Name: 通过小鼠肺切除术和假体植入测量内部肺表面积的标准方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 了解小鼠肺切除术后假体植入模型中测量内部肺表面积的标准化方法。该技术通过量化肺表面面积提高肺功能评估的可靠性与可重复性，为研究机械力诱导的肺再生机制提供重要工具。

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作者感谢北京生命科学研究所提供的协助。本工作受到北京市自然科学基金（编号：Z17110200040000）的资助。

本方案中使用的所有操作均按照北京生命科学研究所《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。8周龄雄性CD-1小鼠饲养于特定病原体-free（SPF）设施中，直至开始实验。手术在完全麻醉的小鼠上进行（即，无任何脚趾夹捏反应）。手术后，小鼠被安置在温暖、潮湿的环境中，并提供充足的食物和新鲜水。小鼠通过腹腔注射过量麻醉剂实施安乐死。
1. 小鼠 PNX 手术
<ol>
	<li>用戊巴比妥钠（120 mg/kg 体重）和丁丙诺啡（0.1 mg/kg 体重）通过腹腔注射（I.P.）对小鼠进行完全麻醉。当小鼠对脚趾夹捏不再产生反应时，开始手术。</li>
	<li>用脱毛剂处理小鼠左侧胸壁区域（约3 × 3 cm）以去除毛发2 区域）。</li>
	<li>将每只小鼠固定在插管平台上，使其腹侧朝向操作者（图1A).</li>
	<li>拉出小鼠舌头，并使用带有导管引导槽的小动物喉镜照亮声带18 (图1A).</li>
	<li>通过观察呼吸时声带的运动来区分声带。以向前倾斜的角度将一根20 G静脉输液套管针轻柔插入气管19.</li>
	<li>将小鼠置于右侧卧位，并将套管连接至机械呼吸机（例如， 压力控制；参见 材料表）。通过观察小鼠胸部的呼吸运动来检查套管是否已正确插入气管（图1B).</li>
	<li>将呼吸机的吸气压设置为 12 cm H₂O2O，并将呼吸频率设置为每分钟120次（图1B).</li>
	<li>用聚维酮碘和70%乙醇对手术区域的皮肤进行去污处理。</li>
	<li>在第5肋间做一2至3厘米的后外侧开胸切口th 肋间隙，使用Noyes弹簧剪（切割刃：14 mm；尖端直径：0.275 mm）切开皮肤和肌肉图2B，C）。用于开胸手术的外科器械在使用前需进行灭菌处理。</li>
	<li>在5处做1.5 cm切口th 肋间隙以暴露左肺（图2D，E手术过程中，使用高温电灼器止血。</li>
	<li>用钝头镊子从胸腔中提起左肺叶的三分之一图 2F），然后用棉签将整个左肺拉出（图 2G).</li>
	<li>识别左肺叶的肺动脉和支气管（图 2G).</li>
	<li>用丝线外科缝合线在肺门处紧密结扎支气管和血管，并在结扎线远端3–4 mm处切除左肺叶图2H，我). 
	注意：切勿剪断左侧肺门处的缝合结，否则可能导致气胸（即，胸腔内的空气或气体（气胸）.</li>
	<li>用1针缝合胸壁，随后依次用5-6针间断缝合肌肉层和皮肤层，每针之间留出3-4 mm间隙。图 2M, 2N). 
	注意：手术缝合针应远离心脏；意外刺穿心脏将导致立即死亡。</li>
	<li>用聚维酮碘对手术区域进行消毒。</li>
	<li>手术后，将小鼠置于38 °C的加热垫上，并连接呼吸机，直至小鼠开始出现自主呼吸运动（图 2O).</li>
</ol>
2. 假体植入
<ol>
	<li>执行PNX手术步骤1.1至1.13（即操作进行至小鼠左肺叶被切除为止）。</li>
	<li>使用钝头镊子夹住硅胶假体（定制，长12 mm，厚3 mm，宽7 mm，重0.2 g，椭球形）的中心部位（图2J）。在插入前对硅胶假体进行灭菌处理。</li>
	<li>用一只手以镊子夹住肋骨以暴露胸腔，另一只手将假体插入左侧空置的胸腔。 
	注意：假体的额状面与胸壁表面之间的插入角度约为45度（图2K，L）。插入假体时操作务必轻柔，用力过大会导致胸膜破裂。</li>
	<li>使用钝头镊子调整假体的方向，确保其完全占据左侧空置的胸腔。</li>
	<li>执行小鼠PNX手术步骤1.14至1.16。</li>
</ol>
3. ILV 的测定
<ol>
	<li>准备一个自制装置（&#34;充气管&#34;），该装置由一支移除活塞的一次性移液管（10 mL）、一段40 cm长的软管（带针头适配器）、一个流速控制阀和一支18 G针头组成。组装完成后，用胶带将移液管固定在木板上（图3A）。移液管顶端与实验台之间的距离必须至少为30 cm。</li>
	<li>通过将20 g多聚甲醛（PFA）溶解于500 mL预热的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，在55 °C水浴中配制新鲜的4%多聚甲醛固定液，每10 min手动摇动一次，直至溶液澄清。冷却至室温后，用0.45 µm滤膜过滤溶液。 
	注意：操作PFA时需佩戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
	<li>通过过量注射麻醉剂（0.8%苯巴比妥钠，1,000 U/mL肝素）处死小鼠。</li>
	<li>将每只小鼠固定在聚苯乙烯解剖板上，并用70%酒精喷洒体表。</li>
	<li>小心打开小鼠胸腔，用剪刀切除胸骨，充分暴露肺叶。</li>
	<li>用剪刀去除多余组织以暴露气管，并确保将气管与食管分离。</li>
	<li>剪断腹主动脉，并将一支25 G针头插入右心室；在插入前将针头连接至一支20 mL注射器。缓慢将1×PBS推入心脏以清除血细胞，直至肺组织变白。通常需要5–10 mL PBS以清除肺血管中的血液。</li>
	<li>用新鲜的4% PFA充满自制的充气管，并排除充气管中所有气泡。</li>
	<li>将充气管的18 G针头插入气管，并用血管夹夹闭气管，防止液体泄漏。</li>
	<li>在25 cm/H2O2,20的恒定跨肺压下用4% PFA充胀肺组织。在室温下孵育2 h，使肺充分扩张。此&#34;预固定&#34;步骤对维持肺组织形态至关重要。
	<ol>
		<li>通过监测充气管，记录初始4% PFA体积值和最终体积值。肺内体积等于初始4% PFA体积减去最终4% PFA体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结扎气管，并用剪刀轻柔地将肺组织从周围结缔组织中分离出来（保持肺组织完整）。操作需极其轻柔，避免损伤肺组织。</li>
	<li>将肺组织置于装有4% PFA的50 mL锥形管中，在4 °C、轻度振荡（50 rpm）条件下孵育12 h。随后进行组织处理与染色（见第4节）。</li>
</ol>
4. 组织包埋、切片与苏木精染色 &amp;#38; 伊红（H&amp;#38;E) 染色
<ol>
	<li>固定后，使用 Noyes 弹簧剪刀修剪心脏及肺部多余的结缔组织。通过剪断连接肺叶与气管的支气管，轻柔地分离各个肺叶。</li>
	<li>在旋转摇床（50 rpm）上用 50 mL 1× PBS 对肺叶进行充分洗涤，共洗涤 3–4 次，每次 30 分钟。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将肺叶浸入含 30% 蔗糖的 1× PBS 溶液中，在 4 °C 下进行冷冻保护处理，直至组织沉入 50 mL 锥形管底部（约 12 小时）。</li>
	<li>在包埋和冷冻切片前，用镊子将肺叶样本从管中取出，保留副叶用于组织学分析，用吸水纸轻轻吸去副叶样本表面残留的蔗糖溶液，然后将样本完全浸入含有最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂的培养皿中，约 30 分钟。</li>
	<li>使用冷冻模具，在液氮中速冻 O.C.T. 包埋的副叶样本。将肺叶的最大表面平行于模具底部放置。</li>
	<li>进行冷冻切片时，每个样本共制备三张 10 µm 厚的切片用于组织学分析。弃去前 1 mm 组织，收集第一张 10 µm 切片，再弃去 0.5 mm 组织，收集第二张切片，再次弃去 0.5 mm 组织，最后收集第三张（终末）切片。</li>
	<li>在进行 H&amp;#38;E 染色前，将切片在空气中干燥 1 小时。</li>
	<li>进行 H&amp;#38;E 染色
	<ol>
		<li>用 3–4 次蒸馏水更换洗涤切片，然后将切片浸入新鲜苏木精染液中染色 2 分钟；在流动的自来水下冲洗切片；将切片浸入 1% HCl-70% 乙醇溶液中两次，以去除多余的苏木精。</li>
		<li>将切片浸入新鲜伊红染液中染色 3 分钟；依次用 95% 乙醇洗涤两次，每次 30 秒，再用 100% 乙醇洗涤两次，每次 30 秒进行脱水；用二甲苯透明 30 秒，更换新鲜二甲苯重复透明一次；使用盖玻片和封片剂封片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. MLI 的定量分析
<ol>
	<li>使用明场显微镜获取苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色的副叶组织切片的数字图像（20倍放大）。</li>
	<li>为量化平均线性截距（MLI），从每例副叶组织的3张切片中合适的区域（避开动脉、静脉、主气道和肺泡管）随机选取共15个无重叠的视野（每个视野1,000 µm × 1,000 µm）。</li>
	<li>使用标尺工具在选定视野区域上叠加一个网格，该网格包含10条均匀分布的垂直线和10条均匀分布的水平线，每条线长度为1,000 µm，相邻线间距为100 µm（图4B）。</li>
	<li>将相邻两个肺泡上皮之间的线性长度定义为一个截距值。测量每条1,000 µm长度线上所有截距的数值。</li>
	<li>对每个网格，量化10条水平方向1,000 µm长度线和10条垂直方向1,000 µm长度线上所有截距的数值。 
	注意：MLI为从每例副叶组织制备的3张切片中总共15个网格所分析得到的截距长度的平均值。</li>
</ol>
6. ISA 的计算
<ol>
	<li>使用公式1（见引言部分）计算ISA。ILV的测量方法见第3节，MLI的定量方法见第5节。</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-Mediated+YAP+Activation+Controls+Mechanical-Tension-Induced+Pulmonary+Alveolar+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration.</a> Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).</li>
<li>Thurlbeck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+surface+area+and+other+measurements+in+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Internal surface area and other measurements in emphysema.</a> Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).</li>
<li>Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+air+space+size+characteristics+by+intercept+%28chord%29+measurement%3A+an+accurate+and+efficient+stereological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach.</a> J Appl Physiol. 108 (2), 412-421 (2010).</li>
<li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeibel%2C+ER+%22Morphometry+of+the+Human+Lung%22">Morphometry of the Human Lung</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).</li>
<li>Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+internal+surface+area+of+the+lung+in+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The internal surface area of the lung in emphysema.</a> J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).</li>
<li>Branchfield, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+neuroendocrine+cells+function+as+airway+sensors+to+control+lung+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response.</a> Science. 351 (6274), 707-710 (2016).</li>
<li>Ding, B. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-derived+angiocrine+signals+induce+and+sustain+regenerative+lung+alveolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization.</a> Cell. 147 (3), 539-553 (2011).</li>
<li>Dunnill, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+in+the+study+of+pulmonary+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods in the study of pulmonary pathology.</a> Thorax. 17 (4), 320-328 (1962).</li>
<li>Weibel, E. R., Gomez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+human+lung.+Use+of+quantitative+methods+establishes+fundamental+relations+between+size+and+number+of+lung+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures.</a> Science. 137 (3530), 577-585 (1962).</li>
<li>Thurlbeck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+internal+surface+area+of+nonemphysematous+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">The internal surface area of nonemphysematous lungs.</a> Am Rev Respir Dis. 95 (5), 765-773 (1967).</li>
<li>Butler, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+adult+lung+growth+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for adult lung growth in humans.</a> N Engl J Med. 367 (16), 244-247 (2012).</li>
<li>Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+lung+growth+occurs+in+adult+dogs+after+right+pneumonectomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy.</a> J Clin Invest. 94 (1), 405-412 (1994).</li>
<li>Thurlbeck, S. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumonectomy+in+Rats+at+Various+Ages%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Pneumonectomy in Rats at Various Ages.</a> Am Rev Respir Dis. 120 (5), 1125-1136 (1979).</li>
<li>Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Age+on+Postpneumonectomy+Growth+in+Rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits.</a> Pediatr Pulmonol. 5 (2), 92-95 (1988).</li>
<li>Langston, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+multiplication+in+the+contralateral+lung+after+unilateral+pneumonectomy+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit.</a> Am Rev Respir Dis. 115 (1), 7-13 (1977).</li>
<li>Cohn, R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ar.1090750206/abstract">Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung.</a> Anatomical Record. 75 (2), 195-205 (1939).</li>
<li>Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+mediastinal+shift+after+pneumonectomy+impairs+regenerative+alveolar+tissue+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281 (5), L1279-L1287 (2001).</li>
<li>Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple method of mouse lung intubation.</a> J Vis Exp. (73), e50318(2013).</li>
<li>Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pneumonectomy+model+of+compensatory+lung+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airspace+configuration+at+different+transpulmonary+pressures+in+normal+and+paraquat-induced+lung+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats.</a> Am J Respir Crit Care Med. 158 (4), 1230-1234 (1998).</li>
<li>Yilmaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+quantification+of+heterogeneous+lung+growth+following+extensive+lung+resection+by+high-resolution+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography.</a> J Appl Physiol. 107 (5), 1569-1578 (2009).</li>
<li>Voswinckel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+post-pneumonectomy+lung+growth+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice.</a> Eur Respir J. 24 (4), 524-532 (2004).</li>
<li>Ravikumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://jap.physiology.org/content/jap/97/4/1567.full.pdf">Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography.</a> J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).</li>
<li>Gibney, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+murine+post-pneumonectomy+lung+regeneration+by+18FDG+PET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging.</a> EJNMMI Res. 2 (1), (2012).</li>
<li>Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+lung+damage+in+an+elastase-induced+mouse+model+of+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biomed+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema.</a> Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们详细描述了小鼠左侧肺全肺切除（PNX）及假体植入后肺部参数的测量方法。目前，肺泡表面积指数（ISA）已被视为评估多种肺部疾病以及损伤诱导的肺泡再生过程中呼吸功能的关键指标。然而，尽管肺部研究领域普遍认可ISA作为有效评估指标的价值，但迄今为止，对于计算ISA所依赖的两个参数——肺内残余容积（ILV）和平均线性截距（MLI）——其测量方法的标准化问题却鲜有关注。显然，如同任何测量过程一样，获取无偏倚数据至关重要。本研究的核心目标是为小鼠肺部研究领域建立一套标准化的实验操作流程。
在制定本方案的过程中，我们尝试通过多种方式减少测量偏差的来源。我们发现，通过防止液体泄漏可以减少肺内液体体积（ILV）测量的变异，具体方法是确保插入气管的针头尺寸与之匹配（我们发现18号针头与小鼠气管尺寸较为接近）。我们还发现，在用PFA充气前必须彻底去除小鼠胸壁，以最大限度地减少胸壁对ILV测量结果的潜在影响。平均线性截距（MLI）值在很大程度上依赖于肺泡形态。因此，除了使用年龄和性别匹配的小鼠至关重要之外，在肺组织固定过程中正确维持肺泡形态也极为关键。本文采用了广泛使用的固定方法：使用...

肺的基本功能是血管与大气之间的氧气和二氧化碳交换。支气管肺发育不良（BPD）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）以及急性呼吸道感染等肺部疾病会导致ISA降低2研究肺部疾病的科研人员已开发出多种定量方法，用于评估肺部的形态学变化，包括平均线性截距（MLI）、肺泡内衬体积（ILV）、气体交换单位数量、肺泡表面积（ISA）以及肺组织顺应性。2,3. 韦贝尔的开创性研究 等4 和 Duguid 等5 共同确立了ISA可作为人体肺部气体交换能力的直接测量指标，并可作为判定肺气肿严重程度的标准。过去五年中发表的多项研究已采用肺部形态学参数（例如， ISA 和 MLI）来评估小鼠肺部在发育过程中形态和功能的变化6 以及在PNX损伤后恢复期间1,7ISA 的计算采用 公式 18,9:
<img alt="肺内表面面积方程，ISA=4x(ILV)/MLI，生理参数计算。" src="/files/ftp_upload/56114/56114eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程">
，其中 ILV 为肺内体积，MLI 为表示肺外周气道大小的中间参数10。
肺叶切除术（PNX）作为一种外科手术，通过切除一个或多个肺叶，已被广泛报道可在包括人类在内的多种物种中诱导肺泡再生。11，小鼠1，狗12，大鼠13和兔子14,15. 对小鼠肺组织在PNX术后14天的研究显示，既有肺泡的扩张以及新肺泡的形成均发生显著变化。 从头合成 肺泡的形成有助于剩余肺组织中肺泡间隔面积（ISA）、肺泡内衬体积（ILV）及肺泡数量的恢复1我们及其他研究者已证实，在肺切除术（PNX）后将海绵、石蜡或定制形状的假体等材料植入空置的胸腔内即，假体植入）会损害肺泡再生。目前已有充分证据表明，机械力是启动肺泡再生的最重要因素之一1,16,17此类研究凸显了将PNX处理和假体植入肺部的ISA值作为定量评估肺泡再生能力的有效标准。
观察者偏倚已知会显著影响肺部形态学参数的测量值（例如，MIL 和 ILV）。通过标准化方案可消除在测定 ILV 和 MLI 时的偏差，而 ILV 和 MLI 是计算 ISA 所依据的两个参数。本文提供了测量这些肺部参数的高详细度标准化操作流程。尤为重要的是，准确量化 ISA 的能力有望提高在损伤诱导的肺泡再生模型中肺功能研究的可靠性和可重复性，并将促进多种肺部疾病的机制研究。

<table><tbody><tr><td>低成本电凝设备套件</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>诺伊斯剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>标准纹显微镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo显微持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>血管夹</td><td>Fine Science Tools</td><td>18374-44</td><td></td></tr><tr><td>静脉留置针-20号</td><td>Jinhuan Medical Product Co., LTD.</td><td>29P0601</td><td></td></tr><tr><td>外科缝合线</td><td>Jinhuan Medical Product Co., LTD.</td><td>F602</td><td></td></tr><tr><td>小鼠插管平台</td><td>Penn-Century, Inc</td><td>Model MIP</td><td></td></tr><tr><td>小动物喉镜</td><td>Penn-Century, Inc</td><td>Model LS-2-M</td><td></td></tr><tr><td>TOPO小动物呼吸机</td><td>Kent Scientific</td><td>RSP1006-05L</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Stuart equipment</td><td>SBH130D</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠盐</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>苏木精溶液</td><td>Sigma</td><td>GHS132</td><td></td></tr><tr><td>醇溶伊红Y溶液</td><td>Sigma</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>10 mL移液管</td><td>Thermo Scientific</td><td>170356</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>一次性底模</td><td>Fisher HealthCare</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>18号针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td></td></tr><tr><td>70%乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP82011</td><td></td></tr><tr><td>一次性输液器</td><td>Weigao</td><td>SFDA 2012 3661704</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>3M Scotch</td><td>8915</td><td></td></tr><tr><td>棉垫</td><td>Vinda</td><td>Dr.P</td><td></td></tr><tr><td>硅胶假体</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>明场显微镜</td><td>Olympus</td><td>VS120</td><td></td></tr><tr><td>标尺工具</td><td>Adobe Photoshop</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过小鼠肺切除术与假体植入测量肺内表面积的标准化方法

A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation

肺的形态、生理及呼吸功能在生理性和病理性条件下均会发生变化。肺内表面面积（ISA）反映了肺的气体交换能力，是评估呼吸功能的关键指标。然而，观察者偏差可能显著影响肺形态学参数测量值的准确性。本文所述的实验方案可最大限度地减少在测量用于计算ISA的两个形态学参数——肺内体积（ILV）和平均线性截距（MLI）——过程中的变异。我们将ISA作为形态计量和功能参数，用于评估肺切除术（PNX）和假体植入小鼠模型中肺泡再生的效果，发现PNX处理后ISA的增加在胸腔内植入假体后受到显著抑制1。准确量化ISA的能力不仅有望提高肺损伤诱导肺泡再生模型中肺功能研究的可靠性和可重复性，还将促进多种肺部疾病机制的发现。

本实验设置了PNX处理组和假体植入（Prosthesis-implanted）组。这些分组方式与本研究团队先前已发表的研究中所采用的分组一致14。
小鼠单侧肺切除术（PNX）及假体植入手术步骤如图2所示。手术及定量分析均采用8周龄雄性CD-1小鼠。在PNX处理组和假体植入组中，均切除左侧肺叶（图2A-2I）。在假体植入组中，左侧肺叶切除后，将一个模拟左侧肺叶大小和形状的假体植入胸腔（图2J-2L）。
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肺内表面面积（ISA）是评估肺部疾病及损伤诱导的肺泡再生过程中肺形态学与生理学的重要指标。本文介绍了一种标准化方法，可最小化在肺切除术和假体植入小鼠模型中对ISA测量的偏差。

肺部形态、生理及呼吸功能在生理和病理条件下均会发生变化。肺内表面面积（ISA），……

本实验的主要目标是在小鼠肺切除术及假体植入后，精确测量小鼠肺部的内表面积。该方法有助于分析机械力诱导的成年小鼠肺再生过程中的肺部形态学与生理功能。该技术的主要优势在于能够精确量化肺内表面积，有望提高肺功能状态评估的可靠性和可重复性。将小鼠置于插管平台上，使其腹侧朝上以便进行手术。随后拉出舌头，使用适用于引导导管的小动物喉镜检查声带。然后以适当的角度轻柔地将20号静脉插管套管插入气管。接下来，将小鼠置于右侧卧位，并将套管连接至机械呼吸机。观察胸部以判断套管是否已插入气管。设定吸气压为12厘米水柱，呼吸频率为每分钟120次。现在，使用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭暴露的皮肤至少三次。然后在第五肋间做一道2至3厘米的后外侧开胸切口以开始手术。使用诺伊斯弹簧剪剪开肌肉组织。接下来，做一个1.5厘米的切口以暴露左肺。手术过程中根据需要使用高温电凝器止血。然后，用钝头镊子从胸腔中提起约三分之一的左肺叶，并用棉签将整个左肺拉出。现在，辨认左肺叶的肺动脉和支气管，并用浸湿的外科缝线在肺门处紧密结扎支气管和血管。接着，从结扎处远端3至4毫米处切除左肺叶，注意不要剪断缝线，以免导致气胸。然后，用一条缝线关闭胸壁。然后依次缝合肌肉层和皮肤层，使用5到6个间断缝合，缝合间距为3至4毫米。务必使手术缝合针远离心脏，心脏穿刺可导致死亡。最后，用聚维酮碘对术区进行消毒。然后将小鼠置于38摄氏度的加热垫上。持续使用呼吸机，直至自主呼吸恢复。执行先前描述的操作，但在取出肺脏后，立即准备植入假体。使用钝头镊子夹住椭球形硅胶假体的中心部位。接着，在用镊子夹住肋骨以暴露胸腔的同时，非常轻柔地将假体插入。以45度角从假体的额状面与胸壁表面之间进入。使用钝头镊子确保假体完全置于左侧空置的胸腔内。随后关闭胸腔，并按照前述方法监测小鼠。进行此操作时，组装一个定制的充气管，该管由一支10毫升移液管的推杆、一段40厘米长的软管（带针头适配器）、一个流量控制阀和一支18号针头组成。组装完成后，用胶带将移液管固定在侧板上。移液管顶部与实验台之间的距离必须至少为30厘米。通过麻醉注射处死小鼠后，将其固定在已消毒的板上，小心打开胸腔以切除胸骨并暴露肺叶。随后，暴露气管。接着，用新配制的4%PFA充满灌注管，并彻底清除管内所有气泡。然后，将针头插入气管。为防止泄漏，使用血管夹夹闭气管。接着，在25厘米水柱的恒定跨肺压力下，用固定液灌注肺部。在室温下孵育肺组织两小时，使其充分膨胀。膨胀后，记录固定液的体积变化。随后结扎气管，并小心完整地将肺组织从周围结缔组织中分离出来。使用剪刀并操作轻柔。接下来，将肺组织放入盛有4%PFA的50毫升锥形管中，在4°C条件下于摇床上轻柔振荡孵育12小时。随后按照文本方案中所述进行后续处理和染色。为定量测定 MLI，使用在 20 倍放大下以明场采集的肺组织切片中所用试剂的图像。从三个不同的肺组

a-standardized-method-for-measuring-internal-lung-surface-area-via

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

通过小鼠肺切除术和假体植入测量内部肺表面积的标准方法

内皮糖萼/内皮表面层最适合通过活体显微镜进行研究。在肺等运动器官中，活体显微镜技术上具有挑战性。我们展示了如何结合明场与荧光显微镜技术，在自由运动的组织中估算内皮表面层厚度 体内...

in vivo 条件下小鼠肺血管内皮表面层的测量

本实验方案旨在提供一种自动化方法，用于量化慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型中的慢性肺部病理变化。该方案包括将小鼠暴露于香烟烟雾（CS）中、测定肺功能、灌注膨胀肺组织，以及采用形态计量学方法测量小鼠肺气肿和小气道重塑情况。...

香烟烟雾暴露小鼠肺气肿及小气道重塑的自动化测量

小鼠肺切除术是研究代偿性肺生长的常用模型。该手术可与谱系示踪或转基因小鼠模型结合使用，以阐明其潜在机制。...

小鼠肺叶切除补偿性肺生长模型

本文介绍了一种简单且可靠的小鼠肺压力-容积曲线测量方案，表明该方法具有足够的灵敏度，可检测两种常见肺部疾病——肺纤维化和肺气肿中肺实质的表型变化。该指标为量化肺部在疾病进展过程中发生的结构改变提供了有效手段。...

小鼠肺部压力-容积曲线的测定

本文的目的是介绍一些简单的方法，这些方法将极大地方便对患有肺癌或其他病理状况的小鼠肺组织进行制备和分析。我们提供了三种实验方案，用于简便且可靠地进行肺部灌注、固定以及肺容积测量。...

小鼠肺癌研究中常用的灌注与固定方法

我们描述了一种通过预先对气道造成损伤以显著增强肺癌细胞在小鼠肺部原位移植效率的方法。该方法还可用于研究肺部微环境中的基质相互作用、肿瘤转移扩散、肺癌共病情况，以及更高效地建立患者来源的异种移植模型。...

用博来霉素对小鼠气道进行预处理可提高原位肺癌细胞移植效率

本文介绍了一种用于小鼠胸腔的永久性植入式光学窗口的外科手术植入方案，该窗口可实现肺部的高分辨率活体成像。由于该窗口具有长期稳定性，因此特别适用于研究肺部动态的细胞过程，尤其是肿瘤细胞播散后缓慢发展的转移进程等生物学事件。...

用于研究癌细胞肺转移的永久性窗口

本方案介绍了如何通过优化小鼠体位并经口插入基于摄像头的耳镜，实现对声门的清晰观察，以最小的组织损伤快速进行气管插管，并稳定地将液体输送至肺部。...

改进的小鼠肺部液体递送方法：使用民用耳镜进行插管

本文介绍了一种利用显微计算机断层扫描（micro-CT）通过气管内滴注在病灶侧建立单侧博来霉素诱导的肺纤维化模型，以定量分析通气区域的实验方案。...

利用微型CT进行单侧肺容积分析以加强临床前模型中肺纤维化的评估

肺癌新疗法研发面临的主要挑战之一在于，当局部疾病进展为转移性疾病时，如何对肿瘤微环境进行有效建模。本文介绍一种建立肺癌同系正位模型的简便方法，该方法能够实现 体内...

一种建立同基因型小鼠肺肿瘤原位模型的微创方法

了解小鼠肺切除术后假体植入模型中测量内部肺表面积的标准化方法。该技术通过量化肺表面面积提高肺功能评估的可靠性与可重复性，为研究机械力诱导的肺再生机制提供重要工具。

通过小鼠肺切除术与假体植入测量肺内表面积的标准化方法

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