通道内积累。通过重新启动流动，过氧化氢被冲洗通过电化学池并被检测，从而产生电流峰。根据结合的分析物量以及因此结合的葡萄糖氧化酶的量，信号高度会发生变化，从而得到如图所示的典型校准曲线。一旦掌握，若操作得当，生物传感器的制备大约可在10小时内完成。尽管检测的孵育和读取时间取决于所采用的检测方法，但通常可在三小时内完成。观看本视频后，您应能够充分理解基于电化学干膜光刻胶生物传感器的芯片检测制备与操作。在尝试该操作流程时，务必严格遵循所有实验步骤，并高度谨慎地进行操作。由于传感器性能在很大程度上取决于制备工艺，该技术的应用前景可拓展至个性化医疗领域，涵盖多种疾病的现场诊断及药物检测，从而推动个体化治疗的发展。请注意，操作银电解质溶液具有极高危险性，在进行本实验时，必须采取佩戴护目镜和适当手套等安全防护措施。

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