Name: 应用重组蚊子核作为基因载体, 用于蚊幼虫基因功能分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 学习利用重组埃及伊蚊浓核病毒作为基因递送系统，在蚊幼虫中实现基因过表达或敲低，从而分析基因功能。该方法操作简便、转导效率高，为蚊虫生物学研究提供了有力工具。

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作者感谢中国国家重点研发计划（2016YFC1200500，授予陈晓光）、国家自然科学基金（81672054 和 81371846）、广东省自然科学基金研究团队项目（2014A030312016）以及广州市科技计划项目（201508020263）提供的经费支持。我们衷心感谢科罗拉多州立大学的 Jonathan Carlson 教授慷慨提供 pUCA 和 p7NS1-GFP 质粒，并对本文稿进行了认真审阅。

所有实验方案均经南方医科大学伦理委员会批准。
1. 设计人工内含子
注意：本研究中使用的人工内含子长度为 65 bp，序列为 5'-GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG-3'。
<ol>
	<li>在人工内含子的两端放置HpaI限制性酶切位点，以便通过HpaI酶切将内含子从质粒中释放出来（见图1A）。</li>
	<li>在内含子中引入两个XbaI限制性酶切位点，以便利用XbaI酶切插入小RNA表达序列。</li>
	<li>向DNA合成公司订购人工内含子全长DNA序列的化学合成。所合成的DNA用于克隆至标准pUC19质粒中。 
	注：人工内含子的关键组分包括多个保守的核苷酸元件，其中包括5'剪接供体位点（DS），序列为GUAAGAGU；保守的分支点序列（BPS），序列为UACUAAC；多嘧啶 tract（PPT），序列为UCUUC(U)10；以及3'剪接受体位点（AS），序列为GAUAUCCUGCAG（图1A）。在DS与BPS之间引入了两个XbaI限制性酶切位点，可用于插入小RNA表达序列。该人工内含子在哺乳动物细胞和蚊子细胞中有效剪接的能力此前已得到验证14。</li>
</ol>
2. 设计人工内含子小RNA表达盒
注意：为了过表达或敲低内源性miRNA，在DS和BPS之间插入了编码前体miRNA或miRNA海绵的序列。作为示例，本研究选取了源自Ae. albopictus的内源性前体miRNA aal-let-7，用于构建重组病毒载体以实现miRNA的过表达和敲低。抗let-7海绵的设计依据先前描述的方法15。为了在幼虫中敲低目标基因，我们使用在线软件16,17设计了特异的人工miRNA（amiRNA）或短发夹RNA（shRNA）序列；作为示例，本研究选择V-ATP酶亚基A mRNA（登录号：AY864912）作为目标基因。此后，该amiRNA将被称为amiVTP。pre-miRNA、海绵、amiRNA和shRNA的所有序列详情见补充表1。
<ol>
	<li>订购前体miRNA、miRNA海绵和shRNA全长cDNA序列的化学合成，包含 Xba来自DNA制造商的两端均带有I型限制性酶切位点的序列。</li>
	<li>收到订购的DNA后，将含有DNA片段的离心管在10,000-14,000 × g下离心1分钟，以确保所有干燥的DNA均沉降至管底。</li>
	<li>将干燥的DNA溶于无DNase的水中，调整终浓度为10 ng/µL。</li>
	<li>用限制性内切酶消化质粒骨架和DNA序列 Xba在37 °C下孵育1小时，然后根据制造商的说明书，用小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）对线性化质粒骨架的5'端进行去磷酸化处理。</li>
	<li>65 °C 下加热 60 分钟以失活 CIAP。</li>
	<li>运行1.0%琼脂糖凝胶，切下线性化载体片段，然后使用凝胶回收试剂盒按照生产商说明书从凝胶切片中提取DNA。</li>
	<li>使用T4 DNA连接酶（5 U/µL）在22 °C下将DNA片段连接至载体骨架中，反应1小时。</li>
	<li>将步骤2.7中连接反应的产物转化至感受态细胞中 大肠杆菌 (E. coli) 细胞，并涂布于含有氨苄青霉素（终浓度为 100 µg/mL）的LB（Lysogeny Broth）琼脂平板上。
	<ol>
		<li>通过热激法进行转化18， 并使用适当的 E. coli 菌株。例如，使用 E. coli 用于热激转化的DH5α菌株</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从步骤2.8中挑取单个菌落，接种于3 mL含氨苄青霉素（终浓度为100 µg/mL）的富集培养基中培养。</li>
	<li>使用质粒小提试剂盒，按照制造商说明书从细菌培养物中提取质粒DNA。将样品送至DNA测序公司进行测序。 
	注意：为了过表达或敲低内源性miRNA，将编码前体miRNA或miRNA海绵的序列插入到两者之间 XbaI 位点。由于病毒包装能力的限制，所有 miRNA 表达或海绵结构的长度必须小于 400 bp（病毒基因组长度的 10%）。19.</li>
</ol>
3. 将miRNA或shRNA表达盒克隆至质粒骨架以构建rAeaDV载体
注意：pUCA 是一种感染性克隆，包含携带 AaeDV 基因组（3,981 nt）的 pUCA 质粒19，由 Jonathan Carlson 教授惠赠，并已在先前研究中被详细描述11。p7NS1-DsRed 可在 p7 启动子驱动下表达非结构蛋白 1（NS1）与红色荧光蛋白（DsRed）的融合蛋白，其详细信息已在其他文献中报道14。此外，将一种人特异性的 miR-941-1 前体20 及其海绵序列——随机化的短发夹 RNA（scrambled shRNA，序列：CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG）——也亚克隆至 AaeDV 中作为阴性对照。
<ol>
	<li>按照方案步骤 2.4 至 2.7 所述，将 pre-miRNA、sponge、shRNA 或 amiVTP 表达盒连接至 pUCA 质粒骨架中 AaeDV NS1 编码区的 HpaI 位点。</li>
	<li>将 DNA 转化至 Stbl3 感受态 E. coli 细胞中，并按照步骤 2.8 至 2.10 所述筛选阳性克隆。</li>
	<li>随后，使用大提试剂盒并按照制造商说明，从细菌细胞中提取 rAaeDV 质粒。 
	注意：应使用 Stbl3 或 Stbl4 E. coli 细胞进行 rAaeDV DNA 转化，以尽量减少非预期的 ITR 重组。应使用大提试剂盒提取 rAaeDV 质粒，以获得大量 DNA（&#62;100 µg）。在产生病毒前，应始终通过 DNA 测序分析 rAaeDV 质粒的序列完整性21。</li>
</ol>
4. 使用 rAaeDV 质粒转染 C6/36 细胞
<ol>
	<li>在28 °C培养箱中，使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基培养C6/36细胞。</li>
	<li>第0天，将细胞接种于十个25 cm²培养瓶中2 转染前18-20小时，将90-95%汇合度的细胞按1:2比例传代至培养瓶中。 
	注意：培养1天后，细胞应达到90–95%融合度。</li>
	<li>第1天，用一系列rAaeDV质粒转染细胞22.
	<ol>
		<li>在微量离心管中，将10 µg DNA溶于600 µL RPMI-1640培养基中，轻轻混匀。同时，每项转染实验另准备600 µL RPMI-1640培养基和25 µL转染试剂。</li>
		<li>室温（RT）孵育5-10分钟。然后，将625 µL的1640-转染试剂混合物加入1640-质粒DNA混合物中。</li>
		<li>在室温下孵育该混合物20–30分钟。转染前，用2 mL RPMI-1640培养基将细胞洗涤两次。</li>
		<li>在RT孵育（步骤4.3.3）后，将1640-转染试剂-DNA质粒混合物加入25 cm²培养瓶中2 培养瓶，28 °C 培养 6 小时。</li>
		<li>转染后约6小时，弃去转染培养基，用5 mL RPMI-1640培养基洗涤细胞两次，然后加入含10% FBS的RPMI-1640培养基。 
		注意：rAaeDV 对感染表现出高感染率（95%） 白纹伊蚊 幼虫；然而，根据我们的经验，在近50%的感染幼虫中，感染局限于原发感染部位（例如，肛乳头和刚毛细胞）且无播散23因此，若需在多个组织中感染幼虫，应共感染一种表达荧光蛋白的缺陷型重组病毒，以实现感染位点的可视化。例如，为获得表达 DsRed 的缺陷型重组病毒，应按照上述方法将 p7NS1-DsRed 与辅助质粒共转染至 C6/36 细胞中（共转染的浓度比例应为 2:1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 从转染的C6/36细胞中收获重组AaeDV病毒颗粒
<ol>
	<li>转染后第5天收集细胞。用5 mL玻璃滴管反复吹打培养基，使细胞脱离并悬浮于培养皿中。将所有细胞悬液转移至无菌的15 mL离心管中。</li>
	<li>在-80 °C或干冰/乙醇浴中冷冻30分钟，然后在37 °C条件下解冻。涡旋振荡1分钟。重复冻融过程3次。</li>
	<li>在4 °C条件下，以4,800 × g离心20分钟。收集上清液，弃去沉淀。随后将上清液通过0.22 µm一次性注射式滤器过滤。分装后将最终纯化的病毒颗粒储存于-80 °C。
	 
	注意：避免反复冻融。</li>
</ol>
6. 定量分析rAaeDV
<ol>
	<li>制备DNA标准品。用HpaI酶切所有rAaeDV质粒，线性化后使用凝胶回收试剂盒纯化消化产物24。</li>
	<li>构建绝对定量标准曲线，并根据先前描述的方法测定病毒滴度25。</li>
</ol>
7. 蚊子转导
<ol>
	<li>洗涤 100 1st 龄期 白纹伊蚊 用去离子水清洗幼虫三次，然后将幼虫转移至含有95 mL去离子水的烧杯中。加入5 mL rAaeDV储备液（终浓度为1.00 × 10）10 copies/mL</li>
	<li>在28 °C条件下孵育24 h，用去离子水清洗幼虫三次，然后将幼虫转移回培养板并定期喂食。</li>
	<li>通过qPCR或Western blot检测幼虫中目标基因的表达水平（代表性结果如图所示） 图3 和 4). 
	注意：可采用荧光信号检测方法更精确地分离感染幼虫。例如，为检测感染表达DsRed的重组病毒幼虫中的荧光信号，可将幼虫置于凹面载玻片上，每8小时在倒置荧光显微镜下观察一次，持续至感染后2天。一旦检测到荧光幼虫，应将其转移至单独的塑料培养杯中，以便后续连续观察。该方法可用于鉴定多种组织被感染的幼虫。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

克服限制rAaeDV构建的两个关键障碍至关重要。第一个障碍是缺陷型重组病毒的产生。已有报道称，MDV可用作表达适当大小外源基因的载体，例如蝎源性昆虫特异性神经毒素20和GFP蛋白；然而，无论采用何种构建策略，一旦将外源基因插入或替换MDV的开放阅读框（ORFs），病毒颗粒便无法独立形成，除非共转染辅助质粒以提供缺失的必需病毒蛋白。这种缺陷型病毒无法进行继发性传播，该过程 体内 在基因组存在缺陷的蚊子中。我们的结果验证了一种内含子表达策略，该策略提供了一种新范式，可克服基因组缺陷型蚊媒病毒在递送外源基因方面的局限性，从而实现外源基因向蚊子体内的高效递送。
第二个限制是病毒衣壳大小对重组病毒基因组长度提出的严格要求。为了实现高效包装，基因组长度不能超过4,400个核苷酸（即野生型MDV基因组长度的110%）。可将一个不超过400个核苷酸的内含子型miRNA表达盒（包括miRNA表达盒和人工内含子）插入AaeDV基因组中。尽管重组病毒基因组长度仍处于适合包装的范围内，但该递送系统仍有改进空间。由于基因组长度受限，若无高效的内含子表达策略，难以实现外源基因的有效表达。</...

疟疾、登革热、寨卡热和黄热病等蚊媒传播疾病是重大的国际公共卫生问题，持续构成全球传染病负担的重要部分1,2常规杀虫剂已被用于应对病媒，是预防蚊媒疾病可持续综合蚊虫控制策略的重要组成部分。然而，由于对环境的负面影响以及蚊虫种群抗药性的演化，此类策略已被证明相对无效或不理想3,4因此，迫切需要寻找蚊虫控制的替代方法，而利用转基因技术培育不育雄性蚊虫以及释放抗病原体蚊虫已成为颇具前景的新控制策略。为了开发有效的新型控制方法，例如安全且高效的方法 体内 基因递送，需要对蚊子基因功能进行综合分析。
质粒DNA、双链RNA（dsRNA）或小干扰RNA（siRNA）的直接显微注射是最常用的方法 体内 蚊子基因递送方法。事实上，转基因蚊子品系的制备仍然依赖于胚胎显微注射技术5,6,7然而，显微注射存在若干局限性。首先，该技术操作难度较高，涉及复杂的操作流程。其次，注射过程会对胚胎、幼虫、蛹及成虫造成物理损伤，直接影响目标生物的存活率。第三，由于大多数蚊虫幼虫生活在水生环境中，并具有典型的扭动运动特征，因此很难在显微注射过程中将其固定。第四，1st-2nd 3龄幼虫的体型比4龄幼虫小10至20倍th 龄幼虫及更晚期的幼虫，且前者的表皮更为脆弱。这些特点使得操作1st-2nd 与老龄幼虫相比，低龄幼虫的存活率较低。综合这些因素，导致幼虫在注射后的存活率（约5%）明显低于成虫8基于病毒的递送系统已被开发用于克服相关的胞外和胞内屏障。这类系统具有易于操作、转导效率高、表达水平持久且稳定，以及能够产生持续效应等优势。 体内因此，利用逆转录病毒、慢病毒和腺病毒的基因递送系统已广泛应用于哺乳动物细胞系和模式物种中。辛德比斯病毒表达系统此前已被用于分析成年蚊子中的基因功能；然而，除生物安全方面的顾虑外，病毒侵染仍需通过注射方式进行。9尽管此前已有报道通过将幼虫浸泡在dsRNA溶液中实现口服递送，该方法作为一种可行的递送方式，但并不适用于小RNA功能分析。10因此，仍需为蚊子开发有效的病毒递送方法。
蚊子浓核病毒（MDVs）属于细小病毒科（Parvoviridae）中的浓核病毒亚科（Densovirinae），除一种外，其余均归属于短浓核病毒属（Brevidensovirus）11。MDV病毒粒子无包膜，包含一条单链DNA（ssDNA）基因组和一个二十面体的衣壳（直径为20 nm）。病毒基因组大小约为4 kb，在宿主细胞核内进行复制。MDVs在环境中相对稳定，宿主范围较窄，对蚊子具有高度特异性。这些病毒能够在蚊群中自然传播并长期存在，并可侵入这些昆虫的几乎所有器官和组织，包括中肠、马氏管、脂肪体、肌肉、神经元以及唾液腺12。
完整的MDV基因组可亚克隆至质粒载体中，以构建基于质粒的感染性克隆；当这些克隆被导入蚊细胞后，病毒基因组可从质粒载体中释放，并产生具有感染性的病毒颗粒。由于MDV具有较小的单链DNA（ssDNA）基因组，其感染性克隆易于构建，且病毒基因组易于操作11,13这些特性使蚊媒病毒（MDV）成为研究蚊虫生物学的有价值工具。然而，由于病毒基因组序列几乎全部对病毒增殖至关重要，通过替换或插入外源基因来构建重组病毒会导致病毒包装和/或复制能力的下降，从而阻碍了MDV作为基因递送载体的开发。本文报道了一种利用人工内含子小RNA表达策略，开发出无缺陷的重组AaeDV（rAaeDV）的方法。 体内 具有质粒构建简便以及可维持功能性病毒的优势，能够在宿主细胞中实现稳定且长期的表达，而无需野生型病毒。此外，该方法可轻松实现对幼虫的转导。
本研究描述了以下步骤的实验方案：1）设计编码内含子小RNA表达盒的重组埃及伊蚊病毒（rAaeDV），2）利用C6/36包装细胞系生产重组病毒颗粒，3）对无细胞体系中的rAaeDV基因组拷贝数进行定量分析，以及4）通过将病毒直接引入幼虫栖息水体来感染白纹伊蚊（Ae. albopictus）幼虫。总体而言，本工作表明，利用所开发的MDV递送系统，可在蚊虫幼虫中实现特定小RNA或靶基因的过表达或敲低。

<table><tbody><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>离心系统</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 凝胶回收试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. 质粒大提试剂盒</td><td>Omega Biotech</td><td>D6904</td><td></td></tr><tr><td>纯化琼脂</td><td>OXOID</td><td>LP0028A</td><td></td></tr><tr><td>FastAP 热敏感碱性磷酸酶 (1 U/&amp;micro;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest &lt;em&gt;HpaI&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD1034</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest &lt;em&gt;XbaI&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0684</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶 (5 U/&amp;micro;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TransStbl3 化学感受态细胞</td><td>北京全式金生物</td><td>CD521-01</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素&amp;nbsp;</td><td>北京天根生化科技</td><td>RT501</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Promega</td><td>MC5008</td><td></td></tr><tr><td>SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)</td><td>北京天根生化科技</td><td>FP205</td><td></td></tr></tbody></table>

利用重组蚊媒浓核病毒作为基因递送载体对蚊子幼虫基因进行功能分析

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

体内显微注射是分析单个蚊虫基因功能最常用的基因转移技术。然而，该方法操作技术要求较高，步骤复杂，尤其是在幼虫阶段应用时，由于其体型较小、体壁相对较薄且脆弱，以及高死亡率，限制了该技术的广泛应用。相比之下，病毒载体可用于克服基因递送过程中的胞外和胞内屏障。这类系统具有操作简便、基因转导效率高、基因表达可持续维持以及能够在体内产生持久效应等优势。蚊虫浓核病毒（MDVs）是一类特异性感染蚊虫的小型单链DNA病毒，可有效将外源核酸递送至蚊虫细胞中；然而，外源基因的替换或插入通常会导致病毒包装和/或复制能力的丧失，这成为将其开发为基因递送载体的主要障碍。
本文中，我们报告采用一种人工内含子小RNA表达策略，以开发一种非缺陷型重组病毒 埃及伊蚊 浓核病毒（AaeDV） 体内 递送系统。本文详细描述了重组埃及伊蚊痘病毒（rAaeDV）载体的构建、包装和定量分析，以及幼虫感染的具体操作步骤。
本研究首次证明了构建一种非缺陷型重组MDV微小RNA（miRNA）表达系统的可行性，从而为蚊媒基因功能分析提供了有力工具，并为利用病毒介导的转基因技术控制蚊媒传播疾病奠定了基础。我们证实了 白纹伊蚊 1st 通过将病毒引入幼虫饲养场所的水体中，可以高效且有效地感染各龄期幼虫；所构建的重组AaeDV可用于在幼虫中过表达或敲低特定靶基因的表达，从而为蚊虫基因的功能研究提供一种有效工具。

rAaeDV 构建策略  
构建了一种缺陷型 rAaeDV 载体，用于在蚊子幼虫中表达 DsRed 基因。所获得的质粒包含一个 NS1-DsRed 融合蛋白表达盒，其中缺失了 VP 蛋白序列（图 1A）。设计了包含 miRNA、miRNA 海绵（sponge）、shRNA 和 amiRNA 表达结构的 rAaeDV 质粒（如 图 1B 所示）。例如，构建了一种 rAaeDV 载体，用于在蚊子幼虫中过表达 aal-let-7。所获得的质粒在病毒 NS1 外显子中插入了一个内含子型 pre-aal-let-7 表达盒（图 1B）。构建了一种 rAaeDV 载体，其在病毒 NS1 外显子中包含一个内含子型 aal-let-7 海绵表达盒，用于在蚊子幼虫中敲低 a...

我们报告采用一种人工内含子小RNA表达策略来开发非缺陷型重组病毒 埃及伊蚊 浓核病毒（AaeDV） 体内 递送系统。本文详细描述了rAaeDV载体的构建、包装和定量分析以及幼虫感染的完整实验流程。

活体显微注射是分析单个蚊虫基因功能最常用的基因转移技术。然而，该方法……

本实验的总体目标是利用重组蚊媒细小病毒作为基因递送载体，分析蚊虫幼虫的基因功能。该方法有助于解答基于病毒的递送系统中的关键问题，例如如何克服相关的胞外和胞内屏障。该技术的主要优势在于操作简便、转导效率高、表达持久且稳定，并能够在体内产生持续效应。本研究证明，利用所开发的浓核病毒递送系统，可在蚊子幼虫中实现特定小RNA或靶基因的过表达或敲低。该技术的应用意义在于拓展了所述表达策略在蚊子生物学研究中的应用，因为该方法可轻松实现对幼虫的转导。实验操作将由本实验室的博士生候选人 Pei-Wen Liu 演示。首先，按照随附的文字方案订购前体miRNA、miRNA海绵以及shRNA的全长cDNA序列的化学合成。收到合成的DNA后，离心含有DNA片段的离心管，确保所有干燥的DNA均位于管底。随后，用无DNase的水重悬DNA，使其最终浓度达到每微升10纳克。加入6 µL XbaI以消化质粒骨架和cDNA序列，将反应体系置于37°C下孵育1小时。随后，根据制造商说明书，使用小牛肠碱性磷酸酶对线性化质粒骨架的5'端进行去磷酸化处理。为了实现高效包装，基因组大小不得超过4,400个核苷酸，该长度相当于野生型蚊子浓核病毒基因组长度的110%；或者，插入埃及伊蚊基因组的内含子中用于表达的微小RNA序列长度不得超过400个核苷酸。接下来，在 65 摄氏度下加热使碱性磷酸酶失活。然后将 DNA 在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，并切下线性化的载体骨架。使用凝胶回收试剂盒，按照制造商的说明从凝胶切片中提取 DNA。提取后，使用T4 DNA连接酶将DNA片段连接至载体骨架中。然后，通过热激法将连接反应产物转化至感受态DH5-alpha E.coli细胞中。将转化后的细菌涂布于含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂平板上。第二天，从平板上挑取单个菌落，使用含有100微克/毫升氨苄青霉素的3毫升富集培养基制备预培养物。最后，按照试剂盒生产商的说明，使用质粒小提试剂盒从细菌培养物中提取质粒DNA。将DNA样品送至DNA测序公司进行序列验证。使用人工内含子小RNA表达盒所示的方法，将pre-miRNA或shRNA连接至pUCA质粒骨架中AaeDV NS1编码区的HpaI位点。转化时，不用DH5-alpha细胞，而是将DNA转化至Stbl3感受态大肠杆菌细胞中。随后，将转化后的细胞涂布于含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂平板上，并从阳性克隆制备初始培养物。接着，按照制造商说明书，使用质粒大提试剂盒（maxiprep kit）从细菌细胞中提取rAaeDV质粒。在第0天，将汇合度为90%至95%的C6/36细胞培养瓶按1:2比例传代至10个T-25培养瓶中。将培养瓶在28摄氏度下孵育18至20小时，直至细胞再次达到90%至95%的汇合度。第一天，用构建好的 rAaeDV 质粒转染细胞。具体操作如下：将 10 微克 DNA 溶于 600 微升 RPMI-1640 培养基中，轻轻混匀。同时，每份转染需准备 600 微升 RPMI-1640 培养基和 25 微升转染试剂。将细胞与DNA在室温下孵育5至10分钟。然后，向质粒DNA混合物中加入625 µL RPMI-1640转染试剂混合物，并在室温下孵育20至30分钟。孵育结束后，用RPMI-1640培养基洗涤细胞两次，随后将转染混合物加入每个T-25培养瓶中。将细胞在转染混合物中于28摄氏度孵育六小时。六小时后，移除转染培养基，用五毫升RPMI-1640培养基洗涤细胞两次，然后加入含10%FBS的新鲜RPMI-1640培养基。转染五天后，使用五毫升玻璃移液管，通过反复吹打培养基使细胞从培养皿中脱落并悬浮。将每个烧瓶中的细胞悬液转移至各自的无菌50毫升离心管中。为了收获高阈值依赖性病毒，转染后需继续培养细胞五天。将各离心管在-80摄氏度冰箱中或干冰乙醇浴中冷冻30分钟。然后在37摄氏度下快速解冻，并将细胞悬液涡旋振荡一分钟。接着，收集离心样品的上清液，弃去沉淀物。随后，将上清液通过0.22微米的一次性注射器滤器过滤。将纯化后的病毒悬液分装，并于-80摄氏度保存。用去离子水清洗100条一龄A. albopictus幼虫，重复三次。然后将幼虫转移至含有95毫升去离子水的烧杯中。加入5毫升rAaeDV病毒原液，将幼虫在28摄氏度下孵育24小时。为了成功感染幼虫，必须使幼虫与感染性病毒颗粒接触24至36小时，以确保较高的感染率。孵育结束后，用去离子水洗涤幼虫三次，然后将幼虫转移回培养板中。定期喂养幼虫。采用定量PCR或蛋白质印迹法（Western blot），按照标准技术检测幼虫中目标基因的表达水平。在此示例中，用含有 aal-let-7 表达盒的重组病毒感染后，分析了 100 条一龄幼虫内源性 miRNA 的表达情况，结果显示该基因过表达。右侧展示了抗 let-7 构建体的效率，突显其敲低能力。为监测 rAaeDV 载体对 V-ATPase mRNA 的敲低效率，将总共 100 头一龄幼虫置于含有等量不同类型 rAaeDV 的幼虫栖息水体中进行处理。表达 miRNA 的 rAaeDV 和表达内含子 shRNA 的 rAaeDV 均显著降低了 V-ATPase mRNA 水平。我们的结果验证了一种内含子表达策略，该策略提供了一种新范式，可克服基因组存在缺陷的蚊媒浓核病毒的局限性，从而实现外源基因向蚊体内的高效递送。在实施该操作时，需注意将长度不超过400 nt的内含子微小RNA表达盒插入埃及伊蚊浓核病毒基因组中。该技术建立后，为研究非缺陷型重组蚊媒浓核病毒的制备开辟了道路，此类病毒可过表达或下调微小RNA及其靶基因，进而开展蚊类基因的功能分析研究。观看本视频后，您应能充分了解如何利用已开发的蚊媒浓核病毒递送系统来分析蚊子幼虫中的基因功能。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

应用重组蚊子核作为基因载体, 用于蚊幼虫基因功能分析

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频协议展示了James实验室采用的一种将dsRNA注射到携带登革热病毒的埃及伊蚊雌蚊中的方法。视频中演示了注射针头的校准、注射装置的操作，以及将dsRNA注入蚊子胸部的技术。...

将dsRNA注射入雌性埃及伊蚊成蚊

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频方案展示了Dimopoulos实验室用于将dsRNA注入冈比亚按蚊（Anopheles...

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构建抗疟疾与登革热的改良蚊子：鉴定冈比亚按蚊与埃及伊蚊中赋予抗性的基因

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通过锁核酸修饰的寡核苷酸在蚊子细胞中进行靶基因转染和诱变

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RNAi介导的基因敲低和 体内 成年雌性个体利尿实验 埃及伊蚊 蚊子

来源：Liu, P., et al。利用重组蚊媒浓核病毒作为基因递送载体对蚊子幼虫基因进行功能分析。J. Vis. Exp. (2017)。本视频演示了从感染的埃及伊蚊（Aedes...

收获重组蛋白 埃及伊蚊 感染细胞中的浓核病毒

在本视频中，我们通过胚胎显微注射技术，将基因驱动载体导入冈比亚按蚊（Anopheles...

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本文介绍了一种通过使用可被幼虫摄食的壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒来抑制疾病媒介蚊虫基因功能的方法。...

壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒介导的病媒蚊虫幼虫基因沉默

RNA干扰（RNAi）是揭示基因功能的极为重要的工具。然而，在主要的人类疟疾传播媒介冈比亚按蚊（Anopheles...

向Anopheles gambiae蛹体内递送RNAi触发物

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蚊虫与家蝇中可重复的dsRNA显微注射及产卵生物测定

双组分GAL4-UAS系统是一种多功能工具，可用于在可控的时空条件下调控基因表达，从而在Anopheles...

利用GAL4-UAS系统在Anopheles gambiae中进行功能遗传学研究

学习利用重组埃及伊蚊浓核病毒作为基因递送系统，在蚊幼虫中实现基因过表达或敲低，从而分析基因功能。该方法操作简便、转导效率高，为蚊虫生物学研究提供了有力工具。

利用重组蚊媒浓核病毒作为基因递送载体对蚊子幼虫基因进行功能分析

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