利用重组蚊媒浓核病毒作为基因递送载体对蚊子幼虫基因进行功能分析

本实验的总体目标是利用重组蚊媒细小病毒作为基因递送载体，分析蚊虫幼虫的基因功能。该方法有助于解答基于病毒的递送系统中的关键问题，例如如何克服相关的胞外和胞内屏障。该技术的主要优势在于操作简便、转导效率高、表达持久且稳定，并能够在体内产生持续效应。

本研究证明，利用所开发的浓核病毒递送系统，可在蚊子幼虫中实现特定小RNA或靶基因的过表达或敲低。该技术的应用意义在于拓展了所述表达策略在蚊子生物学研究中的应用，因为该方法可轻松实现对幼虫的转导。实验操作将由本实验室的博士生候选人 Pei-Wen Liu 演示。

首先，按照随附的文字方案订购前体miRNA、miRNA海绵以及shRNA的全长cDNA序列的化学合成。收到合成的DNA后，离心含有DNA片段的离心管，确保所有干燥的DNA均位于管底。随后，用无DNase的水重悬DNA，使其最终浓度达到每微升10纳克。

加入6 µL XbaI以消化质粒骨架和cDNA序列，将反应体系置于37°C下孵育1小时。随后，根据制造商说明书，使用小牛肠碱性磷酸酶对线性化质粒骨架的5'端进行去磷酸化处理。为了实现高效包装，基因组大小不得超过4,400个核苷酸，该长度相当于野生型蚊子浓核病毒基因组长度的110%；或者，插入埃及伊蚊基因组的内含子中用于表达的微小RNA序列长度不得超过400个核苷酸。

接下来，在 65 摄氏度下加热使碱性磷酸酶失活。然后将 DNA 在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，并切下线性化的载体骨架。使用凝胶回收试剂盒，按照制造商的说明从凝胶切片中提取 DNA。

提取后，使用T4 DNA连接酶将DNA片段连接至载体骨架中。然后，通过热激法将连接反应产物转化至感受态DH5-alpha E.coli细胞中。将转化后的细菌涂布于含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂平板上。

第二天，从平板上挑取单个菌落，使用含有100微克/毫升氨苄青霉素的3毫升富集培养基制备预培养物。最后，按照试剂盒生产商的说明，使用质粒小提试剂盒从细菌培养物中提取质粒DNA。将DNA样品送至DNA测序公司进行序列验证。

使用人工内含子小RNA表达盒所示的方法，将pre-miRNA或shRNA连接至pUCA质粒骨架中AaeDV NS1编码区的HpaI位点。转化时，不用DH5-alpha细胞，而是将DNA转化至Stbl3感受态大肠杆菌细胞中。随后，将转化后的细胞涂布于含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂平板上，并从阳性克隆制备初始培养物。接着，按照制造商说明书，使用质粒大提试剂盒（maxiprep kit）从细菌细胞中提取rAaeDV质粒。

在第0天，将汇合度为90%至95%的C6/36细胞培养瓶按1:2比例传代至10个T-25培养瓶中。将培养瓶在28摄氏度下孵育18至20小时，直至细胞再次达到90%至95%的汇合度。

第一天，用构建好的 rAaeDV 质粒转染细胞。具体操作如下：将 10 微克 DNA 溶于 600 微升 RPMI-1640 培养基中，轻轻混匀。同时，每份转染需准备 600 微升 RPMI-1640 培养基和 25 微升转染试剂。

将细胞与DNA在室温下孵育5至10分钟。然后，向质粒DNA混合物中加入625 µL RPMI-1640转染试剂混合物，并在室温下孵育20至30分钟。孵育结束后，用RPMI-1640培养基洗涤细胞两次，随后将转染混合物加入每个T-25培养瓶中。

将细胞在转染混合物中于28摄氏度孵育六小时。六小时后，移除转染培养基，用五毫升RPMI-1640培养基洗涤细胞两次，然后加入含10%FBS的新鲜RPMI-1640培养基。转染五天后，使用五毫升玻璃移液管，通过反复吹打培养基使细胞从培养皿中脱落并悬浮。

将每个烧瓶中的细胞悬液转移至各自的无菌50毫升离心管中。为了收获高阈值依赖性病毒，转染后需继续培养细胞五天。将各离心管在-80摄氏度冰箱中或干冰乙醇浴中冷冻30分钟。

然后在37摄氏度下快速解冻，并将细胞悬液涡旋振荡一分钟。接着，收集离心样品的上清液，弃去沉淀物。随后，将上清液通过0.22微米的一次性注射器滤器过滤。

将纯化后的病毒悬液分装，并于-80摄氏度保存。用去离子水清洗100条一龄A. albopictus幼虫，重复三次。然后将幼虫转移至含有95毫升去离子水的烧杯中。

加入5毫升rAaeDV病毒原液，将幼虫在28摄氏度下孵育24小时。为了成功感染幼虫，必须使幼虫与感染性病毒颗粒接触24至36小时，以确保较高的感染率。孵育结束后，用去离子水洗涤幼虫三次，然后将幼虫转移回培养板中。定期喂养幼虫。采用定量PCR或蛋白质印迹法（Western blot），按照标准技术检测幼虫中目标基因的表达水平。

在此示例中，用含有 aal-let-7 表达盒的重组病毒感染后，分析了 100 条一龄幼虫内源性 miRNA 的表达情况，结果显示该基因过表达。

右侧展示了抗 let-7 构建体的效率，突显其敲低能力。为监测 rAaeDV 载体对 V-ATPase mRNA 的敲低效率，将总共 100 头一龄幼虫置于含有等量不同类型 rAaeDV 的幼虫栖息水体中进行处理。表达 miRNA 的 rAaeDV 和表达内含子 shRNA 的 rAaeDV 均显著降低了 V-ATPase mRNA 水平。

我们的结果验证了一种内含子表达策略，该策略提供了一种新范式，可克服基因组存在缺陷的蚊媒浓核病毒的局限性，从而实现外源基因向蚊体内的高效递送。在实施该操作时，需注意将长度不超过400 nt的内含子微小RNA表达盒插入埃及伊蚊浓核病毒基因组中。该技术建立后，为研究非缺陷型重组蚊媒浓核病毒的制备开辟了道路，此类病毒可过表达或下调微小RNA及其靶基因，进而开展蚊类基因的功能分析研究。

观看本视频后，您应能充分了解如何利用已开发的蚊媒浓核病毒递送系统来分析蚊子幼虫中的基因功能。