立体定位图谱引导的激光显微切割技术用于分离受创伤性损伤影响的脑区

本激光显微切割实验方案的总体目标是从受创伤性脑损伤影响的特定脑区收集细胞，用于分子分析。我是海伦·赫尔米奇博士。我的研究生助手哈里斯·魏斯，是德克萨斯大学医学分部人类病理生理学与转化医学项目的学生，他将演示我们在脑损伤研究中如何使用激光显微切割技术。

该方法有助于阐明创伤性脑损伤（TBI）引起的大脑特定区域变化的机制及其后果，例如控制执行功能的额叶皮层，以及对依赖记忆过程至关重要的海马。该技术的主要优势在于，我们可以研究同一脑组织中疾病过程对多个特定脑区或特定细胞类型的效应。

在进行任何包含转录分析的激光显微切割（LCM）操作之前，需使用RNase清除剂清洁所有表面，以降低污染和RNA降解的风险。从储存中取出脑组织，并置于预冷至零下20摄氏度的冷冻切片机中。

将脑组织置于冷冻切片机腔室内，平衡至其温度约十分钟。将脑组织腹面朝上放置在冷冻切片机载物台的纱布上。使用洁净的RNA级剃须刀片，于小脑前方紧邻处及视交叉前方紧邻处分别切除后部和前部组织。

取少量最佳切割温度介质，分别加入两个独立的冷冻模具中。将含有额叶联合皮层和伏隔核核心的脑组织放入其中一个冷冻模具内，组织面朝下。加入足量的OCT介质以完全覆盖组织。

用含有海马体和视交叉上核的脑组织样本重复此步骤。将OCT包埋剂在冷冻切片机中完全冷冻约20分钟。待组织和OCT包埋剂完全冻结后，在切片机持样头表面挤少量OCT包埋剂。

将冷冻的包埋模具按压到包埋头，并使OCT完全冻结，以确保含有组织的模具牢固地附着在包埋头上。将包埋头固定到切片装置上，并拧紧螺钉。使用调节杠杆调整切片角度与恒冷切片机刀片之间的相对位置，以确保切片均匀。

将切片厚度设置为 30 微米。在切取包含海马和室管膜下区（SEN）的组织块时，持续切片至视交叉在前囟后 0.48 毫米处变得扁平，且第三脑室开始明显显现。此后，从此位置开始收集用于扫描电镜（SEM）的切片，方法是将室温下的聚萘二甲酸乙二醇酯（polyethylene naphthalate）膜载玻片轻轻放置在已切好的组织切片上。

通过肉眼观察确认组织和OCT完全熔融附着于载玻片上。将所有带有组织切片的载玻片存放于冷冻切片机中，直至染色。当视上交叉开始出现时，在前囟0.72毫米处停止收集切片。

对于海马体的采集，切片至在前囟3.00毫米处可见颗粒细胞层齿状回的角部。继续采集切片，直至在前囟4.78毫米处的冠状切面上海马体CA亚区融合。这有助于在颅骨开窗及损伤部位下方完整采集海马体。

染色前，需在化学通风橱内使用去除RNase的洗涤剂清洗所有器皿及染色区域。将冷冻切片机上的载玻片架取出后置于通风橱内，让载玻片复温30秒。

用焦油紫对切片进行染色，并用生理盐水清洗。将染色后的切片架置于通风橱内室温下晾干，时间不超过十分钟。切片干燥后，立即进行激光显微切割（LCM）。

在开始任何用于RNA分析的LCM实验前，需使用去除RNA酶的清洁剂和100%乙醇擦拭收集区域及设备周围区域。在打开显微镜底座电源之前，先打开红外激光发生单元的电源开关，并在从桌面启动软件前让系统完成初始化。待软件启动并完成初始化步骤后，打开软件设置面板，然后按下“定位载物台”按钮。

模块化载台将移动至可装载和卸载激光显微切割宏帽及载片的位置。将最多三张膜片载玻片放入支架中，磨砂边缘朝右。选择与相应载片相邻的帽和载片操作区域，然后单击 MEM 复选框，以告知软件已装入膜片玻璃载片。

然后单击要首先捕获的指定幻灯片。为获取用于组织位置和方向定位以进行帽置放的拼接图像，请在工具栏上选择图像，然后选择获取概览。将光标置于拼接图像的相应区域上，右键单击，然后选择在区域中心放置帽。

软件将自动在选定位置上覆盖一个盖帽。定位红外和紫外激光后，在选择工具面板中选择自由绘制选项。使用触摸屏触控笔，在绘制感兴趣区域的周边轮廓时，确保触控笔笔头与触摸屏始终保持接触。

确保将起始点和终点连接在一起。对于海马体的采集，从前囟3.00毫米处开始，以齿状回颗粒层完全形成的位置作为形态学鉴定的解剖标志，使用激光捕获显微切割技术采集CA1、CA2和CA3海马亚区。采集完成后，将LCM宏帽转移至质量控制（QC）位置，并通过肉眼观察确认紫外切割后的组织已完全附着在膜上，以检查组织是否完整黏附。

必须确保紫外激光完整切割组织的整个周边，否则将导致组织无法完全黏附到激光显微切割帽上。随后，迅速将每个帽放入含有100 µL细胞裂解缓冲液的无RNA酶0.5 mL薄壁反应管中。

短暂涡旋振荡样品以确保充分裂解，并在−80 °C下保存，直至进行后续基因组分析。以下是使用LCM系统上的红外和紫外激光功能采集的损伤部位同侧组织切片的代表性图像。该区域为额叶联合皮层。

此图像显示采集后相同区域的情况。这是采集后帽上的组织。此图像显示了位于齿状回颗粒层完全成形的角旁边的海马体CA1、CA2和CA3节段层的结构。

采集了CA2和CA3区域，这些细胞群在帽上可见。此处，以位于前连合近端腹侧的伏隔核核心区域为靶区，该区域已准确地呈现在帽上。最后，在创伤性脑损伤（TBI）后，通过激光显微切割技术捕获了位于视上交叉前方的视交叉上核。

一旦掌握，该技术可用于在大约八小时内处理一个脑组织，包括组织处理、染色和激光显微切割。在完成该操作步骤后，可进一步采用其他方法（如表观遗传学分析）来研究甲基化模式或微小核糖核酸表达等问题。

观看本视频后，您应该能够充分掌握如何在同一脑组织上对多个脑区进行激光显微切割（LCM）。