干膜 Photoresist-based 电化学微流控生物传感器平台: 器件制备、片上检测制备及系统运行

该程序的总体目标是引入一种基于低成本干膜光刻胶技术的多功能电化学微流体生物传感器平台，该平台能够根据随后使用的固定化酶联测定法来测量各种类型的分析物。这种方法可以帮助回答即时检测领域的关键问题，例如不同药物（如抗生素）的定量，或诊断各种疾病（如癌症）。该技术的主要优点是此处介绍的生物传感器主要基于低成本材料，易于使用，并且在应用方面具有高度的通用性。

这种方法的视觉演示至关重要，因为与干膜光刻胶相关的步骤很难掌握，因为处理需要大量的培训和练习。演示芯片分析固定化和测量的将是我小组的学生助理 Eva Grether。首先，将聚酰亚胺或 PI 衬底切割成 6 英寸的圆形晶圆。

然后，将 PI 晶圆放入 120 摄氏度的烤箱中，大约一小时进行脱水烘烤。要执行升空过程的第一个光刻步骤，请将旋转编码器编程为以 3000 rpm 的速度旋转 30 秒，加速度为每秒 2000 rpm。将 PI 晶圆放在旋转编码器上，并施加真空固定。

然后启动 spin coder 程序并分配 2 毫升光刻胶，启用剥离过程。从旋转编码器中取出晶圆，并在 100 摄氏度的热板上将 PI 晶圆软烘烤两分钟。调整所需的掩模，用肉眼在 PI 晶片上对电极进行图案化，并将其暴露在每平方厘米 400 毫焦耳的紫外线下。

然后将晶圆放入装有光刻胶匹配显影剂的碗中，放在轨道摇床上，让它稍微摇晃一分钟。去除访问光刻胶后，用淋浴在湿工作台上用去离子水冲洗 PI 晶片，然后使用压缩空气干燥。接下来，通过使用标准物理气相沉积工艺将 200 纳米的铂沉积到晶圆上，从而沉积铂以形成电极。

将晶片放入碗中后，将匹配的去除剂添加到碗中并去除剥离光刻胶，同时在轨道摇床上轻轻摇动晶片，直到去除所有进入铂。像以前一样冲洗和干燥 PI 晶片后，执行第二个光刻步骤并按照文本协议中的说明清洁电极。接下来，用紫外线敏感胶带钝化晶片的铂接触垫。

为此，将箔切成 5 毫米宽、11 厘米长的条状，然后将它们贴在晶圆上，保护部件不会沉积银。对于银沉积，将声波浴放入通风柜中，然后将装有银电解质溶液的容器插入浴中。将声波浴设置为室温并断电至 10%将参比电极的本体触点连接到恒流源。

然后，使用标准连接电缆将对电极（浸入银电解质溶液中的银线）连接到电流源。将电流源设置为直流，电流密度约为每平方厘米 4.5 毫安，从而产生大约每分钟 0.3 微米的银沉积速率。启动声波浴，让电流源运行 10 分钟。

10 分钟后，用去离子水冲洗晶片。要执行第三个光刻步骤，首先将干膜光刻胶层切割成与晶圆相似的尺寸。将所需的蒙版固定到曝光单元上，并使用肉眼将 DFR 图层对准蒙版。

然后，用每平方厘米 250 毫焦耳的紫外线照射光刻胶。去除光刻胶的保护膜，在 1% 碳酸钠溶液中显影光刻胶约两分钟，使用标准声波浴，预热至 42 摄氏度，声波功率为 100%要立即停止反应，请在轨道摇床上的 1% 盐酸浴中摇动光刻胶一分钟。像以前一样冲洗并擦干每个 DFR 层。

要将 DFR 层层压到 PI 衬底上，请将 PI 晶片放在透明高架箔上，并使用标准胶带固定。使用相应的对齐结构在显微镜下调整 PI 晶片上的通道 DFR 层。对于层压，请使用标准的热辊层压机，并将上辊预热至 100 摄氏度，将下辊预热至 60 摄氏度。

将压力设置为 3 巴，前进速度为每分钟 0.3 米。将带有固定 DFR 层的晶圆放在层压机的中间并启动它，以便将 DFR 推过层压机。将晶圆旋转 180 度后重复该步骤。

接下来，通过在 DFR 的一端放置标准胶带并将其向上拉，从 DFR 通道层的正面去除保护层。使用带有 0.004 英寸管的手动分配器将溶解的聚四氟乙烯的小液滴分配到绝缘层的孔中。要密封微流体芯片，请像以前一样将覆盖 DFR 层层压到通道层上。

然后，首先去除盖子和背面 DFR 层上的所有保护膜，对微流体生物传感器进行硬烘烤。使用普通剪刀将生物传感器剪成条状。最后，将薯片放入 160 摄氏度的烤箱中固化 3 小时。

为了将亲和素吸收到通道的固定区域，将两微升亲和素溶液分配到生物传感器的入口中。为确保液流在整个孵育时间内始终停在屏障处，请在芯片出口处分配 2 微升去离子水。将芯片在 25 摄氏度下在密闭容器中孵育 1 小时。

通过施加真空通过芯片入口去除多余的试剂。然后，在施加真空的同时，用分配到出口处的 50 微升洗涤缓冲液清洗通道。用真空吸尘器干燥通道 30 秒。

通过在通道入口处放置 2 微升 1% BSA 溶液，在通道出口处放置 2 微升去离子水，堵塞通道表面以抑制非特异性结合。将芯片在 25 摄氏度下在密闭容器中孵育 1 小时，然后像以前一样取出访问试剂并干燥通道。然后，通过在入口处分配 2 μL 一种浓度的 DNA 溶液，在出口处分配 2 μL 去离子水，孵育用生物素和 6 种 FAM 标记的 DNA 寡核苷酸。

将芯片在 25 摄氏度下在密闭容器中孵育 15 分钟，然后取出访问试剂并干燥通道。为了固定葡萄糖氧化酶标记的 6 种 FAM 抗体，将 2 μL 抗体溶液引入通道入口，将 2 μL 去离子水引入通道出口。同样，将标记的抗体在 25 摄氏度下在密闭容器中孵育 15 分钟，然后去除多余的试剂。

将流体 PMMA 垫片套在生物传感器上，并将生物传感器与恒电位仪电气连接。通过使用流体适配器实现注射泵与生物传感器的流体连接。以 0.1 摩尔 PPS 的流速以每分钟 20 微升的流速手动启动注射泵。

在工作电极与片上参比电极上施加 30 次 0.8 V 和 0.05 V 的交流电压循环，每次 5 秒。在此之后，通过施加 0.8 伏特的电压 60 秒来氧化工作电极。要开始检测信号读数，请等待测得的电流信号稳定下来。

停止注射泵并将试剂从 0.1 摩尔 PPS 切换到 40 毫摩尔葡萄糖溶液，然后在注射泵控制器上启动软件。在自动停止液流 1 分钟、2 分钟或 5 分钟后，注射泵将再次重新启动液流。观察产生的电流峰值。

电化学生物传感器包含一个单独的微流体通道，该通道具有两个不同的区域，由疏水阻止屏障隔开。固定区域，通过生物分子的简单吸收来固定测定，以及进行测定的安培读数的电化学池。对于生物传感器的安培读数，使用了所谓的停流技术。

首先，施加酶底物葡萄糖的恒定流动。信号稳定后，流量停止。在停止阶段，葡萄糖转化为过氧化氢并积聚在通道中。

通过重新启动流，过氧化氢被冲洗通过电化学池并在那里被检测到，从而产生电流峰值。根据结合分析物的量，以及结合的葡萄糖氧化酶的量，信号高度会发生变化，从而产生示例校准曲线，如图所示。一旦掌握，如果执行得当，生物传感器的制造可以在大约 10 小时内完成。

虽然检测孵育和读数时间取决于所采用的检测，但通常可以在三小时内实现。观看此视频后，您应该对基于电化学干膜光刻胶的生物传感器的芯片制造、检测制备和作有很好的了解。在尝试此过程时，请务必确保严格遵循所有协议步骤并非常谨慎地执行。

因为传感器的性能在很大程度上取决于制造过程。该技术的含义延伸到个性化医疗，涵盖不同类型疾病和药物的现场诊断，从而促进个体化治疗。不要忘记，使用银电解质溶液可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴护目镜和适当的手套。