Name: 用基团特异 rDNA 引物对水生无脊椎动物进行遗传肠道含量分析的实验室规程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T12:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学习利用基团特异rDNA引物对水生无脊椎动物进行遗传肠道含量分析的方法。该技术可准确识别端足类猎物的物种组成，为研究营养生态学和食物网相互作用提供重要工具。

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我们感谢亚琛工业大学生态系统分析与评估研究所（gaiac）的Silke Classen在建立本实验方案所用的类群特异性引物组过程中提供的帮助。我们还感谢基尔大学的Peter Martin和Laura Schynawa在水螨实验中的合作。同时感谢技术实验室助理们保障实验室的顺利运行，并整理公司名录与货号目录。本研究由德国研究基金会（DFG；项目编号GE 2219/3-1）资助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍一种基于PCR的简便且经济高效的方法，通过针对rDNA区域的类群特异性引物，从野外样本中确定捕食者-猎物关系，该方法还可与同一样本的其他非分子分析相结合。然而，该实验方案中存在若干关键步骤。首先，必须确保所用引物的特异性。其次，在胃肠道样本制备及后续DNA提取过程中，必须避免污染和消化道内容物的损失。样本间的交叉污染可能导致猎物DNA的假阳性检测，而消化道内容物的丢失则可能导致稀有摄食猎物物种的漏检。验证目标样本中是否存在相应rDNA亚基以及分析所用模板的功能有效性（方案第2节）对于获取代表性的猎物摄食信息至关重要。特别是当无法检测到消费者本应摄食的猎物类群DNA时，此步骤尤为重要25,27。此外，在配制PCR反应体系（步骤3.1、5.1.1和5.1.2）时，所用反应混合物及程序必须严格符合相应引物针对特定分类群所设定的条件。否则，PCR反应中DNA扩增可能完全失败，或非目标分类群的DNA也可能被非特异性扩增。因此，每次PCR运行中必须设置阳性对照和阴性对照，以确认PCR反应的有效性并排除污染。同时，必须准确记录...

捕食者-猎物相互作用构成了大多数营养级相互作用和食物网动态，是表征物质和能量在生态系统内部及之间食物网中流动的关键方面，这也是生态学的主要目标之一1。确定碳和营养物质的来源及其流动路径，有助于深入理解生态系统之间的生态连通性2。然而，诸如河流及其流域等生态系统，不仅通过有机物和营养物质的通量相互连接，还通过生物体的移动实现连接3。因此，生境改变若中断了连接这些系统的资源流动，就可能强烈影响两个生态系统的食物网结构，这种影响不仅表现为直接效应，还可能通过改变捕食者-猎物群落的组成而产生间接效应。例如，已有研究表明食物网的变化与个别捕食者物种（如，虹鳟）的迁移行为相关4。此类变化可能威胁生物多样性以及水生生态系统的正常功能。因此，在野外分析捕食者-猎物相互作用，对于评估人类活动引起的环境变化（如水资源管理措施）对水生生态系统原生生物多样性的影响至关重要。
由于在复杂系统中追踪营养级联关系较为困难，目前已建立多种方法以实现对野外摄食相互作用的评估5。传统上，野外摄食关系的研究依赖于对解剖后肠道中猎物残余的视觉鉴定，且需要研究者具备关于猎物形态多样性的广泛知识。视觉肠道内容物分析已为多个消费者类群的资源利用提供了认识（例如，龙虾6以及鱼类7,8的食性季节性变化，或桡足类的摄食偏好）。然而，消化的物理过程使得视觉肠道内容物分析变得困难，并通常会遗漏软体猎物生物9。对于通过液体摄食的物种，或某些在摄食前会将食物充分粉碎的无脊椎动物消费者（如端足类），其肠道内容物中的猎物种类无法通过视觉鉴定10。由于这些局限性，分子分析提供了一种有前景的替代方法。
分子分析现已成为一种常用工具，可实现对肠道内容物中猎物的快速且精确的检测。此类技术的种类多样：基于单克隆抗体或聚合酶链式反应（PCR）的策略因其高特异性和高灵敏度而被广泛使用11。然而，新型单克隆抗体的开发耗时且成本高昂，因此在缺乏现成抗体的情况下，应用其他分子技术更具优势11。另一种常见方法是利用通用引物组扩增大多数物种中都存在的脱氧核糖核酸（DNA）区域，例如核糖体核糖核酸（RNA）基因12,13。使用该技术时，通常难以在混合来源的DNA中识别出全部范围的猎物生物14。为有效避免这一局限，可采用针对特定类群的特异性引物组进行遗传性肠道内容物分析。这类特异性引物被设计为仅扩增特定目标类群的DNA区域，同时排除所有其他物种15,16，从而能够在指定类群的分类学水平上识别猎物生物，而无需耗时且昂贵的二次分析。然而，与所有肠道内容物分析一样，此类分析仅能提供摄食行为的瞬时快照。因此，将分子肠道内容物分析与时间整合型天然示踪剂（例如，稳定同位素）分析相结合被认为更具优势1,2。
本文介绍了一种基于PCR的详细方法，用于研究捕食者-猎物相互作用，该方法采用针对核糖体DNA（rDNA）区域的类群特异性引物组，并可与同一样本的稳定同位素分析相结合。我们描述了通过琼脂糖凝胶电泳检测单一猎物类群DNA的方法。此外，当需要比引物特异性更高的分类学分辨率时，本文还提供了一种对这类类群特异性引物扩增的PCR产物进行后续下游分析的可行方案。由于单链DNA（ssDNA）片段会形成由其一级序列决定的三级构象17，因此此类类群特异性引物扩增出的片段即使存在微小变异，也会导致构象变化。这种变化可通过聚丙烯酰胺凝胶的单链构象多态性（SSCP）分析检测到17,18，从而实现对猎物生物更精确的鉴定（可达到物种水平）。
尽管琼脂糖凝胶电泳是一种常见且经济的用于观察DNA片段并确定其大致长度的工具19，但其分辨率取决于DNA的量以及所使用的染色染料20。通常，在处理纯DNA样品时，可视化过程较为直接；然而，消费者消化道内容物中可能存在的猎物DNA含量较低，这会使琼脂糖凝胶电泳结果的判读变得复杂。尽管如此，该检测方法仍适用于对来自野外的少量消费者样本进行一种或少数几种猎物类群的筛查；但由于判读上的困难，若需对大量样本进行多种猎物分类单元的筛查，则会极为耗时，因而不具可行性。一种更为灵敏的检测方法是通过毛细管电泳进行片段的自动化分析，该方法还可进一步精确测定片段的实际长度21。已有多个基于微卫星的研究表明，通过使用不同的荧光染料作为标记，可在自动化片段分析中检测并区分长度相近的不同片段22,23,24。因此，本文还提供了一项详细的实验方案，介绍如何利用带有荧光标记的类群特异性引物组进行PCR扩增，并通过自动测序仪进行自动化片段分析，从而实现对多个猎物类群DNA的并行检测。此外，我们还展示了一项案例研究的结果，证明通过自动化片段分析检测猎物DNA的方法同样能够实现对摄食猎物的相对定量。

<table><tbody><tr><td>液氮</td><td>任意</td><td>NA</td><td>用于将大型无脊椎动物野外样本运输至实验室。</td></tr><tr><td>1.5 ml 反应管 - Safelock</td><td>任意</td><td>NA</td><td>用于在野外采集消费者样本，并随后在液氮中保存；反应管不必须为PCR级洁净。为避免管体爆裂，应使用针头在管盖上穿刺小孔。</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>任意</td><td>NA</td><td>确保放大倍数适合解剖目标消费者个体的胃肠道。</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>任意</td><td>NA</td><td>用于在体视显微镜下解剖消费者样本的胃肠道。</td></tr><tr><td>不锈钢镊子：Dumont 镊子 No. 7</td><td>Bioform</td><td>B40d</td><td>这种弯曲的不锈钢镊子有时非常有助于将样本固定在弯曲部分之间，而不刺穿其胃肠道。</td></tr><tr><td>不锈钢镊子：Dumont 电子镊子 No. 5</td><td>Bioform</td><td>B40b</td><td>这种精细的不锈钢镊子非常适合用于消费者样本胃肠道的制备。</td></tr><tr><td>DNA-ExitusPlus</td><td>AppliChem</td><td>A7409,1000RF</td><td>用于去除DNA和RNA污染的去污溶液。</td></tr><tr><td>无绒纸巾</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>实验室天平</td><td>任意</td><td>NA</td><td>精度至少需达到0.01 g。</td></tr><tr><td>微量移液器（0.5–10/10–100/50–200/100–1000 &amp;mu;L）</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 管 2.0 ml</td><td>VWR</td><td>211-2165</td><td>这些反应管必须无DNA、DNase、RNase及PCR抑制剂（即PCR级洁净）！</td></tr><tr><td>Safe-Lock 管 1.5 ml</td><td>VWR</td><td>211-2164</td><td>这些反应管必须无DNA、DNase、RNase及PCR抑制剂（即PCR级洁净）！</td></tr><tr><td>氯化钠 &amp;ge;99.5%，分析纯，ACS，ISO</td><td>carlroth</td><td>3957.3</td><td>用于配制盐提取缓冲液（SEB）和DNA提取所需的5M NaCl溶液。</td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷 Tris</td><td>carlroth</td><td>4855.2</td><td>用于配制盐提取缓冲液（SEB）和TBE缓冲液。</td></tr><tr><td>微量移液器（0.5–10/10–100/50–200/100–1000 &amp;mu;L）</td><td>carlroth</td><td>8043.1</td><td>用于配制盐提取缓冲液（SEB）和TBE缓冲液。</td></tr><tr><td>硼酸 &amp;ge;99.8%，分析纯，ACS，ISO</td><td>carlroth</td><td>6943.2</td><td>用于配制TBE缓冲液。若使用市售TBE缓冲液，则无需此试剂。</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>carlroth</td><td>4360.1</td><td>用于DNA提取。</td></tr><tr><td>蛋白酶K 冻干粉</td><td>carlroth</td><td>7528.1</td><td>配制含10 mg/ml的使用液。</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Quiagen</td><td>85300</td><td>珠磨式均质仪，用于样本均质化。</td></tr><tr><td>不锈钢珠，5 mm</td><td>Quiagen</td><td>69989</td><td>用于样本均质化。</td></tr><tr><td>加热振荡金属浴</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机：himac CT 15 RE</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td>在DNA提取过程中（方案1）用于离心。</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>carlroth</td><td>6752.5</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 99.8%，分析纯</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水（ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>AppliChem</td><td>A7398,1000</td><td>无核酸酶（经蒸馏灭菌并用DEPC处理）的水，用于DNA重悬，以及文中所有提及ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O之处</td></tr><tr><td>未修饰的寡核苷酸</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>NA</td><td>未标记引物</td></tr><tr><td>修饰的寡核苷酸</td><td>Metabion International AG</td><td>NA</td><td>标记引物</td></tr><tr><td>peqGOLD Taq all inclusive</td><td>VWR Peqlab</td><td>01-1000</td><td>用于PCR反应体系（含反应缓冲液Y和S、dNTPs及MgCl₂）。</td></tr><tr><td>Primus 96 advanced gradient 热循环仪 或 peqStar96x Universal Gradient</td><td>Peqlab</td><td>NA</td><td>引物组最初在Primus 96 advanced gradient热循环仪上建立。由于该仪器较旧，我们随后检测了在相同条件下使用peqStar96x（可模拟旧型号）时引物组的效率和特异性。但测试结果表明，我们的引物在不使用旧机型模拟的情况下仍具有良好扩增效果和特异性（参见Koester等，2013）。</td></tr><tr><td>标准96孔PCR板</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-2879</td><td>用于PCR反应。</td></tr><tr><td>低轮廓0.15 ml管条及平盖条</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-3223</td><td>用于封闭PCR板。</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td>用于凝胶电泳。</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>锥形瓶</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>量筒</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>水平电泳装置及相应带齿梳子</td><td>任意</td><td>NA</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳。</td></tr><tr><td>电泳电源 PS3002</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭溶液 1%</td><td>carlroth</td><td>2218.1</td><td>用于配制琼脂糖凝胶染色浴。</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>carlroth</td><td>6749.1</td><td>用于SSCP分析的变性缓冲液。</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳的上样染料。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>carlroth</td><td>4621.1</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳的上样染料。</td></tr><tr><td>100 bp-DNA Ladder 扩展型</td><td>carlroth</td><td>T835.1</td><td>作为琼脂糖凝胶电泳的大小标准。</td></tr><tr><td>紫外成像系统</td><td>任意</td><td>NA</td><td>用于观察凝胶电泳结果。</td></tr><tr><td>Rotiphorese NF-丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 40%（29:1）</td><td>carlroth</td><td>A121.1</td><td>用于配制聚丙烯酰胺凝胶。</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>carlroth</td><td>9592.2</td><td>用于配制聚丙烯酰胺凝胶。</td></tr><tr><td>折叠夹（32 mm）</td><td>任意</td><td>NA</td><td>用于配制聚丙烯酰胺凝胶。</td></tr><tr><td>方形塑料盒（21 &amp;times; 6.5 &amp;times; 5 cm）</td><td>任意</td><td>NA</td><td>用于配制聚丙烯酰胺凝胶。</td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>carlroth</td><td>23.67.1</td><td>用于配制聚丙烯酰胺凝胶。</td></tr><tr><td>烧杯</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RC 10 数字制冷器</td><td>VWR</td><td>462-0138</td><td>用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。</td></tr><tr><td>垂直电泳装置 P10DS（OWL Separation Systems）</td><td>VWR</td><td>700-2361</td><td>用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。</td></tr><tr><td>带槽玻璃板</td><td>VWR</td><td>730-0261</td><td>用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。</td></tr><tr><td>空白玻璃板</td><td>VWR</td><td>730-0260</td><td>用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。</td></tr><tr><td>间隔片</td><td>VWR</td><td>730-0262</td><td>用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。</td></tr><tr><td>25齿梳子</td><td>VWR</td><td>730-0294</td><td>用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。</td></tr><tr><td>摇床平台</td><td>任意</td><td>NA</td><td>用于染色浴的持续振荡。</td></tr><tr><td>GelStar 核酸染料（Lonza Rockland, Inc.）</td><td>Biozym</td><td>850535 (50535)</td><td>用于聚丙烯酰胺凝胶染色。</td></tr><tr><td>GenomeLab DNA 大小标准试剂盒 400bp</td><td>AB Sciex</td><td>608098</td><td>用于自动化片段分析。Batch B的大小标准。</td></tr><tr><td>GenomeLab DNA 大小标准试剂盒 600bp</td><td>AB Sciex</td><td>608095</td><td>用于自动化片段分析。Batch A的大小标准。</td></tr><tr><td>上样溶液（SLS）</td><td>AB Sciex</td><td>608082</td><td>用于自动化片段分析。</td></tr><tr><td>测序板 - 96孔聚丙烯PCR微孔板</td><td>Costar</td><td>6551</td><td>用于自动化片段分析。</td></tr><tr><td>板式离心机，PerfectSpin P</td><td>VWR Peqlab</td><td>NA</td><td>小型板式离心机，用于离心PCR产物。</td></tr><tr><td>缓冲板 - 96孔EIA/RIA透明平底未处理聚苯乙烯微孔板</td><td>Corning</td><td>9017</td><td>用于自动化片段分析。</td></tr><tr><td>GenomeLab 分离缓冲液</td><td>AB Sciex</td><td>608012</td><td>用于自动化片段分析。</td></tr><tr><td>分离胶 - LPAI</td><td>AB Sciex</td><td>608010</td><td>用于自动化片段分析。</td></tr><tr><td>测序仪 - CEQ8000 遗传分析系统</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>用于自动化片段分析。</td></tr><tr><td>GeneMarker V1.95</td><td>Softgenetics</td><td>NA</td><td>用于分析自动化片段分析结果。</td></tr></tbody></table>

利用类群特异性rdna引物对水生大型无脊椎动物进行肠道内容物遗传分析的实验室方案

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

分析食物网对于更好地理解生态系统至关重要。例如，外来物种的入侵可能导致食物网相互作用发生严重变化。然而，在许多情况下，准确鉴定野外捕食者与猎物之间的相互关系十分困难。这类分析通常依赖于对肠道内容物的视觉评估或稳定同位素比值（δ15N 和 δ13C）的分析。这些方法需要对各个猎物生物的形态多样性或同位素特征有全面了解，从而在准确鉴定猎物生物时面临障碍。尤其是视觉肠道内容物分析往往会低估软体猎物生物，因为猎物的破碎、摄食和消化过程使得特定物种的鉴定变得困难。因此，基于聚合酶链式反应（PCR）的策略，例如使用类群特异性引物组，为研究食物网相互作用提供了强有力的工具。本文中，我们详细描述了利用核糖体脱氧核糖核酸（rDNA）的类群特异性引物组来研究野外大型无脊椎动物消费者肠道内容物的实验方案。DNA 可从整只标本（针对小型分类单元）或从野外采集个体的肠道内容物中提取。需使用靶向相应 DNA 亚基的通用引物组，直接从待测个体确认 DNA 模板的存在及其功能效率。我们还证明，通过使用未修饰的类群特异性引物进行 PCR 扩增，并结合后续的单链构象多态性（SSCP）分析（采用聚丙烯酰胺凝胶），可将所摄食猎物进一步鉴定至物种水平。此外，我们展示，使用不同荧光染料作为标记，可通过自动化片段分析对多个肠道内容物样本中的不同猎物类群 DNA 片段进行并行筛查。

我们已成功将本方案中所述步骤应用于不同研究的饮食分析。在本节中，我们将举例说明该方案各个部分的适用性。
例如，为了展示作者建立的组特异性引物组的有效性28 以及通过SSCP分析对PCR产物进行进一步下游分析的潜力，开展了一项摄食实验。个体 Dikerogammarus villosus 作为捕食者和 Caenis 以莱茵河及卡尔斯鲁厄（德国）附近回水区采集的spp.幼虫作为猎物。在实验室中，捕食者与猎物分类群分别饲养于过滤的溪水水体中，温度为 20 °C 并饥饿处理36小时。实验时，将每只端足类动物标本单独置于含有100 mL过滤溪水的烧杯中，喂食两到三条 Caenis 幼虫处理30分钟，随后在液氮中冷冻。每条幼虫的胃肠道 D. villosus 解剖后，按照方案1所述方法提取DNA。使用适用于检测的Caep28S引物组对DNA提取物...

对大型无脊椎动物肠道内容物的分析大多采用视觉检测方法。这类方法需要研究者具备关于猎物生物形态多样性的深入知识，且无法检测到软体猎物，同时由于猎物被严重破碎，使得某些生物（包括钩虾）的鉴定几乎无法进行。本文提供了针对钩虾食性中大型无脊椎动物猎物鉴定的详细且新颖的遗传学方法。

利用类群特异性rDNA引物对水生大型无脊椎动物进行肠道内容物遗传分析的实验室方案

分析食物网对于更好地理解生态系统至关重要。例如，食物网中的相互作用可能因……而发生剧烈变化。

本方案的总体目标是改进对营养生态学的研究，特别是针对野外样本的分析。该方法有助于回答食物网生态学领域的一些关键问题，例如入侵物种对营养相互作用的影响。其主要优势在于能够对完全相同的样本进行更长时间整合的营养分析，并且几乎每一位生态学家都可以应用该方法。尽管我们建立该方法旨在深入了解水生消费者对猎物的摄食情况，但它也可用于其他目的，例如确定底栖大型无脊椎动物样本中的物种组成。本实验操作将由本实验室的技术员 Christian Sodemann 演示。开始实验时，将先前解剖得到的捕食者消化道转移至含有 440 µL 盐提取缓冲液的 2 mL 安全锁反应管中。立即将样本在负20摄氏度下冷冻，直至进行DNA提取。从冰箱中取出样本后，使用镊子向每个样本管中加入一颗5毫升的不锈钢珠，然后将样本置于室温下的实验台上解冻。使用珠磨机在15赫兹下均质化样本1分钟。短暂离心样品后，向各样品中加入 90 微升 10% SDS 和 5 微升 10 毫克/毫升蛋白酶 K。接着，充分涡旋混匀样品，并在 ThermoMixer 上以 60 摄氏度、400 转/分钟持续振荡孵育 1 小时。为促进进一步裂解，孵育期间每 10 分钟涡旋混匀一次样品。短暂离心后，用移液器向样品中加入350微升5摩尔氯化钠。涡旋振荡30秒至1分钟，充分混匀样品。然后在5摄氏度下以16,200 × g离心40分钟。因此，从离心机中取出样品时最关键的一步是避免磁珠移动，从而干扰含有需要通过该步骤去除的所有颗粒的沉淀物。接下来，小心地将约 600 微升上清液转移至新的 1.5 毫升离心管中，注意不要扰动沉淀。加入 600 微升预冷的异丙醇，并轻轻翻转离心管数次。在负20摄氏度下过夜保存。从冷冻机中取出样品后，在室温下以16,200 × g离心20分钟。弃去上清液，注意勿丢失沉淀，用滤纸小心擦干管壁。向含有 DNA 的沉淀中加入 200 微升预冷的 70% 乙醇，混匀后在室温下以 16,200 × g 离心 10 分钟，洗涤沉淀。小心弃去上清液，并用无绒纸巾仔细擦干管壁。最后，用调整至 8 微升的 10 微升移液器小心吸除残留的上清液，注意勿扰动沉淀。将沉淀干燥至所有乙醇完全挥发。然后加入50至100微升无核酸酶的水，短暂涡旋混匀，并在4摄氏度下静置过夜以溶解沉淀。为验证所提取DNA样品的功能效率，使用适用于相应食物来源的通用引物组对每个样品进行PCR检测。首先，在一个1.5或2.5毫升的反应管中加入引物、dNTP混合物、反应缓冲液、Taq DNA聚合酶和纯化水，涡旋混匀标准反应体系。然后，针对每个DNA样本，将1微升相应的DNA提取物转移至PCR板中含9微升标准反应体系的孔内。封闭PCR板，放入热循环仪中，并启动PCR程序。PCR反应结束后，使用小型离心机的短时离心程序离心收集PCR产物。然后将每份PCR产物各3 µL与1 µL的6倍上样缓冲液混合，将这些样品加入预先制备好的琼脂糖凝胶的加样孔中。将 1.5 微升 100 个碱基对的 DNA 分子量标记物加入凝胶的一个加样孔中，作为大小标准。关闭电泳仪盖子，连接电源，以每厘米 100 伏的电压电泳 35 分钟。电泳结束后，取出凝胶并放入预先准备好的染色液中染色约 10 分钟。最后，将凝胶从染色液中取出，放置于凝胶成像系统中，按照说明书进行成像。为分析捕食者肠道内容物，使用预先配制好的DNA提取物工作溶液。针对16种不同的猎物特异性引物组，分别进行独立的PCR扩增反应。每个 PCR 板中应包含一个来自相应猎物类群样本的阳性对照和一个来自捕食者物种的阴性对照。必须准确记录每个 PCR 板中样本的分配位置，以避免在将样本加载到测序板时发生样本混淆，从而防止在分配测序仪检测结果时将错误的结果归因于某个消费者个体。随后，使用与之前所述相同的 PCR 反应程序进行扩增，但需根据所用每对引物的特异性退火温度和循环次数进行调整。为了检测这些 PCR 反应中的扩增片段，将自动化片段分析分为 A 和 B 两批进行。为每批准备含有样品上样溶液（SLS）和相应大小标准品的混合液。接下来，解冻属于相应批次的八个 PCR 反应的先前冷冻的 PCR 产物，并确保避光保存。使用小型离心机的短时离心程序将样品离心。在测序板上，根据待分析样本的数量，向相应数量的孔中各加入 22 微升对应的 SLS 片段大小标准混合液。然后将八个 PCR 反应中每个反应的 1 微升 PCR 产物分别加入板中对应的孔内。接下来，使用微型板离心机的短时运行程序，小心离心使该混合物沉降至孔底。随后，向每个孔中加入一滴矿物油覆盖。然后在缓冲液板的反应孔中加入250至300微升DNA分离缓冲液。根据制造商的说明，使用毛细管测序仪软件创建样本设置。确保样本设置中的样本分配与测序板中的样本分配一致，并且样本设置中包含适用于处理相应批次的分析方法。在分析结果时，必须对每个样本的电泳图进行目视复查，针对每套标记引物分别确认或取消系统识别的每个峰，并手动添加符合标记引物组标准但未被识别的峰，或删除错误识别的峰。在开展饲喂实验以评估本方案中建立的针对PCR分析的组特异性引物组有效性后，采用琼脂糖凝胶电泳以及单链构象多态性（SSCP）对来自捕食者胃肠道DNA的PCR结果进行分析。琼脂糖凝胶电泳显示出双链DNA的单一 条带，无法区分所研究的不同猎物物种。相比之下，通过将捕食者肠道内容物样本与参考样本进行比较，SSCP电泳能够成功区分不同猎物物种。在捕食实验后，从水螨肠道中提取的DNA在摄食猎物后的不同时间点进行了测序。进食后1至50小时内，检测到的猎物DNA相对含量显著减少。本研究提取了入侵性端足类动物绒毛新钩虾（Dikerogammarus villosus）肠道中的DNA，并利用本实验方案中描述的16组特异性引物检测其宏无脊椎动物猎物DNA。结果显示，仅有16%的绒毛新钩虾肠道内容物对这16种目标猎物分类群中的任意一种呈DNA阳性。此外，在至少一个样本中检测到了12种受试猎物分类单元的DNA，而有4个分类单元的DNA从未被检出。在尝试该实验流程时，需注意确保所使用的引物对您研究系统中的分类单元具有特异性。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过将遗传分析方法与实验室常规使用的技术相结合，拓展您在营养相互作用方面的研究。

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