雌性叙利亚仓鼠自然奖赏行为中细胞外神经递质的测量体内变化
September 12th, 2017
本文详细介绍了使用碳纤电极和酶生物传感器技术的固定电位安培记录, 以测量在自然奖励行为中的高时间分辨率的多巴胺和谷氨酸的释放。雌性仓鼠
该实验程序的总体目标是测量清醒行为动物的神经递质释放。尽管该视频演示了在行为神经科学中的应用，但该技术能够表征与特定行为事件相关的特定神经递质释放，该技术可用于各种其他神经科学子学科，例如药物注射。该技术的主要优点是它具有交钥匙性质，可以近乎实时地测量体内神经递质的释放。
首先在引入男性前 4 小时皮下注射 500 微克黄体酮在 0.1 毫升棉籽油中，以诱导性接受性。请务必在每只动物日常周期的黑暗阶段开始时对其进行测试，因为在白光和红光测试条件下，啮齿动物的社交行为会发生变化。在测试当天，在 20 毫升玻璃离心管中使校准溶液新鲜。
对于分析物溶液，轻轻倒置试管，将 7.4 毫克 L-谷氨酸溶解到 10 毫升超纯水中。然后，通过将 176.1 毫克 AA 溶解在 10 毫升超纯水中来制备干扰溶液。通过将磁力搅拌器放在基本实验室环架的底座上来设置校准。
将一个 20 毫升带夹套的烧杯放在磁力搅拌器顶部，并使用中等大小的双叉夹钳夹住到位。将夹套烧杯连接到循环水浴，将缓冲溶液加热至 37 摄氏度。将磁力搅拌棒和 20 毫升 100 毫摩尔磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 加入夹套烧杯中。
接下来，将传感器校准支架放在带夹套的烧杯顶部，并在顶部设置一个四通道校准前置放大器，使用直角夹将其固定到位。然后，将前置放大器连接到数据调节和采集设备以记录校准数据。在实验记录之前，通过将探针放入校准支架中，在带夹套的烧杯顶部，将传感腔和部分氯化银参考线浸入缓冲溶液中，测试每个酶生物传感器对谷氨酸的灵敏度。
使用可免费下载的采集软件在计算机界面上开始新的录制。然后，将每个被测传感器连接到四通道校准前置放大器上的端口。让传感器达到稳定的基线。
当电极达到稳定的基线时，开始添加分析物进样。使用校准支架上的孔将移液器吸头引入缓冲液中。然后，使用录制软件中的快捷键注释工具对注射时间进行注释。
接下来，将 40 微升分析物溶液移液到缓冲溶液中，进行 10 微摩尔的谷氨酸注射。等待传感器在两次添加之间稳定下来。然后，加入 3 次分析物溶液进样，然后从干扰 AA 溶液中加入 1 次进样。
在测试室中铺上从动物家笼中取出的垫料。从导向套管上取下封闭性阻滞剂，并将碳纤维电极或酶探针插入导向轴。将传感器连接到记录系统。
然后通过将销附件拧到头架上来稳定传感器连接。然后，将动物放入测试室中。开始在软件程序中录制视频和时间锁定的安培信号。
在实验测试之前，让传感器在大脑中平衡。然后，将刺激雄性引入测试室。在刺激男性插入的第一次安装后，根据实验目标继续记录 10 到 30 分钟。
最后，在行为测试后，断开女性传感器的连接。从测试室中取出两只仓鼠以及床上用品，以使用 70% 乙醇清洁腔室。首先观看和注释视频，使用免费的商业下载软件，以慢动作精确编码锁定到安培信号的时间的行为。
注释 当雌性开始背部背屈并将尾巴向上偏转时，在框架中启动 Start Foreosis。当女性终止这种姿势时注释 End Riepsi，这通常发生在女性重新调整到测试室中的另一个位置时。然后，当雌性处于前凸姿势并且雄性将鼻子移向雌性的肛门生殖器区域时，注释 Start AI 可能会在那里嗅探、舔舐或轻抚她的会阴区域。
当雄性从靠近雌性肛门生殖器区域的地方移开他的鼻子时，注释 End AI。接下来，当雄性以骑乘姿势接近并将前爪放在雌性身上时，无论骑乘尝试的方向如何，都要注释 Start Mount。同样，当成功时，注释 Start Intromission，使已安装的男性进入女性的阴道。
如果适用，注释 Ejaculate，这可以通过雄性后脚的踩踏动作来表示。最后，当雄性移开前两只爪子时，在框架中同时注释 End Intromission 和 End Mount，因此与雌性没有接触。由于经常无法想象他的退出，因此同时对这两种行为进行编码，以实现交配比赛的一致性和可靠性。
在文件选项卡下，选择 Export 函数，然后选择 TSV 选项卡，将电压测量值保存为 TSV 扩展文件。使用电子表格程序打开每个文件并另存为 XLS/XLSX。最后，在前凸行为开始的同时，手动添加前凸开始的注释，其中还包括坐骑行为，如果女性保持前凸姿势，则在新交配开始时也添加注释。
在交配比赛中，雄性在阴道插入或间歇期间出现核内分泌物中的多巴胺能瞬变。在其他动物中观察到谷氨酸释放方面也有类似的模式。具有快速瞬变，对应于交配期间伏隔核核心的单个间歇。
一旦掌握，这项技术，不包括准备性立体手术，可以在一天内完成。在尝试此过程时，请务必确保每个传感器都正常工作。虽然本视频演示了单探头记录，但这种方法可以扩展到同时进行双记录。
但这增加了一层并非微不足道的复杂性。该视频在光线条件下进行演示，以便于查看。然而，我们在黑暗条件下进行行为实验，并且这个参数可以根据特定的实验需要而改变。
按照此程序，可以执行其他方法，例如脑切片的后续组织学分析，以识别和确认确切的传感器位置。此外，可以使用编码的行为数据对感兴趣的任何参数进行进一步的数据分析。经过开发，这项技术为神经科学领域的研究人员探索神经递质释放铺平了道路，包括谷氨酸等非电活性神经递质在清醒行为动物中近乎实时地释放。
观看此视频后，您应该对如何校准谷氨酸能探针、植入探针、运行行为实验来测量神经递质释放到行为不同组成部分的变化，以及为这些数据编码以供后续分析有一个很好的了解。不要忘记，在与活体动物一起工作时，要注意它们的舒适度和整体健康状况，以确保您和动物的最佳结果。
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概述
本研究使用固定电位安培记录和酶生物传感器技术，调查了雌性仓鼠自然奖赏行为期间多巴胺和谷氨酸释放的测量。该技术能够在醒着的行为动物中实现高时间分辨率的神经递质动力学，为行为神经科学提供见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 行为神经科学
- 电生理学
背景
- 多巴胺和谷氨酸在奖赏机制中起着关键作用。
- 神经递质释放的测量可以增进对行为的理解。
- 高时间分辨率技术提高了实验精度。
研究目的
- 描述神经递质释放与特定行为事件的关系。
- 探索雌性仓鼠交配期间的行为反应。
- 展示酶生物传感器技术在醒着动物中的应用性。
使用的方法
- 技术包括使用碳纤维电极进行固定电位安培记录。
- 实验设置涉及在激素诱导的性接受性后监测雌性仓鼠的反应行为。
- 关键步骤包括谨慎处理光照并及时校准传感器系统。
- 行为观察与安培信号同步，以进行精确分析。
主要结果
- 该研究有效地详细描述了交配行为期间的神经递质释放，突出了时间动态。
- 关于交配相关的多巴胺暂时性的见解被显著报道。
- 行为注释提供了生理测量和观察到的行为之间的明确相关性。
结论
- 这项工作展示了一种可靠的方法来记录行为期间的神经递质动力学。
- 了解神经递质释放的时间增进了对生殖行为的洞察。
- 这些发现可能对行为神经科学的更广泛应用做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Measuring real-time neurotransmitter dynamics during natural behaviors enables mechanistic de-risking of target hypotheses in reward pathway research. This approach supports predictive confidence in lead identification by linking neurochemical changes to specific behavioral events. The technology facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation of CNS-modulating compounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating dopamine and glutamate transience with specific behavioral events like vaginal insertion.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of electroactive and nonelectroactive neurotransmitters in awake behaving models.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative, time-locked neurochemical readouts that clarify mechanism of action during reward-related behaviors.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biosensor systems for downstream screening by establishing calibration protocols for glutamate and dopamine detection.
- Operational Value: Delivers assay standardization and reproducibility through fixed-potential amperometry and enzymatic biosensing with temperature-controlled buffer systems.
- Scalability: Supports platform reuse across behavioral paradigms due to turnkey sensor preparation and data acquisition workflow.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Demonstrates disease-relevant system utility by measuring neurotransmitter release during naturally rewarding sexual behavior in female hamsters.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating neurochemical transience with specific phases of mating behavior (e.g., intromission, ejaculation).
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target engagement by providing direct, real-time measurement of neurotransmitter dynamics in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by delivering temporally precise neurochemical data linked to behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring dopamine and glutamate release during specific behavioral epochs in the nucleus accumbens.
- Screening: Ensures assay readiness through stable baseline establishment and analyte injection validation prior to behavioral recording.
- Analytics: Generates quantitative, time-locked measurements that enable comparison of neurochemical responses across behavioral conditions and experimental groups.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work by demonstrating utility in a naturally rewarding behavioral paradigm relevant to motivational and reward circuitry.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for assessing compound effects on neurotransmitter release across multiple behavioral models and drug administration studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct measurement of neurotransmitter transience.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via calibrated enzymatic biosensors and fixed-potential amperometry with temperature control.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering behavioral-time-locked neurochemical data that clarifies target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking neurochemical dynamics to specific behavioral outcomes, reducing late-stage biological risk in CNS drug development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery, sensor calibration, and behavioral neuroscience methodologies.
- Needs instrumentation including data conditioning acquisition devices, circulating water baths for 37°C buffer maintenance, and four-channel preamplifiers.
- Demands cross-team standardization in sensor preparation, behavioral annotation protocols, and data export procedures (TSV to XLS/XLSX).
- Involves adaptation considerations across model systems, including light/dark cycle testing conditions and hormone priming protocols.
- Includes practical limitations such as sensor stability duration, need for functional validation pre-recording, and complexity increase with dual-probe simultaneous recording.
