Name: 雌性叙利亚仓鼠自然奖赏行为中细胞外神经递质的测量体内变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学习使用固定电位安培记录法和酶生物传感器技术，在清醒行为的雌性叙利亚仓鼠中测量多巴胺和谷氨酸的释放动态。该方法为行为神经科学研究提供高时间分辨率的神经递质检测手段。

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作者感谢本科生 Daniel Korus 在运行 Matlab 代码方面的帮助，以及本科生 Alex Boettcher 在开展行为实验中的协助。本项目由 NSF IOS 1256799（资助对象：R.L.M.）以及美国国立卫生研究院国家药物滥用研究所资助奖项编号 T32DA007234 支持。

本研究所述所有操作程序均经明尼苏达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并符合《实验动物照护与使用指南》13 的规定。
1. 动物与插管手术
<ol>
	<li>从常见的实验动物供应商处获取约55日龄的叙利亚仓鼠。 
	注意：尽管由于不同实验范式的限制，实验动物的年龄可能有所差异，但在研究性行为时，应获取年龄相近且均已达到性成熟的动物。</li>
	<li>在温度可控（22 °C）和光照可控（14小时光照后接10小时黑暗，光照于13:00关闭）的环境中饲养动物，自由供应食物和水 随意摄取 除非在实验测试期间。 
	注意：由于仓鼠具有季节性繁殖特性，该14小时光照/10小时黑暗的光周期模拟了其自然繁殖条件。</li>
	<li>在实验室适应1周后，在全身麻醉下进行无菌双侧卵巢切除术和颅内立体定位套管植入术例如，戊巴比妥），并按照先前所述方法给予适当的机构批准的术后镇痛和抗生素治疗14,15. 
	注意：在性行为研究中，必须进行卵巢切除术以去除内源性性激素的主要来源，从而使动物能够根据实验时间线，通过外源性激素处理被统一诱导进入性接受状态。
	<ol>
		<li>对于多巴胺能和谷氨酸能探针的植入，通过立体定位仪植入导管套管（直径0.7 mm； 图3)进入目标区域（例如，本实验按照其他文献中逐步详述的方法，靶向右侧伏隔核（NAc）15. 
		注意：尽管所展示的数据来自每只动物单个谷氨酸或多巴胺探针的单传感器记录，但该系统支持在单只动物体内同时记录最多4个传感器；因此，可根据预期的实验设计和研究目标植入1至4个套管。
		<ol>
			<li>使用立体定位图谱确定目标区域的植入坐标例如, 金黄地鼠脑 由 Morin &amp;#38; Wood），需注意传感器会从套管针下方延伸1毫米进入脑组织。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在将套管立体定位至目标背腹侧位置后，使用牙科丙烯酸树脂制作的帽将其固定于颅骨，辅以不锈钢骨螺钉和塑料头帽装置图3；参见15 有关更多详细信息）。</li>
		<li>进行碳纤维测试时，将一根参比电极（直径350 μm，总长度7.5 mm）插入对侧半球。 
		注意：无需指定相对于套管的具体位置或距离；参考电极可置于对侧半球任何方便的位置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 生物传感器与碳纤维测试
<ol>
	<li>手术后恢复1周，给予激素预处理方案以诱导性接受行为。
	<ol>
		<li>皮下注射（s.c.）0.1 mL 棉籽油中含有 10 µg 苯甲酸雌二醇，在性行为测试前约 48 小时和 24 小时各注射一次，以诱导雌性对雄性的性接受性11.</li>
		<li>皮下注射500 µg孕酮溶于0.1 mL棉籽油中，在引入雄性前4小时进行，以诱导性接受状态11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在每日周期的暗期开始时对所有动物进行测试，因为啮齿类动物的社会行为在白光和红光测试条件下均可能发生改变16,17,18.</li>
	<li>用于酶法生物传感器检测谷氨酸时，校准传感器 体外 (图4使用前按先前所述进行处理15,19.
	<ol>
		<li>当天测试前在20 mL玻璃离心管中新鲜配制校准溶液。对于分析物溶液，将7.4 mg L-谷氨酸溶解于10 mL超纯H2轻轻翻转试管混匀。通过将176.1 mg AA溶解于10 mL超纯H₂O中制备干扰物溶液。2O.</li>
		<li>在基础实验室铁架台底座上放置一个磁力搅拌器，以进行校准设置。将一个20 mL夹套烧杯置于磁力搅拌器上方，并使用中型双爪夹将其固定。
		<ol>
			<li>加入一个磁力搅拌子和20 mL 100 mM磷酸盐缓冲液（PBS）到夹套烧杯中。将夹套烧杯连接至循环水浴，加热缓冲液至37 °C。 
			注意：由于酶活性受温度影响，酶法生物传感器的校准必须在体温条件下进行。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将传感器校准支架置于夹套烧杯上方，并在其上放置一个四通道校准前置放大器，使用直角夹固定。将前置放大器连接至数据调理与采集设备，以记录校准数据。</li>
		<li>测试每种酶生物传感器对谷氨酸（或其他市售生物传感器探针所关注的其他分析物）的灵敏度 例如，葡萄糖）的缓冲溶液中，进行实验前校准。
		<ol>
			<li>在将每个待测传感器（最多4个）连接至4通道校准前置放大器的端口之前，使用免费下载的数据采集软件在计算机界面上启动新的记录。让传感器达到稳定的基线水平。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>当传感器达到稳定基线后，开始加入分析物注射。利用校准支架上的孔将移液枪头插入缓冲液中。使用记录软件中的快捷键注释工具，标记每次注射的时间点。
		<ol>
			<li>通过移液将40 μL分析物溶液加入缓冲液中，实现10 µM的谷氨酸添加。每次添加后等待传感器信号稳定。在加入一次干扰物抗坏血酸（AA）溶液之前，先进行三次分析物溶液的注射（每次注射体积为50 μL，使浓度变化250 μM）。 
			注意：如果需要，校准可用于将安培信号的变化（在步骤 2.12 的酶学实验记录过程中观察到）转换为谷氨酸浓度的变化。参见参考文献15 逐步操作说明。本实验室使用的多巴胺探针由商业供应商在生产过程中完成校准。谷氨酸探针则必须在使用时进行校准，因其灵敏度会随着时间推移而下降，原因是酶组分逐渐降解。19由于碳纤维电极不会发生降解，只要避免因额外操作而增加损坏细碳纤维（直径350 μm）的风险，公司在发货前进行的校准已足够。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用取自动物居住笼具的垫料铺设测试箱。 
	注意：这会增加雌性对测试环境的熟悉程度，同时使雄性暴露于雌性在雌二醇处理后释放的、具有性刺激作用的嗅觉交配信号。</li>
	<li>在将探头插入动物体内之前，使用异氟烷或其他挥发性麻醉剂在诱导室中对动物进行轻度麻醉。</li>
	<li>从导向套管中移除封闭堵塞物，并将碳纤维电极或酶促探针插入导向套管中。</li>
	<li>探针插入后，将动物放入测试室。 
	注意：本实验使用一个10加仑的玻璃水族箱（24.5 × 48.9 × 29.4 cm），但也可使用面积相同的圆形容器。</li>
	<li>开始在商业软件程序中录制视频和时间锁定的安培信号，该程序的详细说明见其他文献15.</li>
	<li>将传感器通过屏蔽电缆和电旋转接头连接至记录系统：恒电位仪。通过将针状附件旋入头帽固定装置来稳定传感器连接。如有必要，使用实验室薄膜加固连接处。 
	注意：需要一个定制连接器将碳纤维电极和参比电极连接到恒电位仪，而酶型谷氨酸传感器可直接连接到恒电位仪。</li>
	<li>在进行实验测试之前，让传感器在脑内达到平衡状态。 
	注意：平衡时间根据记录传感器的不同而有所差异（例如酶传感器需要2至4小时的平衡时间，而碳纤维电极仅需约30分钟。若同时植入两种类型的传感器，应以较长的酶传感器平衡时间为准进行平衡。</li>
	<li>传感器平衡后，将一只刺激用雄性个体引入测试腔室。</li>
	<li>在刺激雄性小鼠完成首次插入（称为插入射精）后，根据实验目的继续记录10至30分钟。</li>
	<li>行为测试结束后，断开雌性小鼠的传感器。</li>
	<li>将两只仓鼠从测试箱中移出。清除垫料，并使用70%乙醇清洁测试箱。 
	注意：由于碳纤维记录所需的平衡时间较短，可在同一天内重复步骤 2.3 - 2.14 以测试多个动物。相比之下，由于酶传感器需要约 4 小时的平衡时间，为避免因动物测试时的昼夜节律时间差异导致可能的个体间变异，每天仅测试一个动物。</li>
</ol>
3. 处死与灌注
<ol>
	<li>测试期结束后，使用安乐死试剂对雌性受试动物进行深度麻醉（例如，本实验室采用腹腔注射0.2 mL苯妥英钠和戊巴比妥钠溶液）。</li>
	<li>用25 mM PBS（pH 7.6）经心脏灌注动物，以清除所有循环血液，随后用4%多聚甲醛-PBS固定20分钟。</li>
	<li>取出脑组织，置于50 mL锥形管中，加入约30 mL 4%多聚甲醛溶液，4℃过夜后固定。
	<ol>
		<li>将脑组织保存在10%蔗糖-PBS溶液中，直至准备进行连续切片。 
		注意：脑组织可保存最多2周，需每周更换蔗糖溶液，以避免潜在污染物生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如前所述19，使用冰冻切片机或恒冷切片机对植入区域进行脑组织连续切片，厚度为40 µm。</li>
	<li>将切片依次贴附于市售的防脱载玻片上（或参见20自制方法）。室温干燥，至少过夜。</li>
	<li>按照先前描述的方法20，用焦油紫染色液染色切片，脱水透明后封片。</li>
	<li>使用明场显微镜对切片成像，以确认传感器的解剖学定位。</li>
</ol>
4. 行为编码
<ol>
	<li>使用免费的商用可下载软件（见材料表）以慢动作观看并标注视频，以精确地将行为编码与安培信号在时间上同步。 
	注意：若要在分析中使用 MATLAB 代码（见下文），需标注每种雌性和雄性行为的开始和结束时间点。
	<ol>
		<li>当雌性开始背部背屈并向上翘起尾巴时，在该帧标注startLordosis；当雌性终止该姿势时标注endLordosis，这种情况通常发生在雌性重新调整其在测试箱中的位置时。</li>
		<li>当雌性处于脊柱前屈姿势，且雄性将其吻部移向雌性肛殖区域，可能发生对该区域的嗅闻、舔舐或轻触行为时，标注startAI；当雄性将其吻部从雌性肛殖区域附近移开时，标注endAI。</li>
		<li>当雄性靠近雌性并将其前爪置于雌性身上呈骑跨姿势时，标注startMount，无论骑跨尝试的方向如何（例如，侧面、臀部）。</li>
		<li>当骑跨的雄性成功推进使其阴茎进入雌性阴道时，标注startIntromission。 
		注意：插入行为在行为学上可与插入前的骑跨推进动作相区分，因为此时雄性明显将上肢向身体方向拉回，骨盆前推，并将尾巴向上卷曲，表明已发生插入（见图4C）。
		<ol>
			<li>如适用，标注ejaculation。 
			注意：在一次交配过程结束时，伴随成功的插入行为，雄性会发生射精。尽管无法直接观察到实际的精液排放，但雄性仓鼠在插入过程中会出现特有的后肢踏车样运动21，因此可在观察到该足部动作时标注射精事件。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>当雄性收回其前两只爪子，从而与雌性完全脱离接触时，在该帧同时标注endIntromission和endMount。由于常常难以清晰观察到其退出过程，为确保不同交配过程间编码的一致性和可靠性，应将这两个行为同时编码。 
		注意：一次交配过程要么以成功射精结束，要么是在雌性在至少一次骑跨后中断脊柱前屈姿势时终止。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 示例数据分析
注意：分别采用固定电位碳纤维和酶促记录方法，可实现对多巴胺和谷氨酸电化学释放的紧张性与时相性模式的测量。本实验室使用一套免费的商用采集系统和软件，以记录信号并将其从模拟信号转换为数字信号（偏压 0.600 V，采样率 = 1 Hz）。
<ol>
	<li>示例数据分析流程说明
	<ol>
		<li>尽管可以使用其他程序，但需使用 MATLAB 对记录的电化学信号中的张力性变化和时相性（瞬时）变化进行定量分析。
		<ol>
			<li>对于所呈现的数据，使用50点移动平均滤波器计算紧张性信号。通过从原始数据中减去紧张性信号，计算得到仅包含时相性成分的归一化信号表示。在识别时相性峰时，存在多种算法选择（例如，将信号中超过均值1个标准差以上的峰标记为变化。</li>
			<li>确定这些峰的位置， 即，使用 MATLAB 函数从归一化信号中提取局部极大值 峰检测器 将最小峰值幅度设置为信号的均方根值。利用归一化信号中检测到的峰值位置，提取每个峰值的幅度。能够检测峰值有助于识别可能与所研究神经化学物质的相对峰值同时发生或驱动该峰值的任何时间锁定行为。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据行为标注对处理后的数据进行分割（参见步骤3）；采用t检验 t采用t检验评估交配前求偶期僵直与交配期僵直期间张力性神经递质水平、瞬时事件发生频率及瞬时事件振幅的差异。为测量电化学释放张力性模式的变化，采集交配行为期间发生的数据点 脊柱前凸 交配行为开始前的直接位置（即，交配前弓背行为）与交配行为过程中的数据点采用t检验进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于所述数据分析流程的原始数据准备 
	注意：如前所述，尽管其他程序或分析方法可能同样可行，但为了使用上述描述的 MATLAB 代码，原始数据必须按以下方式准备：
	<ol>
		<li>导出注释和电压文件。为此，在“文件”选项卡下，选择“导出”功能，并选择“注释”选项卡以保存注释。在“文件”选项卡下，选择“导出”功能，并选择 &#34;TSV”选项卡，将电压测量值保存为扩展名为TSV的文件。</li>
		<li>使用电子表格程序打开每个文件，并另存为“xls/xlsx”格式，以确保文件与 MATLAB 兼容。 
		注意：对于“注释”文件，还需在导出后通过电子表格程序手动添加额外的注释，以指定相应的参数 开始 和 结束 交配前求偶行为中的脊柱前凸（标注为 PreMBlordosis）以及交配过程的时间点，以便如步骤5.1.2中所述直接比较这些时间点。</li>
		<li>标记交配前弓背行为的起始点（开始前凸测量) 与屈身行为开始的同时（开始屈背反应）还包含一个 安装 行为，以及在雌性保持脊柱前凸姿势时开始新一轮交配行为的时刻。</li>
		<li>标记交配前弓背行为的结束时刻endPreMBlordosis）当第一个 安装 开始。</li>
		<li>标注一次交配行为的开始开始MB) 与终末期前运动期背屈（endPreMBlordosis）同时发生，这标志着一次交配行为的开始。</li>
		<li>标记一次交配行为的结束（endMB），该结束点为以下两种情况之一：交配行为的终点，或 安装 包含一个 射精 （参见步骤 4.1.4.1），或在雌性终止脊柱前凸姿势后（终末期弓背反应).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管该技术相对简单直接，但在使用过程中仍可能出现一些问题。首先，探针的立体定位放置必须精确：与微透析技术能够采集探针周围较广范围的细胞外环境样本不同，该技术仅能检测直接接触到探针的神经递质。其次，在使用碳纤维记录探针时，由于纤维直径较小，容易发生断裂，因此探针插入时必须格外小心。对于谷氨酸生物传感器而言，若未在保证有效的3周时间内使用，可能发生酶活性降解。幸运的是，上述所有问题均可通过适当的谨慎操作和细致注意加以解决并完全避免。
在固定电位碳纤维记录的特异性方面可能存在一个潜在的问题。由于多巴胺的施加电位与其他单胺类物质（如去甲肾上腺素）的电位重叠，如果在同时释放这两种神经递质的脑区进行记录，则这种化学特异性不足的情况可能会限制对结果的解释。但在伏隔核（NAc）中，这一问题并不严重，因为多巴胺是该区域主要的儿茶酚胺类神经递质24。由于NAc中约98%的细胞为中等棘状神经元，这些细胞对多巴胺能神经传递有反应24，因此信号更倾向于检测多巴胺，从而有利于采用这种更即用型的技术方法。
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在清醒活动的动物体内测量神经递质释放的能力，使研究人员能够将特定行为与神经递质传递在空间和时间上的动态模式联系起来——这是实时研究自然行为和操作性行为背后机制与神经环路的有力工具。传统上，微透析技术被用于测量脑内细胞外环境中具有电化学活性和非活性的物质1。该技术通过微透析探针，以持续流动的方式灌注一种离子组成与细胞外液相似的水溶液，探针由一根细小的套管构成，其尖端为一段半透性的中空纤维膜2。探针植入脑内后，感兴趣的神经递质或其他分析物可通过被动扩散穿过半透膜，随后在设定时间点被收集，并利用高效液相色谱法（HPLC）进行后续分析。HPLC 是一种常用的分析化学技术，可用于分离、鉴定和定量复杂混合物中的各组分3。
尽管微透析是一种灵敏的技术，几乎可用于测量任何感兴趣的分析物，但其时间分辨率较低，最高采样速率仅为数分钟至数十分钟量级1,2。快速扫描循环伏安法（FSCV）的发明弥补了这一不足，该技术依赖于电活性物质的氧化还原电位，能够揭示细胞外液中目标分析物近乎瞬时的浓度变化。简而言之（详见Robinson et al.4 的综述），通过电极在短时间内以三角波形式快速升高和降低电压4。当电压处于适当范围时，目标化合物会反复发生氧化和还原反应。这种氧化与还原过程导致电子移动，从而产生微弱的交变电流。扫描速率在亚秒级进行，化合物的氧化与还原反应在微秒内完成。通过从测得的电流中减去探针产生的背景电流，可以获得每种化合物特有的电压-电流曲线。由于电压振荡的时间尺度已知，这些数据可用于计算电流随时间变化的曲线。因此，只要已知每次氧化和还原反应中转移的电子数，即可确定该化合物的相对浓度4。
这种化学特异性和高时间分辨率使FSCV成为检测化学浓度动态变化的有力技术 体内然而，尽管具有这些多种优势，该技术需要丰富的专业技术知识以及昂贵的设备和装置。此外，非电活性神经递质（例如，谷氨酸）无法通过该技术进行检测。幸运的是，电化学领域的技术进步5，以及这些发明的商业化，引入了一种相对简单的方法，可在不牺牲时间精度的前提下，在清醒活动动物中检测非电活性神经递质——该技术称为酶法生物传感器技术。该技术利用酶促反应将目标非电活性神经递质转化为两种底物，其中一种为具有电活性的过氧化氢，可通过施加电位产生安培氧化电流进行检测5. 可商业获取的生物传感器探针（参见 图1通过竞争性降低内源性干扰物的贡献，选择性地检测目标分析物。以谷氨酸为例，通过将抗坏血酸（AA）氧化酶共定位在传感器的活性酶表面，可竞争性减少常见干扰物抗坏血酸对检测电流的贡献，将AA转化为无电化学活性的脱氢抗坏血酸和水。此外，在酶层下方的带负电荷的Nafion聚合物层可排除内源性阴离子化合物。
这种相同的生物传感器实验装置可以像FSCV一样检测电活性神经递质，但其采用的是固定电位记录6。与FSCV中施加的振荡电压不同，在固定电位记录中，电压保持在目标分析物的氧化还原电位。尽管由于多种神经递质可能具有相同的氧化还原电位，该方法在化学选择性上不如FSCV，但在主要以某一种神经递质为主的脑区，该方法操作简便的优势超过了化学特异性不足的缺点。
能够近乎实时地测量电活性和非电活性神经递质的释放，并将其与特定行为事件相关联，为研究多种神经递质的协同释放提供了机会。本文详细描述了该系统在清醒活动的仓鼠中，用于探究多巴胺和谷氨酸神经传递对自然奖赏反应的应用。本论文的目的是详述在雌性仓鼠性行为过程中测量此类神经递质释放的方法，以证明该技术在研究其他行为及实验范式中的可行性。
仓鼠是进行电化学记录的理想模型 
传统上，大鼠和小鼠模型被用于性行为研究。这些啮齿类动物具有动态的交配序列，其中包括多种雌性求偶行为，例如跳跃、快速移动和耳朵抖动，以引诱雄性追逐并最终骑跨雌性7。雄性骑跨（无论是否伴有阴道插入）仅持续数秒，在此期间雌性呈现其特有的性行为姿势（称为lordosis），该姿势同样仅维持数秒，随后便恢复活跃的求偶行为。这种行为模式表现为高度活动与短暂静止交替出现，给在行为动物中测量神经递质释放带来了困难。首先，安培法记录中可能出现与神经活动无关的运动伪迹。其次，运动本身会引发特定脑区中某些神经递质的释放。例如，已有研究发现背侧和腹侧纹状体中的多巴胺释放与运动活动相关8,9，这一发现也成为利用微透析技术在给予精神兴奋剂后测量多巴胺水平的基础10。由于大多数啮齿类动物典型的雌性求偶行为涉及高强度的运动活动，并且在10分钟性行为测试中占据主要时段，因此很难将神经递质释放的变化归因于那些总持续时间仅几分钟的明确性行为成分。
为了分析雌性性行为的神经化学特征，本实验室选择了一种在性行为过程中伴随极少运动活动的物种。叙利亚仓鼠（Syrian hamsters）的交配序列Mesocricetus auratus由于不会表现出大鼠和小鼠中常见的诱发性行为，因此非常适合用于神经化学记录11因此，雌性仓鼠在10分钟的测试过程中会进入并保持超过9分钟的性接受姿态（lordosis posture）。12由于雌性个体缺乏额外的运动行为， 体内 可获得与雄性个体性互动过程中相关组分的电化学记录。
仓鼠的交配行为 
将雄性刺激动物引入测试箱后，雄性会首先对雌性进行肛门生殖区探查（AI），然后尝试骑跨雌性（图2A）。雄性要成功骑跨，雌性必须采取一种称为“脊柱前凸”的接受性性姿势，即弓起背部并侧偏尾巴，以便骑跨的雄性能将阴茎插入其阴道。雄性用双前爪抓住雌性的后躯（图2B），开始往复抽动，试图实现阴茎插入（图2C）。在最终达到射精之前，雄性会多次骑跨雌性（无插入）并完成若干次插入动作。这一系列导致射精的骑跨与插入行为称为一次&#34;交配周期&#34;。雄性在一次交配过程中通常会经历多个交配周期。

<table><tbody><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Oak Pharmaceuticals Inc.</td><td>76478-501-50</td><td>注射用戊巴比妥钠，USP。本实验室使用剂量为每100克体重8.5 mg，腹腔注射。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>洛昔康镇痛剂&amp;nbsp;</td><td>Norbrook Laboratories&amp;nbsp;</td><td>6451603670</td><td>非甾体抗炎镇痛药，用于术后疼痛控制。通用名：美洛昔康。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>恩诺氟沙星抗生素&amp;nbsp;</td><td>Norbrook Laboratories&amp;nbsp;</td><td>5552915411</td><td>氟喹诺酮类抗生素，用于预防术后感染。通用名：恩诺氟沙星。</td></tr><tr><td>Beuthanasia-D&amp;nbsp;</td><td>默克动物保健</td><td>00061047305</td><td>戊巴比妥钠、苯妥英钠安乐死试剂。</td></tr><tr><td>骨螺钉</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>8111-16</td><td>1/8&quot; 骨螺钉（每包16个），用于将颅骨帽固定于颅骨。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牙科丙烯酸树脂（Bosworth Duz-All）</td><td>Bosworth&amp;nbsp;</td><td>166261C&amp;nbsp;</td><td>自凝牙科丙烯酸树脂，用于构建颅骨帽，以固定套管和头部固定装置至颅骨。</td></tr><tr><td>硬件生物传感器系统套装&amp;nbsp;</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>8400-K2</td><td>Pinnacle为首次使用本公司的有线生物传感器系统的大鼠实验用户提供完整的硬件套件。套件包括换向器、前置放大器以及数据调理与采集系统。</td></tr><tr><td>基础视频计算机套装</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>9000-K1</td><td>基础计算机套装包含一台预配置计算机，具备充足的硬盘存储空间、高清显示器、键盘和鼠标、不间断电源以及所有必要连接线缆。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Video EQ700 EverFocus 摄像头&amp;nbsp;套装</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>&amp;nbsp;9000-K10&amp;nbsp;</td><td>EQ700 具备夜视功能的盒式摄像头，配有独立红外光源，作为Pinnacle视频计算机套装的一部分提供。圆顶摄像头（9000-K9）和高清摄像头（9000-K11）也可选配。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sirenia 采集软件</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>免费——可从pinnaclet.com下载</td><td>Sirenia&amp;nbsp;采集软件提供统一平台，用于记录来自任何Pinnacle硬件系统的数据。该软件支持所有数据流的同步、用户可配置设置、数据整合以及多种导出选项。此外，软件还包含用于生物传感器记录的基本回放与分析模块。Sirenia&amp;nbsp;提供免费的一体化软件，非常适合数据采集与回放。</td></tr><tr><td>大鼠有线&amp;nbsp;体外&amp;nbsp;校准套件</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7000-K2-T-BAS&amp;nbsp;</td><td>为将生物传感器测得的电流变化与分析物实际浓度变化相关联，必须在将传感器植入动物体内之前对其进行校准。该过程还可验证传感器的完整性与选择性。&amp;nbsp;校准套件包括20 mL夹套烧杯（#7058）、1/2&quot; × 1/8&quot; 磁力搅拌子（#7059）、直角夹（#7056）、双爪单调节夹（#7055）、4通道校准前置放大器（#7053）以及校准支架（#7051）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>搅拌器&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>6795-410D</td><td>Corning 数字搅拌器，5&quot; × 7&quot;，120 VAC，用于在&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;校准谷氨酸生物传感器时驱动夹套烧杯内的磁力搅拌子。</td></tr><tr><td>具备闭环循环功能的水浴锅</td><td>PolyScience</td><td>8006A11B</td><td>PolyScience 8006A11B 6L 标准数字加热循环水浴锅，120VAC，通过塑料管路将夹套烧杯加热至生理温度。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带BASi大鼠套管的碳纤维传感器</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7002-CFS</td><td>用于记录多巴胺神经传递的碳纤维电极。</td></tr><tr><td>Ag/AgCl参比电极</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7065</td><td>碳纤维记录所必需。</td></tr><tr><td>谷氨酸生物传感器&amp;nbsp;</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7001&amp;nbsp;</td><td>用于记录谷氨酸能神经传递的酶法生物传感器探针。</td></tr><tr><td>BASi导向套管</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7030&amp;nbsp;</td><td>植入目标脑区的导向套管，用于引导探针。</td></tr><tr><td>BASi大鼠用塑料头帽&amp;nbsp;</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7011&amp;nbsp;</td><td>头部固定装置用于稳定探针并连接至恒电位仪。</td></tr></tbody></table>

测量雌性叙利亚仓鼠在自然奖赏行为期间细胞外神经递质的体内变化

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

在快速时间尺度上测量神经递质释放的能力，使得神经传递模式能够与特定行为或实验干预相关联，这对于揭示潜在的机制和神经环路具有重要意义。尽管脑内微透析技术已使用数十年，可用于测量几乎任何感兴趣的分析物，但其时间分辨率有限。相比之下，快速扫描循环伏安法具有高时间精度和极高灵敏度；然而，由于该技术操作难度较高，且依赖于目标分析物的电化学活性，因此无法检测非电活性物质（例如，神经递质谷氨酸）。本文详细描述了一种即用型系统，该系统结合了固定电位安培法与酶法生物传感技术，可实现对电活性和非电活性神经递质的高时间精度测量。这两种强大技术的结合，使得张力性和时相性神经传递的测量变得更加简便，并支持多种神经递质的同时记录。本论文旨在展示在雌性仓鼠中，利用自然奖赏行为（即，性行为）在体测量多巴胺和谷氨酸神经传递的过程，最终目标是证明该检测方法在研究其他行为和实验范式中的技术可行性。

利用上述电化学与行为编码方法，本实验室已开始表征在性行为的in vivo记录过程中，多巴胺和谷氨酸的紧张性与时相性波动。由于该方法具有时间上的精确性，我们能够更准确地刻画性行为期间的神经递质传递，并将释放模式的特定变化归因于交配过程中的紧张性变化，以及雌性在接受雄性爬跨所实施的单个交配行为（e.g.，插入、射精）时出现的相应瞬时波动。
具体而言，我们采用该方法重点测量不同动物伏隔核（NAc）中多巴胺和谷氨酸的释放模式。NAc 是参与奖赏处理的关键脑区22，也被认为是调控性行为奖赏特征的核心区域之一23。
我们观察到，在性行为过程中，雌性在交配阶段会出现伏隔核（NAc）核心区多巴胺能水平的紧张性升高（<s...

本文详细介绍了利用碳纤维电极和酶法生物传感器技术进行固定电位安培记录，以在雌性仓鼠自然奖赏行为期间高时间分辨率地测量多巴胺和谷氨酸的释放。

快速时间尺度上测量神经递质释放的能力，使得神经传递模式能够与特定行为或……

本实验方案的总体目标是测量清醒且处于行为状态的动物体内的神经递质释放。尽管本视频展示了该技术在行为神经科学中的应用，即能够表征特定行为事件相关的特定神经递质释放，但该技术也可应用于其他多种神经科学子领域，例如药物注射研究。该技术的主要优势在于其即用式特性，可实现对活体内神经递质近乎实时释放的检测。在引入雄性动物前4小时，皮下注射500微克黄体酮溶于0.1毫升棉籽油中，以诱导性接受行为。务必在动物每日周期的暗期开始时进行测试，因为啮齿类动物的社会行为在白光和红光测试条件下可能发生改变。在测试当天，使用20毫升玻璃离心管新鲜配制校准溶液。对于分析物溶液，将7.4毫克L-谷氨酸溶解于10毫升超纯水中，通过轻轻倒置试管混匀。然后，将176.1毫克抗坏血酸（AA）溶解于10毫升超纯水中，制备干扰溶液。设置校准系统时，将磁力搅拌器置于基础实验室铁架台的底座上。将一个20毫升夹套烧杯放置在磁力搅拌器上，并使用中型双爪夹固定。将夹套烧杯连接至循环水浴，以将缓冲液加热至37摄氏度。向夹套烧杯中加入一个磁力搅拌子以及20毫升100毫摩尔磷酸盐缓冲液（PBS）。接下来，将传感器校准支架置于夹套烧杯上方，并在其上放置四通道校准前置放大器，使用直角夹固定。然后将前置放大器连接至数据调理与采集装置，以记录校准数据。在正式实验记录前，通过将探头放入夹套烧杯上方的校准支架中，使传感腔体及部分氯化银参比导线浸入缓冲溶液，检测每种酶生物传感器对谷氨酸的灵敏度。在计算机界面上使用免费下载的采集软件启动新的记录。然后，将每个待测试的传感器连接到四通道校准前置放大器的端口上。让传感器达到稳定的基线水平。当传感器达到稳定基线后，开始加入分析物。使用校准支架上的孔将移液枪尖插入缓冲液中，然后利用记录软件中的快捷键注释工具标记每次注射操作的时间点。接下来，通过移液将40微升分析物溶液加入缓冲溶液中，制备10微摩尔的谷氨酸注射液。每次添加后等待传感器信号稳定。然后，先加入三次分析物溶液，再加入一次干扰物抗坏血酸（AA）溶液。用动物饲养笼中的垫料铺设测试室。从导向套管中取出封闭的堵塞物，将碳纤维电极或酶促探针插入导向套管内。将传感器连接至记录系统。然后通过将针状附件拧到头帽上以稳定传感器连接。接着将动物放入测试舱内。在软件程序中开始记录视频以及时间锁定的安培信号。在进行实验测试前，让传感器在脑内平衡一段时间。然后，将刺激雄性动物引入测试腔室。当刺激雄性动物首次发生带有阴茎插入的骑跨行为后，根据实验目的继续记录10至30分钟。最后，在完成行为学测试后，断开雌性传感器的连接。将两只仓鼠以及垫料从测试箱中取出，使用70%乙醇清洁测试箱。随后开始回放视频并进行标注，可使用免费的商业下载软件，以慢速播放的方式，精确地将行为编码与安培信号在时间上同步对应。当雌性开始背部背屈并将其尾巴向上翘起时，在该帧标注“开始隆背”；当雌性终止此姿势时标注“结束隆背”，这种情况通常发生在雌性在测试箱内重新调整位置时。随后，当雌性处于隆背姿势且雄性将其吻部朝向雌性的肛生殖区，可能出现对该区域的嗅闻、舔舐或轻触行为时，标注“开始交配尝试”。当雄性个体将其吻部从雌性个体肛生殖区附近移开时，标注“Annotate End AI”。接着，当雄性个体靠近雌性并以前肢搭在雌性身上呈骑跨姿势时，无论骑跨尝试的方向如何，均标注“Start Mount”。同样，当骑跨中的雄性通过有效抽动使其阴茎成功插入雌性阴道时，标注“Start Intromission”。在适用情况下，标注射精行为，该行为可通过雄性后肢的踩踏动作来识别。最后，当雄性移开前两只爪子、从而与雌性完全失去接触时，在同一帧画面中同时标注插入结束和骑跨结束。由于雄性撤出动作常难以清晰观察，为确保交配过程分析的一致性和可靠性，应将这两种行为同时编码。在文件选项卡下，选择导出功能，并选择TSV选项，将电压测量数据保存为TSV扩展名文件。使用电子表格程序打开每个文件，并另存为XLS/XLSX格式。最后，手动添加注释：在雌性开始出现交配前弓背行为（lordosis）且同时伴随骑跨行为（mount behavior）时，标记弓背行为的起始点；若雌性持续保持弓背姿势并进入新的交配阶段，也需在新交配阶段开始时添加注释。在交配过程中，雄性动物插入或间歇时，伏隔核内的多巴胺能信号会出现短暂激活。类似模式在其他动物中也观察到，表现为谷氨酸释放的快速瞬变，这种瞬变与交配过程中背侧伏隔核核心区域每次间歇相对应。掌握该技术后，除去准备性的立体定位手术，整个过程可在一天内完成。在实施该操作时，重要的是确保每个传感器均正常工作。尽管本视频展示的是单探针记录，但该方法可扩展至同步双探针记录。但这增加了一层不可忽视的复杂性。本视频在光照条件下演示，以便于观察。然而，我们的行为学实验是在黑暗条件下进行的，该参数可根据具体的实验需求进行调整。采用此方法后，可进一步对脑切片进行组织学分析，以识别并确认传感器的精确放置位置。此外，还可利用编码后的行为学数据，针对任何感兴趣参数进行进一步的数据分析。该技术建立后，为神经科学领域的研究人员探索神经递质释放（包括谷氨酸等非电活性神经递质）开辟了道路，能够在清醒且自由活动的动物体内实现近乎实时的检测。观看本视频后，您应能够充分掌握如何校准谷氨酸能探针、植入探针、开展行为学实验以测量神经递质释放随行为不同组分的变化，并对所获数据进行编码以供后续分析。请务必注意，在操作活体动物时，应关注动物的舒适度和整体福利，以确保获得最佳实验结果以及保障动物的

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