Name: 用可寻址滴微阵列计算单细胞中的蛋白质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学习使用可寻址滴微阵列技术进行单细胞蛋白质绝对定量分析，以人癌细胞系中p53蛋白表达异质性为模型。该方法可精确测定目标蛋白拷贝数，揭示细胞群体异质性，为癌症生物学研究提供重要工具。

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ASR 设计了实验，开发了实验方案并分析了数据。SC 和 PS 进行了细胞大小实验。ASR 和 OC 撰写了稿件。作者谨此衷心感谢 David R. Klug 教授提供设备使用支持。作者谨此感谢帝国理工学院高级创客空间（Imperial College Advanced Hackspace）提供制造与原型开发设施的使用权限。

1. 准备
<ol>
	<li>制备芯片并打印抗体微阵列
	<ol>
		<li>将粘性硅胶/丙烯酸隔离器连接到已进行功能化处理、可支持抗体微阵列的盖玻片上。此装置称为芯片。 
		注：已有多种表面化学方法被测试其适用于可寻址液滴的性能。5 不同捕获试剂可能需要优化相应的表面化学条件。ADM 隔离器可商业购买，或通过激光切割丙烯酸材料自制（本文所用隔离器的 CAD 文件作为下载资源提供；参见补充代码文件）。</li>
		<li>开启微阵列点样仪，并将湿度设置为 75%。 
		注：相对湿度可减少点样溶液从微阵列针尖的蒸发，降低点内和点间变异。</li>
		<li>将微阵列针在针清洗液中进行超声清洗 5 分钟。使用洗瓶以超纯水冲洗针尖，并用氮气吹干。 
		注：应仅将针尖部分浸入清洗液中。若无法获得针固定装置，可使用带有适当钻孔的显微镜载玻片辅助固定。</li>
		<li>配制 5 mL 点样缓冲液，包含 3 × 柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液、1.5 M 甜菜碱，并添加 0.01% 十二烷基硫酸钠（SDS）。可长期保存于 4 °C。</li>
		<li>为制备点样溶液，将储存于 -80 °C 的抗 p53 抗体（p53/Mdm2 ELISA 试剂盒；参见材料表）分装样品解冻，与点样缓冲液按 1:1 混合，终浓度为 0.5 mg/mL。使用微量移液器将 5–10 µL 点样溶液加入 384 孔板中，并置于微阵列点样仪内。</li>
		<li>将步骤 1.1.1 中组装的芯片装入微阵列点样仪。编程设定点样仪在隔离器各孔中心坐标位置打印微阵列点。 
		注：微阵列点样仪通常使用多种专有软件，建议读者查阅相关文献。本方法所用 ADM 隔离器（见步骤 1.1.1 所附 CAD 文件）所需的微阵列包含矩形元素，相关尺寸参数已提供。</li>
		<li>将芯片存放在密封容器中，并用铝箔包裹。可在 4 °C 保存最长 6 周。 
		注：铝箔用于防止光损伤。4 °C 保存可减缓生物分子降解及可能降低微阵列活性的有害反应。密封容器可使芯片在使用前平衡至室温而不产生冷凝水。接触式微阵列点样依赖点样溶液与基底之间的表面张力和粘附力形成点样斑点。通常需进行预点样或吸除多余液体，以确保微阵列针上残留液量一致，从而获得大小均一的斑点。请勿丢弃用于预点样的牺牲性盖玻片，因其可用于评估批次质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于分配可寻址液滴的注射器、管路和同轴喷嘴
	<ol>
		<li>拆卸 100 µL（用于水相液滴）和 1 mL（用于封盖油相）玻璃哈密尔顿注射器，用蒸馏 H2O 清洗各部件。</li>
		<li>将一段 100 mm 长、内径/外径为 150 µm/360 µm 的熔融石英毛细管穿过一段 40 mm 长、内径/外径为 1.0 mm/1/16&#34; 的 PFA 管，使其前端突出 2 mm。此组件构成同轴喷嘴。</li>
		<li>在 10 µL 移液枪头末端涂一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，插入 40 mm 长、内径/外径为 1.0 mm/1/16&#34; 的 PFA 管中。如有需要，在胶水固化前调整熔融石英管位置，确保喷嘴端突出 2 mm。</li>
		<li>将熔融石英毛细管另一端插入一段 200 mm 长、内径/外径为 0.014&#34;/0.062&#34; 的 PTFE 管末端，并将该管连接至装有含 4% 牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）（PBSA）的 100 µL 哈密尔顿注射器。 
		注：蛋白质及其他生化物质可能非特异性结合于表面，导致损失或变性。BSA 可“封闭”表面，通过优先结合表面位点，减少非特异性吸附。</li>
		<li>将一段 400 mm 长、内径/外径为 1.0 mm/2.0 mm 的 FEP 管插入 200 µL 移液枪头直至形成密封。在另一个 200 µL 移液枪头末端涂一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，将其推入前一个枪头中以固定管路。将 1.0 mm/2.0 mm FEP 管的开口端连接至装有矿物油的 1 mL 哈密尔顿注射器。</li>
		<li>将 200 µL 移液枪头组件插入同轴喷嘴的 10 µL 移液枪头中。将两个注射器分别安装至独立的注射泵中，以便分别控制。</li>
		<li>用 4% PBSA 封闭液填充 100 µL 注射器。重新连接并用封闭液冲洗“水相”管路，重复两次，共冲洗三次。</li>
		<li>用含 0.125 µg mL-1 检测抗体（Alexa 488 标记的抗 p53 抗体 DO-1）的 4% PBSA 溶液填充 100 µL 注射器，并重新连接管路。通过推出 25 µL 检测抗体溶液，替换管路中的封闭液。</li>
		<li>用矿物油冲洗“油相”管路，直至整个管路和喷嘴均充满油。重新填充 1 mL 注射器中的矿物油并重新连接管路。将管路与喷嘴组件固定在 XYZ 操纵器上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备显微注射仪和显微操作器 
	注：以下步骤具体参考材料表中指定的显微注射仪和显微操作器组件，但其操作原则普遍适用于同类设备。
	<ol>
		<li>通过连接压力管路和毛细管夹持器组装显微注射仪。</li>
		<li>缓慢旋转活塞旋钮，直至矿物油完全充满管路。</li>
		<li>将毛细管夹持器安装至平移头支架上。</li>
		<li>使用夹头将毛细管固定在毛细管夹持器中。</li>
		<li>用移液器将 4% PBSA 溶液加入隔离器的一个孔中。</li>
		<li>使用显微操作器移动装置，将毛细管尖端浸入溶液中。</li>
		<li>缓慢将 4% PBSA 溶液充满毛细管，并静置封闭 10 分钟。</li>
		<li>弹出微毛细管，并旋转平移模块，使组件远离芯片表面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 形成可寻址液滴并加载单个细胞
<ol>
	<li>形成可寻址液滴
	<ol>
		<li>将芯片固定在显微镜载物台上。 
		注意：该显微镜为倒置荧光自动显微镜，配备单分子全内反射荧光（TIRF）成像系统、编码的XY载物台以及电子倍增电荷耦合器件相机（EM-CCD）。</li>
		<li>使用自动显微镜控制软件记录阵列中每个位点的显微镜载物台坐标。</li>
		<li>设置显微镜载物台上的XYZ操纵器。将喷嘴倾斜至50–60°角。确保喷嘴具有足够的长度和间隙以到达芯片表面。将“水相”和“油相”注射泵分别设置为以100 µL/min流速输送10 nL和以100 µL/min流速输送5 µL。 
		注意：在准备过程中，喷嘴前端的水相溶液可能会干燥。</li>
		<li>持续输送水相溶液，直至喷嘴前端出现可见液滴。用无尘擦拭纸轻轻蘸去液滴。 
		注意：根据所研究条件的数量，预留若干孔作为细胞储液池。对于单一细胞系/类型，一个储液池即可满足需求。</li>
		<li>使用自动显微镜控制软件，将显微镜载物台坐标定位至阵列中的一个抗体位点，并对盖玻片表面进行聚焦。</li>
		<li>小心不要扰动该位点，使用XYZ操纵器将同轴喷嘴的玻璃毛细管尖端对准抗体位点的一侧，注入10 nL水相溶液。不移动载物台的情况下，再注入5 µL油相以覆盖水相溶液。缓慢提起喷嘴使其脱离液滴，然后移至下一个孔。</li>
		<li>对阵列中所有抗体位点重复步骤2.1.6。</li>
		<li>30分钟后，使用自动显微镜控制软件对所有位点成像，以确定加样细胞前各抗体位点上结合的单分子背景信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向可寻址液滴中加载细胞
	<ol>
		<li>从培养箱中取出细胞培养瓶，使用胰蛋白酶/EDTA溶液使细胞脱离。 
		注意：本研究中使用的是BE人结肠癌细胞系，在含10%（v/v）胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，于CO2培养箱中培养。</li>
		<li>如需进行荧光染色，则对细胞进行标记。
		<ol>
			<li>将细胞重悬于含0.125 μg/mL检测抗体（用Alexa 488标记的抗p53抗体DO-1）的L-15培养基中，其中FBS终浓度为10%。为确保单细胞悬液，将细胞悬液通过孔径40 µm的细胞筛过滤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞悬液稀释或浓缩至浓度为25–400 × 103 个/mL。此浓度可确保细胞沉降时间距足够，便于微毛细管操作。</li>
		<li>使用显微操作仪和微毛细管，从细胞储液池中将单个细胞加载至可寻址液滴中。 
		注意：非贴壁细胞可批量吸入微量移液管，再逐个注入可寻址液滴。尽管已进行表面封闭处理，贴壁细胞系仍倾向于非特异性粘附于玻璃微毛细管内壁而造成损失。</li>
		<li>使用10×物镜观察，通过显微注射仪从细胞储液池中将单个细胞吸入微毛细管内。</li>
		<li>若使用电子操纵器载物台，则保存显微操作仪载物台坐标；否则手动记录Z轴位置。</li>
		<li>通过向上移动微移液管，使其脱离芯片1 mm的高度。可通过操纵杆手动完成，或使用电子操纵器载物台的“弹出”功能自动完成。</li>
		<li>使用自动显微镜控制软件将载物台坐标设定至目标可寻址液滴位置。通过将微移液管返回至已保存（或记录）的Z轴位置实现“注射”。此步骤可通过操纵杆手动完成，或在使用电子操纵器载物台时自动完成。 
		注意：微毛细管将穿透覆盖油层，进入可寻址液滴的水相部分。</li>
		<li>使用显微注射仪将细胞释放至可寻址液滴中。10 nL体积的可寻址液滴总体积增加不足1%。</li>
		<li>对剩余的可寻址液滴重复步骤2.2.5–2.2.9，保留部分液滴为空白对照（即不含细胞的可寻址液滴）。 
		注意：一种更简单的替代方法是，在步骤1.2.8中将溶液替换为含细胞的4% PBSA溶液，细胞浓度约为105 个/mL（相当于每10 nL含1个细胞），其中包含检测抗体。此时单细胞占据率符合泊松分布，需优化细胞浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>裂解细胞并成像阵列
	<ol>
		<li>使用明场显微镜对液滴中的细胞进行成像，包括任何荧光成像。 
		注意：使用自动显微镜对约100个液滴成像约需3分钟。使用数值孔径NA = 1.49的60倍油浸物镜进行成像。明场成像无需滤光片，荧光成像则使用标准滤光片组。</li>
		<li>使用单分子TIRF显微镜对阵列中所有位点进行成像。 
		注意：成像参数与步骤2.3.1相同，但使用专用TIRF滤光片组。这些图像将在第3节中进一步分析，用于确定裂解前各抗体位点上结合的单分子背景信号。使用全内反射荧光（TIRF）显微镜进行单分子成像，对约100个位点成像约需5分钟。</li>
		<li>聚焦于一个可寻址液滴中的细胞。通过将单次6 ns激光脉冲（波长1064 nm，脉冲能量14.1 ± 0.3 µJ）聚焦在细胞附近位置，实现完全光学裂解。 
		注意：激光脉冲引发膨胀的空化气泡，剪切细胞并将其内容物释放至液滴体积中。4,31 在低脉冲能量下，激光诱导裂解产生的机械效应不会扰动油-水界面。光学裂解通常需要约20–30分钟以裂解100个细胞。如讨论部分所述，若无法实现光学裂解，存在多种替代方法可用于裂解单个细胞。</li>
		<li>对所有含细胞的可寻址液滴重复此操作，保留5个液滴作为空白对照（即含未裂解细胞的可寻址液滴）。</li>
		<li>记录每个细胞裂解的时间。 
		注意：这些时间将在步骤3.1.9中用于校正每个位点的个体结合曲线。通常只需记录第一个和最后一个细胞裂解的时间，并假设裂解事件之间的时间间隔足够一致，即可估算其余时间点。</li>
		<li>在裂解后的前30分钟内每10分钟使用TIRF显微镜获取所有位点的单分子图像，随后60分钟内每20分钟获取一次。若仅关注平衡状态下结合的蛋白量，可在芯片于室温孵育90分钟后对所有位点成像。 
		注意：达到平衡所需时间取决于液滴体积及检测中所用抗体的亲和力。TIRF显微镜使用波长为488 nm、后孔径处功率为1.5 mW的激光激发光源（使用光功率计测量）。通过将EM-CCD相机的采集参数设置为900 ms曝光时间、16位数字化、1 MHz读出速率及EM增益因子10，采集单分子图像。隔离器可通过小心移除盖玻片后重复使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>单分子计数（非拥挤/数字区间）
	<ol>
		<li>使用 Fiji（或 Matlab），针对任何未拥挤的抗体斑点，加载裂解前获取的图像（背景，BKD）。 
		注意：以下步骤的操作可直接使用 Fiji 图像分析软件完成。用户指南可通过以下链接获取：https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html。</li>
		<li>在 Fiji 中，选择 BKD 图像。在 &#34;图像&#34; 菜单选择 &#34;重复&#34; 复制 BKD。选择复制的图像，然后在 &#34;过程 &#62; 滤光片&#34;，选择 &#34;高斯模糊&#34; 并指定50像素的半径。</li>
		<li>通过将 BKD 图像除以模糊后的 BKD 图像，使激发光源的有效强度分布趋于均匀，从而得到平坦化的 BKD_FLAT 图像。
		<ol>
			<li>下方 &#34;过程&#34; 选择 &#34;图像计算器…，指定操作 &#34;分割&#34;，所需图像，以及选择相应的框 &#34;创建新窗口&#34; 和 &#34;32 位（浮点）结果&#34;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将图像中的每个像素值减去 1（&#34;过程 &#62; 数学&#34;，选择 &#34;减去……”并设定数值为1）。平均像素强度应为0。 
		注意：由于所有像素值的总和应为0，因此可轻松检查视野平整性和平坦背景图像，任何残余的偏移也更容易进行补偿。</li>
		<li>在 BKD_FLAT 图像的任意一个角落选择一个 50 像素 × 50 像素的区域。通过选择测量像素强度的标准差（σ） &#34;分析&#34; 和 &#34;测量&#34;. 
		注意：所选内容的汇总统计结果将在“结果”窗口中显示。这决定了 非目标位点 背景区域应选择单分子密度较低的部位。待测区域可通过默认菜单中的选择工具手动选取，或通过运行宏代码进行选择。 &#34;makeRectangle(x, y, width, height)&#34;；这将创建一个矩形选区，其中 x 和 y 参数为选区左上角的坐标（以像素为单位）。</li>
		<li>将图像阈值设为3σ，并生成二值图像SM_MASK。
		<ol>
			<li>在下方 &#34;图像 &#62; 调节&#34;，选择 &#34;阈值……并将下限阈值设为 3σ。 
			注意：像素值低于阈值的将被设为零，高于阈值的像素则被设为1。该阈值将决定被阈值化后的像素归属于单个分子的置信度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在分割图像 SM_MASK 中，将所有尺寸不为 4-9 像素的对象的像素强度值设为零2 且通过选择0.5 - 1的圆形度 &#34;分析&#34; 随后 &#34;分析颗粒&#34; 并指定大小和圆度。 
		注意：像素大小可能需要根据其他荧光染料和显微镜设置进行优化。由于相机噪声的类型，单个像素的强度可能高于此阈值，尽管并非单分子，但仍可能被保留。像素大小标准可正确排除此类像素。单分子通常呈圆形。圆形度值为1表示完美的圆形，而接近0的值表示形状逐渐拉长。剩余的物体即为单分子，可进行计数。可设置掩膜以划定光斑区域，从而实现区分 现场 和 非目标位点 每帧计数。对于后期获取的帧，由于斑点上的信号已足够强，因此更容易进行计数，随后可将该方法应用于早期帧。</li>
		<li>对于同一无拥挤的抗体点，加载并重复步骤 3.1.1 - 3.1.7，处理裂解后采集的时间分辨序列中所有图像帧。使用步骤 2.3.5 中记录的裂解时间校正任何结合曲线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单分子计数（拥挤/模拟模式）
	<ol>
		<li>为了计算单个分子的平均强度，在继续操作之前，需重复步骤 3.1.1 - 3.1.8。</li>
		<li>将图像 BKD_FLAT 与 SM_MASK 相乘，生成一幅非零像素值对应于单分子的图像。
		<ol>
			<li>为此，需在以下条件下进行 &#34;过程&#34; 菜单，选择 &#34;图像计算器…，指定操作 &#34;倍增&#34; 以及所需的图像，并选中相应的框 &#34;创建新窗口&#34; 和 &#34;32 位（浮点）结果&#34;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选择并求和所有像素强度值 &#34;分析&#34; 然后 &#34;测量&#34;；选择结果的汇总统计数据将在结果窗口中显示。根据步骤 3.1.8 统计的单分子数量进行除法运算，以计算单个分子的平均荧光强度。</li>
		<li>对于任何拥挤的抗体斑点，加载裂解后获得的图像，并按照步骤 3.1.2 和 3.1.3 的方法与背景模糊图像进行平场校正。</li>
		<li>将平坦化图像中的每个像素值减去 1（&#34;过程 &#62; 数学&#34;，选择 &#34;减去……”并指定一个值为1）</li>
		<li>在图像的任意一个角落选择一个 50 像素 × 50 像素的区域，测量像素强度的标准差（σ）。详见步骤 3.1.5。</li>
		<li>通过将图像阈值设为3σ来创建二值图像掩膜，并将尺寸小于4像素的任何对象的像素强度值设为零2. 为此，需在以下条件下进行 &#34;分析&#34; 菜单，选择 &#34;分析颗粒&#34; 并指定大小和圆形度。</li>
		<li>将扁平化的抗体斑点图像与二值图像掩膜相乘。
		<ol>
			<li>要执行此操作，在以下条件下 &#34;过程&#34; 菜单，选择 &#34;图像计算器…”，指定操作 &#34;倍增&#34; 以及所需图像，并选中相应复选框 &#34;创建新窗口&#34; 和 &#34;32 位（浮点）结果。&#34;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过选择剩余像素强度的总和 &#34;分析&#34; 随后 &#34;测量&#34;选择的汇总统计结果将在结果窗口中显示。</li>
		<li>将像素强度总和除以单分子平均强度，以计算结合到拥挤位点的单分子数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绝对定量的标准曲线
	<ol>
		<li>重复步骤1和2，使用含已知浓度重组蛋白的4% PBSA溶液中的检测抗体，制备10 nL可寻址液滴。</li>
		<li>进行10个浓度梯度的系列实验2- 107 通过调整添加到溶液中的已知浓度重组蛋白，实现每液滴中重组蛋白的数量可控。建议以每液滴蛋白分子数为单位进行操作，以便于单细胞数据的校准。</li>
		<li>使用步骤3.3.2中的浓度梯度数据，将每个位点的单分子计数校准为每个液滴中的蛋白质丰度，并进一步校准为单个细胞中的蛋白质丰度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Lai, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+use+of+laser-based+lysis+for+cell+analysis+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip.</a> J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+advantages+and+constraints+in+miniaturized+capture+assays+for+single+cell+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis.</a> Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).</li>
<li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+techniques+for+single-cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Current techniques for single-cell lysis.</a> J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).</li>
<li>Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+effects+on+enzyme+activity+and+solubilization+of+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes.</a> BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).</li>
<li>Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/microfluidic-single-mammalian-cell-lysis-in-picolitre-droplets-2155-6210.S12-001.php?aid=14625">Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets.</a> J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).</li>
<li>Burgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+protein+copy+number+using+a+single-molecule-sensitive+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray.</a> Analyst. 139 (13), 3235(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

可寻址液滴微阵列是一种灵敏且可扩展的方法，可用于定量测定单个细胞内蛋白质的绝对拷贝数。
在本实验方案中，降低非特异性结合（NSB）水平对于实现尽可能低的检测限至关重要。蛋白质及其他生化物质可能会非特异性地结合到液滴中存在的多种界面——盖玻片表面、抗体点以及油/水界面。蛋白质可能因分配进入界面或油相本身而发生损失。我们已证实，在水相液滴中添加4% BSA可有效抑制使用本方案所指定抗体时的蛋白质非特异性结合。对于其他蛋白质靶标及其相应的检测抗体，可能需要采用不同的封闭策略，例如使用非离子型去污剂或相容性表面活性剂。也可尝试使用氟化油作为封顶油，并评估其适用性。在此类情况下，还需额外考虑封顶油的临界胶束&#160;浓度及其密度等因素。
未清洗的打印缓冲液在点样后仍保留在每个点位，有助于对齐。初次沉积液滴时，需注意避免同心管喷嘴的尖端划伤或损坏抗体点。在进一步开发该方法时，可将荧光染料掺入抗体打印缓冲液中，使其与捕获抗体一同固定。这样即可在液滴点样前完成洗涤和封闭步骤；然而，若采用喷墨打印等自动化&#160;液滴点样方法，则此步骤并非...

本方法的目的是在单细胞分辨率下测定细胞群体中目标蛋白丰度的变化。单细胞分析提供了许多传统群体生化方法所不具备的优势。1,2,3,4,5 首先，在单细胞水平上进行研究能够揭示细胞群体丰富的异质性，而这种异质性在传统群体生化技术中会因平均化效应而丢失。大多数常用的生化方法依赖于大量细胞样本，通常需要数百万个细胞才能获得结果。显然，对整个细胞群体进行评估的结果取决于多种因素，例如蛋白表达的异质性，可能导致蛋白丰度分布中某些重要特征被遗漏。从实际角度来看，单细胞技术所需的高灵敏度使其能够处理极微量的生物样本，而这些样本量甚至不足以支持最灵敏的群体检测技术运行。一个典型实例是对稀有细胞类型（如循环肿瘤细胞，CTCs）的研究：即使对于预后较差的患者，单次7.5 mL血液样本中可能存在的CTCs也不足10个。6 本文介绍了利用基于抗体微阵列上打印的油封液滴所构建的低体积抗体检测方法，实现单细胞蛋白定量的技术流程。
微流控液滴平台具有高通量特性，每秒可生成数千个液滴，能够分离甚至在单个液滴中培养单个细胞，从而进行多种多样的生化分析。基于液滴的技术非常适合单细胞分析7,8,9，近年来的典型实例包括DropSeq10和inDrop11，这些技术得益于扩增方法的强大能力而得到显著推动。然而，由于蛋白质样品量有限且缺乏有效的扩增方法，单细胞蛋白质组学研究尤为具有挑战性。
液滴可通过多种方法进行分析，其中荧光显微镜技术已被广泛使用。单分子检测技术，如全内反射荧光（TIRF）显微镜，能够以无与伦比的信噪比对荧光分子进行可视化观察。12 由于隐逝场呈指数衰减，只有靠近表面（约100 nm范围内）的荧光分子才会被激发，这使得TIRF成为在复杂混合物中检测微量目标分子的有效策略。TIRF固有的光学切片能力还有助于避免洗涤步骤，从而缩短检测时间和降低实验复杂性。然而，TIRF需要平面表面，目前将TIRF显微镜应用于流动中液滴的研究实例通常涉及构建可用于成像的平面界面。13 为此，单细胞蛋白质组学技术常采用微阵列格式，在微流控芯片中设计基于表面固定的捕获试剂。4,14
液滴本身可以在平面基底上形成阵列，即所谓的液滴微阵列。15,16,17 将液滴在空间上组织成阵列，可方便地进行索引、随时间轻松监测、单独寻址，必要时还可逐个回收。液滴微阵列可在单个芯片上实现高密度的微反应器，每个芯片包含数千个独立存在或由微孔结构支撑的单元。18,19,20 这些阵列可通过液体处理机器人、喷墨点样仪或接触式微阵列仪依次沉积形成21,22,23,24,25,26，也可在特定表面上自组装形成，例如在超疏水表面上的超亲水微区图案上自发排列。27,28,29
基于上述考虑，可寻址液滴微阵列（Addressable Droplet Microarrays, ADMs）被设计用于结合液滴微阵列的多功能性、空间可寻址性和小体积优势，以及单分子全内反射荧光（TIRF）显微镜的高灵敏度，从而实现对蛋白质丰度的定量检测。5 ADMs 可实现单细胞分析：在抗体微阵列上形成包含单个细胞的液滴微阵列，随后覆盖油相以防止蒸发。液滴体积具有离散性，可避免样品损失，而这种隔离效果在连续流微流控芯片中通常需依赖片上阀门实现。30 单个细胞中目标蛋白的绝对含量极低；然而，由于液滴体积小，目标蛋白可在局部达到相对较高的浓度，从而可通过夹心抗体检测法进行检测——即在表面特定区域或位点固定捕获抗体，该抗体结合目标蛋白，后者再与液滴中含有的荧光标记检测抗体结合。作为一种无需标记目标蛋白的无标记方法，ADMs 可广泛应用于来源于原代组织的细胞分析，如处理后的血液、细针穿刺抽吸物和解离的肿瘤活检样本，同时也适用于培养细胞及其裂解液的分析。
测量细胞群体中蛋白质丰度的变化对于确定细胞对药物等刺激的异质性反应至关重要，有助于深入理解细胞功能与信号通路、评估亚群及其行为，并识别那些会被整体检测方法所掩盖的稀有事件。本实验方案描述了如何制备和使用可寻址的液滴微阵列，以定量测定人癌细胞中转录因子p53的丰度，并可用于研究p53在化疗药物作用下的功能。目标蛋白由所选用的捕获抗体和检测抗体决定，因此该方法可调整用于检测更多或不同的目标蛋白。文中提供了详细的指导，使用常规实验室耗材构建包含同轴喷嘴的简易装置，手动制备以油封顶的10 nL液滴阵列。完整的实验流程包括：将单个细胞加载至每个液滴中，裂解细胞，并利用全内反射荧光显微镜（TIRF）以单分子分辨率检测蛋白质表达水平。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td>康宁</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;微阵列&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微接触点阵仪</td><td>DigiLab，英国</td><td>OmniGrid 微阵列点样仪</td><td></td></tr><tr><td>微接触针</td><td>ArrayIt，美国</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（Nexterion）</td><td>肖特，欧洲</td><td>1098523</td><td>尺寸（mm）：65.0 × 25.0；厚度（mm）：0.17</td></tr><tr><td>p53 捕获抗体</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>p53 检测抗体，Alexa Fluor 488 标记</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-126</td><td>储存浓度 200&amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>氯化钠-柠檬酸钠缓冲液</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>甜菜碱</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>384孔板（低体积）</td><td>Sigma</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>氮气钢瓶</td><td>BOC</td><td>工业级，无氧</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;液滴&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>手动显微注射仪</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>丹麦奥格里约</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;L型注射器</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>气密性PTFE鲁尔锁</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>气密性PTFE鲁尔锁</td></tr><tr><td>硅胶隔离器</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>带粘合剂的6x4孔硅胶隔离板</td></tr><tr><td>激光切割机</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 CO2激光器 3W</td><td>用于定制隔离器的激光切割</td></tr><tr><td>1毫米厚的丙烯酸板</td><td>Weatherall-英国</td><td>Clarex 精密片材 001</td><td>用于定制隔离器的激光切割</td></tr><tr><td>粘附片</td><td>3M</td><td></td><td>用于将定制隔离器粘附到微阵列盖玻片上</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Loctite</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 &amp;mu;m ID/360 &amp;mu;m OD 熔融石英管</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm 内径/1/16&amp;rdquo; OD PFA 管</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0.014&amp;rdquo; ID/0.062&amp;rdquo; OD 聚四氟乙烯管</td><td>运动性</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm 内径/2.0 mm 外径 FEP 管</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>德国默克密理博公司</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微镜技术 &amp;光学与光子学&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备编码XY载物台的全内反射荧光显微镜</td><td>日本尼康</td><td>尼康 Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>安道尔科技，爱尔兰</td><td>IXON DU-897E</td><td></td></tr><tr><td>激光激发光源</td><td>Vortran，美国</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>光学裂解激光源</td><td>美国 Continuum 公司</td><td>Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td>用于TIRF的显微镜滤光片组</td><td>Chroma，美国</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>用于光学裂解的显微镜滤光片组</td><td>Laser 2000，英国</td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>开源</td><td></td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>7.14 或更高版本</td><td>图像分析软件</td></tr></tbody></table>

使用可寻址液滴微阵列对单细胞中的蛋白质进行计数

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

通常，细胞行为和细胞反应是在群体水平上进行分析的，即多个细胞的反应被汇总为一个平均结果，从而掩盖了复杂细胞群体中丰富的单细胞行为。近年来，单细胞蛋白质检测与定量技术取得了显著进展。本文介绍了一种基于可寻址液滴微阵列的实用且灵活的单细胞分析平台。本研究描述了如何以单细胞分辨率测量目标蛋白的绝对拷贝数。肿瘤抑制蛋白p53是人类癌症中最常发生突变的基因，超过50%的癌症病例表现出非正常的p53表达模式。该实验方案详细说明了创建10 nL液滴的步骤，在这些液滴中分离单个人类癌细胞，并以单分子分辨率测定p53蛋白的拷贝数，从而精确评估其表达的变异性。该方法可应用于包括原代材料在内的任何细胞类型，用于测定任何目标蛋白的绝对拷贝数。

在人结肠癌细胞系BE细胞中，以单细胞分辨率确定了p53的绝对基础蛋白拷贝数。我们展示了p53表达量可在多个数量级范围内变化，并显示在静息状态的BE细胞群体中，细胞大小与蛋白拷贝数之间存在微弱的正相关关系。
当水相液滴在抗体点样位置被分配并覆盖油相时，可形成可寻址液滴微阵列。在此，这些液滴支持一种高灵敏度的p53蛋白检测。使用接触式微阵列仪和点样针将捕获抗体点样于盖玻片上。抗p53捕获抗体来自商用ELISA检测试剂盒。打印条件使得捕获点直径约为100 µm，每个点的最大捕获容量为6.2 ± 0.5 × 105 个蛋白分子。32
使用与盖玻片键合的隔离器可形成更高密度的液滴，因为它能限制油向邻近抗体捕获位点的扩散。图1A</s...

本文介绍了可寻址液滴微阵列（ADMs），这是一种基于液滴阵列的方法，能够测定单个细胞中蛋白质的绝对丰度。我们展示了ADMs在表征人源癌细胞系中肿瘤抑制蛋白p53表达异质性方面的应用能力。

通常在群体水平上分析细胞行为和细胞反应，即将大量细胞的反应结果汇总并取平均值……

本实验的总体目标是以前所未有的单细胞分辨率确定目标蛋白的绝对拷贝数。单细胞技术将有助于更深入地理解蛋白质行为与其在中心法则中作用之间的关系，并推动对受控基因表达进行精确的定量分析。在单细胞水平上开展研究，能够捕捉到细胞群体中丰富的异质性信息，而这些信息在传统生化技术的平均化处理过程中通常会丢失。通常，初次接触该方法的研究人员会因单细胞检测的敏感性或每个细胞中蛋白质含量有限而遇到困难。我们最初想到该方法，是希望进行一种单细胞蛋白质检测，并能够方便地采集样本以进行后续分析。请首先按照文本方案中的描述制备芯片并打印抗体微阵列，以开始本实验流程。准备装置时，将一段长100毫米、内径150微米、外径360微米的熔融石英毛细管插入一段长40毫米、内径1毫米、外径1/16英寸的PFA管中，使其突出2毫米，形成同轴喷嘴。在10微升移液器吸头末端涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，并将其插入该40毫米长的PFA管中。必要时，在粘合剂固化前重新调整熔融石英管的位置，以确保喷嘴处有2毫米的突出部分。将熔融石英毛细管的另一端插入一段长度为200毫米、内径为014英寸、外径为062英寸的PTFE管末端。将该端连接至一支装有含4%牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液的100微升Hamilton注射器。接着，将一段长400毫米、内径1毫米、外径2毫米的FEP管插入200微升移液枪头中，直至形成密封。在另一个200微升移液枪头内涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，然后将其推入第一个枪头中，以固定FEP管。随后，将FEP管的开放端连接至一个装有矿物油的1毫升Hamilton注射器上。将200微升移液器吸头组件插入同轴喷嘴的10微升移液器吸头中。接着，用4% PBSA封闭液填充100微升注射器。重新连接并用封闭液冲洗水相管路。重复两次，共冲洗三次。然后用含0.125微克/升检测抗体的4% PBSA溶液填充100微升注射器，并重新连接管路。通过排出25微升检测抗体溶液，替换管路中的封闭液。用矿物油冲洗输油管，直至所有管道和喷嘴均充满油。然后，用矿物油重新填充1毫升注射器，并将管道重新连接。最后，将管道和喷嘴组件固定在XYZ操纵器上。为了形成可寻址液滴，将芯片固定在显微镜载物台上。使用自动显微镜控制软件记录阵列中每个位点的显微镜载物台坐标。接着，在显微镜载物台上设置XYZ操纵器。将注射器分别放入独立的注射泵中，因为它们需要独立操作。将喷嘴置于50至60度的角度。然后设置水相注射泵以100微升/分钟的速度推出10纳升，设置油相注射泵以100微升/分钟的速度分散5微升。将水溶液分配至喷嘴头部出现液滴为止。用无尘擦拭纸轻触液滴以将其去除。使用自动显微镜控制软件，将显微镜载物台坐标设定至芯片阵列中的一个抗体点，并对盖玻片表面进行聚焦。对准喷嘴时，注意不要扰动抗体点。需格外小心，并通过显微镜观察玻璃毛细管尖端的接近过程。在确保不扰动抗体点的前提下，使用XYZ操纵器将同轴喷嘴的玻璃毛细管尖端对准抗体点的一侧。对齐后，加入10纳升水溶液。保持载物台不动，加入5微升油以覆盖水溶液。缓慢抬起喷嘴使其脱离液滴，然后移至下一个孔。 对芯片上的所有抗体点重复此步骤。30分钟后，使用自动显微镜控制软件对芯片上所有点进行成像，以确定在加样细胞前结合到每个抗体点上的单分子背景信号。为了将细胞加载至可寻址液滴中，我们将细胞悬浮于含有10% FDS的L-15培养基中，并加入0.125微克/毫升的检测抗体溶液。使用40微米孔径的细胞过滤器过滤细胞悬液，以确保获得单细胞悬液。利用显微操作仪和微毛细管，将单个细胞从细胞储液槽加载至可寻址的液滴中。通过10倍物镜观察，使用显微注射仪将单个细胞从细胞储液槽吸入微毛细管中。使用操纵杆手动操作，或通过电子操纵器载物台的弹出功能自动进行加样。通过将微移液管向上移动，越过芯片1毫米的高度，从而弃用该微移液管。利用自动化显微镜控制软件，将载物台坐标设定至可寻址液滴的位置。将微移液管移回其预设的Z轴位置进行注射。此步骤可通过操纵杆手动完成，或在使用电子操纵器载物台时自动完成。激光诱导裂解所产生的机械效应可能在液滴边缘形成乳浊液，而较高的脉冲能量则可能完全破坏液滴结构。确保裂解脉冲能量保持在最低水平，并避免细胞沉积在液滴的边缘。使用显微注射器将细胞分配至可寻址的液滴中。利用明场显微镜对液滴中的细胞进行成像，必要时包括荧光成像。同时使用单分子全内反射荧光显微镜对芯片上的所有荧光点进行成像。将目标细胞定位在可寻址的液滴中。通过将单个6纳秒激光脉冲聚焦于细胞附近位置，实现完全的光学裂解。记录每个细胞裂解的时间。在前30分钟内，每10分钟使用全内反射荧光显微镜（TIRF）对所有位点采集单分子图像，随后在接下来的60分钟内每20分钟采集一次。如果仅关注平衡状态下结合的蛋白量，则在芯片于室温孵育90分钟后，对所有位点进行成像。对于任何未拥挤的抗体斑点进行单分子计数时，加载裂解前获取的背景图像。在 Fiji 中选择背景图像，然后在图像菜单下选择“复制”以复制该背景图像。然后选择复制的图像，在“Process”（处理）菜单的“Filters”（滤镜）选项卡中选择高斯模糊（Gaussian blur），并设置半径为50像素。接着进入“Process”（处理）菜单，选择“Image Calculator”（图像计算器），在其中指定运算方式为“Divide”（除法），选择所需的图像，并勾选“Create new window”（创建新窗口）和“32-bit result”（32位结果）选项。将图像中的每个像素减去一。然后在背景平场图像的四个角中任意选择一个 50 像素 × 50 像素的区域。通过选择“分析”和“测量”来测定像素强度的标准差。在图像调整中，选择阈值并将下限阈值水平设置为三个标准差。在分割图像 SM 掩膜中，将所有尺寸不在四到九个像素平方、圆形度不在 0.5 到 1 范围内的对象的像素强度值设为零。为此，请选择“分析”，然后选择“分析颗粒”，并指定尺寸和圆形度参数。对于相同的抗体点，加载并重复对裂解后获得的时间序列图像帧进行数据分析。在单分子图像的代表性结果中，背景图像中的信号显示了荧光标记的检测抗体与表面及抗体点之间非特异性结合的水平较低。放大插图中用红色箭头标示出明显的单个分子。还展示了一张在BE人结肠癌细胞中p53蛋白pull-down的典型图像。该图像序列显示了p53蛋白在抗体点上的累积。利用已知浓度的重组蛋白获得的校准曲线，将每个点上的单分子计数转换为分析体积中目标蛋白的数量，从而提示单细胞中的拷贝数。水平红色虚线表示非特异性结合的水平。BE 癌细胞中基础 p53 蛋白表达呈长尾伽马样分布，其中部分细胞的 p53 蛋白表达水平显著高于众数值。此处，p53 蛋白表达水平作为细胞体积的函数进行绘制，细胞体积由裂解前测得的细胞直径计算得出。结果表明，这些细胞中维持着最低浓度的 p53 蛋白。观看本视频后，您应能充分理解如何以单细胞分辨率检测目标蛋白的丰度。在处理生物细胞时，需牢记蛋白质可能发生降解。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四小时内完成，并可整合到分析患者原代样本的实验方案中。单细胞技术有助于深入了解细胞功能与行为，并能够识别出其他两种方法均可能遗漏的稀有事件。尽管该方法可用于研究p53及乳腺癌细胞系的生物学特性，也可拓展应用于其他疾病研究，且无需标记步骤，因而在分析来自患者样本的原代细胞时具有显著优势。完成该操作后，可采用其他方法（如量子点 PCR）回答更多问题，例如确定靶标 RNA 与蛋白质表达是否存在相关性。对生物数学家和计算科学家而言，测定蛋白质的绝对拷贝数将有助于支持其生物学模型，具有重要意义。

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使用可寻址液滴微阵列对单细胞中的蛋白质进行计数

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