原位 MHC-四聚体染色及定量分析以确定组织中抗原特异性CD8 T细胞的位置、丰度和表型

本实验的总体目标是确定抗原特异性CD8阳性T细胞在目标组织中的定位、丰度及表型。该方法通过提供一种手段，用以定位、定量和表征几乎任何抗原特异性的CD8阳性T细胞及其所在组织，从而快速回答有关CD8 T细胞的问题。该技术的主要优势在于，能够确定抗原特异性CD8阳性T细胞相对于其他细胞和组织内结构的空间分布情况。

由Gwantwa Mwakalundwa演示该实验步骤，Shengbin Li参与操作。在实验第一天，使用手术刀将新鲜组织切成约0.5 × 0.5 厘米的组织块。图中显示的是猕猴脾脏组织。

将每个组织碎片分别粘贴到一个活塞顶部中央，然后将样品浸入 3 至 5 毫升预热的含 4% 低熔点琼脂糖的 PBS 溶液中。用相应的组织信息标记活塞。随后，将样品置于冰桶中的冷却支架内。

当琼脂凝固后，打开切片机并将切片厚度设置为 200 微米。安装新的刀片后，将样品托架插入切片机浴槽中。向切片机浴槽中加入 100 至 200 毫升新配制的 PBS-H，并加入 PBS-H 冰块以维持温度在 0 至 2 摄氏度之间。

获得200微米厚的切片后，使用画笔去除每一片切片周围的琼脂，并将样本转移至含有1毫升预冷PBS-H的24孔细胞培养板的各个孔中的独立组织切片室。当所有样本收集完毕后，在4°C条件下，将组织切片与1毫升FITC标记的肽段负载MHC I类四聚体（用含2%正常山羊血清的PBS-H稀释）在摇床上孵育过夜。次日早晨，将每个组织切片室转移至新的24孔板的各个孔中，每孔含1毫升新鲜预冷的PBS-H，孵育20分钟。

第二次洗涤后，在1毫升新鲜的4%多聚甲醛中室温固定切片2小时。随后用冰冷的PBS-H洗涤两次，每次5分钟。将切片转移至一个新的24孔板中，加入0.01摩尔的尿素，并微波处理3次，每次约10秒，直至尿素沸腾。

为了对样本进行通透和封闭处理，将切片置于封闭液中孵育，封闭液为在 PBS-H 中添加 0.3% Triton X-100 去垢剂和 2% 正常山羊血清，于 4 °C 在摇床上孵育一小时。孵育结束后，将组织腔室转移至新的 24 孔板的各个孔中，每孔加入 1 mL 溶液，其中包含兔抗 FITC 抗体、小鼠抗人 CD 抗体和大鼠抗人 CD3 抗体。将样本在 4 °C 条件下于摇床上过夜孵育。

第三天，在4摄氏度下用新鲜的PBS-H洗涤切片三次，每次至少20分钟，然后在避光条件下用相应的荧光标记二抗进行最终孵育，孵育时间最长可达三天。三抗孵育结束后，用新鲜的PBS-H对样品进行三次每次20分钟的洗涤，然后使用画笔将每个组织腔室中的样品转移至玻璃显微镜载玻片上。每张切片加一滴含荧光保护剂的封片液，加盖盖玻片封片。

然后，将切片存放在避光的切片盒中，置于 20 摄氏度环境下。在成像当天，将第一张切片放置于共聚焦显微镜的载物台上，并根据用于标记组织样本的每种荧光染料选择相应的激光器和滤光片。使用 20 倍物镜，在多个 800 × 800 像素的视野中，以 3 微米为间隔，依次在各荧光染料通道中获取 z 轴系列图像。

然后，将采集的视野拼接成全景图像，并根据相应的组织样本为每幅全景图像命名保存。在这些代表性图像中，使用负载SIV肽的MHC I类四聚体染色的切片与同一组织中使用负载无关肽的MHC I类四聚体染色的切片进行对比，以展示四聚体染色的特异性。在这些图像中，由负载SIV肽的MHC I类四聚体标记的病毒特异性T细胞同时表达CD8（一种T细胞亚群标志物），但不表达CD20（一种B细胞表面蛋白）。

该图像叠加图由多个共聚焦显微镜z层序列图像拼接而成，用于定量分析淋巴结中具有特定表型及位于不同解剖区域的四聚体染色细胞。此放大图像突出显示了叠加图中淋巴结的一个区域，其中包含由IgM染色界定的B细胞滤泡。在B细胞滤泡内和滤泡外均可检测到主要组织相容性复合物I类四聚体染色的细胞，其中部分细胞共同表达T细胞活化与增殖标志物KI67。

这种染色组合可用于确定SIV特异性CD8阳性T细胞的活化和增殖状态，以及它们在次级淋巴组织中的定位。一旦掌握，若操作得当，该技术可在约五天内完成。在进行此实验时，需牢记新鲜组织对成功染色至关重要。

在收获样本后24小时或更短时间内处理样本，并在固定前保持样本冷藏。观看本视频后，您应充分了解如何进行四聚体染色和免疫组织化学，以确定目标组织中抗原特异性CD8阳性T细胞的位置、丰度及表型。请注意，操作传染性病原体可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取预防暴露的措施，例如穿戴适当的个人防护装备，并尽量减少锐器的使用。