立体定位图谱引导的激光显微切割技术用于分离受创伤性损伤影响的脑区

本激光显微切割实验方案的总体目标是从受创伤性脑损伤影响的特定脑区中收集细胞，用于分子分析。我是海伦·赫尔姆奇博士。我的研究生助手哈里斯·魏斯（Harris Weisz）是德克萨斯大学医学分部人类病理生理学与转化医学项目的一名学生，他将演示我们在脑损伤研究中如何使用激光显微切割技术。

该方法有助于阐明创伤性脑损伤（TBI）引起的大脑特定区域（如控制执行功能的额叶皮层，以及对依赖记忆过程至关重要的海马）变化的机制与后果。该技术的主要优势在于，我们可以研究同一脑组织中疾病过程对多个特定脑区或特定细胞类型的影响。

在进行任何包含转录分析的激光显微切割（LCM）操作之前，需使用RNase清除剂清洁所有表面，以降低污染和RNA降解的风险。从储存条件下取出脑组织，并置于预冷至-20摄氏度的冷冻切片机中。

将脑组织置于冷冻切片机腔室内，平衡至其温度约十分钟。将脑组织腹面朝上放置在冷冻切片机载物台的纱布上。使用洁净的RNA级剃须刀片，于小脑前方紧邻处及视交叉前方紧邻处切去脑组织的后段和前段部分。

将少量包埋用最佳切割温度（OCT）介质分别加入两个独立的冷冻模具中。将包含额叶联合皮层和伏隔核核心的脑组织放入其中一个冷冻模具中，组织底面朝下。加入足量OCT介质以完全覆盖组织。

用含有海马体和视交叉上核的脑组织样本重复此步骤。将OCT包埋剂在冷冻切片机中完全冷冻约20分钟。待组织和OCT包埋剂完全冻结后，挤少量OTC包埋剂至切片托上。

将冷冻的包埋模具按压在固定头上海，使OCT完全冻结，从而使含有组织的模具牢固地附着在固定头上。将固定头安装到切片装置上并拧紧螺丝。使用调节杆调整相对于冰冻切片机刀片的切割角度，以确保切片均匀。

将切片厚度设置为 30 微米。在切取包含海马和嗅脑神经（SEN）的组织块时，持续切片至视交叉在前囟 0.48 毫米处变得扁平，且第三脑室开始明显显现时为止。此后，从此位置开始收集用于扫描电镜（SEM）的切片，方法是将室温下的聚萘二甲酸乙二醇酯（polyethylene naphthalate）膜载玻片轻轻放置在已切好的组织切片上。

通过肉眼观察确认组织和包埋剂（OTC）已完全熔融贴附于载玻片上。将所有带有组织切片的载玻片存放于冷冻切片机（cryostat）中，直至染色。当视上交叉开始出现时，在前囟0.72毫米处停止收集切片。

对于海马体的采集，切片至在前囟3.00毫米处可见颗粒细胞层齿状回的角部。继续采集切片，直至在前囟4.78毫米处冠状切面上海马体CA亚区融合。这有助于在开颅和损伤部位下方完整采集海马体。

染色前，需在化学通风橱内使用去除RNase的洗涤剂清洗所有器皿及染色区域。将冷冻切片机上的载玻片架取出并置于通风橱内，让载玻片复温30秒。

用焦油紫对切片进行染色，并用生理盐水透明。将染色后的切片架置于通风橱内室温下晾干，时间不超过十分钟。切片干燥后，立即进行激光显微切割（LCM）。

在开始任何用于RNA分析的LCM实验前，需使用去除RNA酶的清洁剂和100%乙醇擦拭收集区域及设备周围区域。在打开显微镜底座电源之前，先打开红外激光发生单元的电源开关，并在从桌面启动软件前，让系统完成初始化。待软件启动并完成初始化步骤后，打开软件设置面板，然后按下“定位载物台”按钮。

模块化载台将移动到可装载和卸载激光显微切割宏帽和载玻片的位置。将最多三张膜片载玻片放入支架中，磨砂边缘朝向右侧。选择对应载玻片旁边的帽和载玻片操作区域，然后点击 MEM 复选框，以告知软件已装载膜片玻璃载玻片。

然后点击要首先捕获的目标切片。为获取用于显示组织位置与方向的拼接图像以确定帽位放置，选择工具栏中的图像并选择“获取概览”。将光标置于拼接图像的相应区域，右键单击，选择“在区域中心放置帽位”。

软件将自动在选定位置上覆盖一个顶盖。定位红外和紫外激光后，在选择工具面板中选择手绘选项。使用触摸屏触控笔，围绕目标区域的边界进行绘制，同时确保触控笔笔头与触摸屏始终保持接触。

确保将起始点和终点连接在一起。对于海马体的采集，从前囟3.00毫米处开始，以齿状回颗粒层完全形成的位置作为形态学鉴定的解剖标志，使用激光捕获显微切割技术采集CA1、CA2和CA3海马亚区。采集完成后，将LCM宏帽转移至质量控制（QC）位置，并通过肉眼观察确认紫外切割后的组织已完全附着在膜上，以检查组织粘附的完整性。

必须确保紫外激光完整切割组织的整个边缘，否则将导致组织无法完全黏附到激光显微切割帽上。随后，迅速将每个帽放入含有100 µL细胞裂解缓冲液的无RNA酶0.5 mL薄壁反应管中。

短暂涡旋振荡样品以确保充分裂解，并在−80 °C下保存，直至进行后续基因组分析。以下是使用LCM系统上的红外和紫外激光功能采集的损伤部位同侧组织切片的代表性图像。该区域为额叶联合皮层。

此图像显示采集后的同一区域。这是采集后帽上的组织。此图像显示了位于齿状回颗粒层完全成形的角旁边的海马体CA1、CA2和CA3区的各层结构。

采集了CA2和CA3区域，这些细胞群体现在帽上可见。此处，前连合近端腹侧的伏隔核核心区域被作为靶区，并已在帽上准确重现。最后，在创伤性脑损伤（TBI）后，通过激光显微切割技术成功捕获了视上交叉前方的视交叉上核。

一旦掌握，该技术可用于在约八小时内处理一个脑组织，包括组织处理、染色及激光显微切割（LCM）。按照本方案操作后，可进一步采用其他方法，如表观遗传学分析，以研究甲基化模式或微小RNA表达相关问题。

观看本视频后，您应能充分掌握如何在同一脑组织上对多个脑区进行激光显微切割（LCM）。