利用类群特异性rDNA引物对水生大型无脊椎动物进行肠道内容物遗传分析的实验室方案

本方案的总体目标是改进对营养生态学的研究，特别是针对野外样本的分析。该方法有助于回答食物网生态学领域的一些关键问题，例如入侵物种对营养相互作用的影响。其主要优势在于能够对完全相同的样本进行更具时间整合性的营养分析，且几乎每一位生态学家均可应用该方法。

尽管我们建立该方法旨在研究水生消费者对猎物的摄食情况，但其也可用于其他目的，例如确定底栖大型无脊椎动物样本中的物种组成。本实验操作将由本实验室的技术员 Christian Sodemann 进行演示。开始实验时，将先前解剖得到的捕食者消化道转移至含有 440 µL 盐提取缓冲液的 2 mL 安全锁反应管中。

将样品立即在零下20摄氏度冷冻，直至进行DNA提取。从冷冻箱中取出样品后，使用镊子向每个样品管中加入一颗5毫升的不锈钢珠，然后将样品置于室温下台面上解冻，随后开始DNA提取。使用珠磨机在15赫兹条件下均质化样品1分钟。

短暂离心样品后，向样品中加入90微升10% SDS和5微升10毫克/毫升蛋白酶K。接下来，充分涡旋混匀样品，并在ThermoMixer上于60摄氏度以400转/分钟持续振荡孵育1小时。为进一步促进裂解，孵育期间每10分钟涡旋混匀一次样品。

短时离心后，用移液器向样品中加入350微升5摩尔氯化钠。涡旋振荡30秒至1分钟，使样品充分混匀。然后在5摄氏度条件下以16,200 ×g离心40分钟。

因此，从离心机中取出样品时最关键的一步是避免磁珠移动，从而干扰含有需要在此步骤中去除的所有颗粒的沉淀物。接下来，小心地将约 600 µL 上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，注意不要扰动沉淀。加入 600 µL 冰冷的异丙醇，并轻轻翻转离心管数次。

在负20摄氏度下过夜保存。从冷冻机中取出样品后，在室温下以16,200 ×g离心20分钟。弃去上清液，注意不要丢失沉淀，然后用纸巾小心擦干离心管。

向含有DNA的沉淀中加入200微升预冷的70%乙醇，轻轻混匀后，在室温下以16,200 × g离心10分钟，以洗涤沉淀。小心弃去上清液，用无绒毛的擦镜纸仔细擦干管壁内侧。最后，使用调整至8微升的10微升移液器，小心吸除残留的上清液，注意勿扰动沉淀。

将沉淀干燥至所有乙醇完全挥发。然后加入50至100微升无核酸酶的水，短暂涡旋混匀，并在4摄氏度下静置过夜以溶解沉淀。为验证所提取DNA样品的功能效率，使用适用于相应食物来源的通用引物组对每个样品进行PCR检测。

首先，在一个1.5或2.5毫升的反应管中加入引物、dNTP混合物、反应缓冲液、Taq DNA聚合酶和纯化水，并涡旋混匀标准反应体系。接着，针对每个DNA样本，将1微升相应的DNA提取物转移至PCR板中含9微升标准反应体系的孔内。盖好PCR板，放入热循环仪中，并启动PCR程序。

PCR反应结束后，使用小型离心机的短时离心程序离心收集PCR产物。然后将每个PCR产物各3 µL与1 µL的6倍上样缓冲液混合，将这些样品加入预先制备好的琼脂糖凝胶的加样孔中。

将1.5微升100个碱基对的DNA分子量标记物加入凝胶的一个加样孔中，作为大小标准。关闭电泳仪盖子，连接电源，以每厘米100伏的电压电泳35分钟。电泳结束后，取出凝胶并放入预先准备好的染色液中染色约10分钟。

最后，将凝胶从染色液中取出，放置于凝胶成像系统中，根据仪器说明书进行成像。为分析捕食者肠道内容物，使用先前配制好的DNA提取物工作溶液。针对每一种16种猎物特异性引物组，分别进行独立的PCR反应。

每个PCR板中应包含一个来自相应猎物类群样本的阳性对照和一个来自捕食者物种的阴性对照。必须准确记录每个PCR板中样本的分配位置，以避免在将样本加载到测序板时混淆不同样本，从而防止在分配测序仪检测结果时将错误的结果归因于某个消费者个体。随后，使用与之前所述相同的实验方案进行PCR扩增，但需根据所用每对引物的特异性退火温度和循环次数进行调整。

为了检测这些 PCR 反应中的扩增片段，将自动化片段分析分为 A 和 B 两批进行。为每批准备含有样品上样溶液（SLS）和相应大小标准品的混合液。接下来，解冻属于相应批次的八个 PCR 反应的先前冷冻 PCR 产物，并确保避光保存。使用小型离心机的短时离心程序将样品离心。

在测序板上，根据待分析样本的数量，向相应数量的孔中各加入 22 微升对应的 SLS 片段大小标准混合物。然后，将八次 PCR 反应中每管的 1 微升 PCR 产物分别加入板中对应的孔内。接下来，使用微型板离心机的短时离心程序，小心离心使混合物沉降至管底。

随后，向每个孔中加入一滴矿物油覆盖。然后向缓冲液板的反应孔中加入 250 至 300 微升的 DNA 分离缓冲液。根据制造商的说明，使用毛细管测序仪软件创建样品设置。

确保样本设置中的样本分配与测序板中的样本分配一致，并且样本设置中包含适用于处理相应批次的正确方法。在分析结果时，必须对每个样本的电泳图进行目视复查，针对每套标记引物分别确认或取消每处峰的识别，并手动添加符合标记引物组标准但未被识别的峰，或删除错误识别的峰。在开展饲喂实验以评估本方案中用于PCR分析的组特异性引物组的有效性后，采用琼脂糖凝胶电泳以及单链构象多态性（SSCP）对来自捕食者胃肠道DNA的PCR结果进行了分析。

琼脂糖凝胶电泳显示出双链DNA的单一 条带，无法区分所研究的不同猎物物种。相比之下，通过将消化道内容物样本与参考样本进行比较，单链构象多态性（SSCP）电泳能够成功区分不同猎物物种。在捕食实验后，从水螨消化道中提取的DNA在摄食猎物后的不同时间点进行了测序。

在摄食后1至50小时内，检测到的猎物DNA相对含量显著减少。本研究提取了入侵性端足类动物绒杜氏虫（Dikerogammarus villosus）肠道中的DNA，并利用本方案中描述的16组特异性引物检测其宏无脊椎动物猎物DNA。仅有16%的D. villosus肠道内容物对所针对的16种目标猎物分类群中的任一物种DNA检测呈阳性。

此外，在至少一个样本中检测到了12种受试猎物分类单元的DNA，而有4个分类单元的DNA从未被检测到。在尝试该实验流程时，务必确保所使用的引物针对您研究系统中的分类单元具有特异性。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过将遗传分析方法与实验室常规使用的技术相结合，拓展您在营养相互作用方面的研究。