测量雌性叙利亚仓鼠在自然奖赏行为期间细胞外神经递质的体内变化

本实验方案的总体目标是测量清醒且处于行为状态的动物体内的神经递质释放。尽管本视频展示了该技术在行为神经科学中的应用，即能够表征特定行为事件相关的特定神经递质释放，但该技术也可应用于其他多种神经科学子领域，例如药物注射研究。该技术的主要优势在于其即用式特性，可实现对活体内神经递质近乎实时释放的检测。

在引入雄性动物前4小时，皮下注射500微克黄体酮溶于0.1毫升棉籽油中，以诱导性接受行为。务必在动物每日周期的暗期开始时进行测试，因为啮齿类动物的社会行为在白光和红光测试条件下可能发生改变。在测试当天，使用20毫升玻璃离心管新鲜配制校准溶液。

对于分析物溶液，将7.4毫克L-谷氨酸溶解于10毫升超纯水中，通过轻轻倒置试管混匀。然后，将176.1毫克抗坏血酸（AA）溶解于10毫升超纯水中，制备干扰溶液。设置校准系统时，将磁力搅拌器置于基础实验室铁架台的底座上。

将一个20毫升夹套烧杯放置在磁力搅拌器上，并使用中型双爪夹固定。将夹套烧杯连接至循环水浴，以将缓冲液加热至37摄氏度。向夹套烧杯中加入一个磁力搅拌子以及20毫升100毫摩尔磷酸盐缓冲液（PBS）。

接下来，将传感器校准支架置于夹套烧杯上方，并在其上放置四通道校准前置放大器，使用直角夹固定。然后将前置放大器连接至数据调理与采集装置，以记录校准数据。在正式实验记录前，通过将探头放入夹套烧杯上方的校准支架中，使传感腔体及部分氯化银参比导线浸入缓冲溶液，检测每种酶生物传感器对谷氨酸的灵敏度。

在计算机界面上使用免费下载的采集软件启动新的记录。然后，将每个待测试的传感器连接到四通道校准前置放大器的端口上。让传感器达到稳定的基线水平。

当传感器达到稳定基线后，开始加入分析物。使用校准支架上的孔将移液枪尖插入缓冲液中，然后利用记录软件中的快捷键注释工具标记每次注射操作的时间点。

接下来，通过移液将40微升分析物溶液加入缓冲溶液中，制备10微摩尔的谷氨酸注射液。每次添加后等待传感器信号稳定。然后，先加入三次分析物溶液，再加入一次干扰物抗坏血酸（AA）溶液。

用动物饲养笼中的垫料铺设测试室。从导向套管中取出封闭的堵塞物，将碳纤维电极或酶促探针插入导向套管内。将传感器连接至记录系统。

然后通过将针状附件拧到头帽上以稳定传感器连接。接着将动物放入测试舱内。在软件程序中开始记录视频以及时间锁定的安培信号。

在进行实验测试前，让传感器在脑内平衡一段时间。然后，将刺激雄性动物引入测试腔室。当刺激雄性动物首次发生带有阴茎插入的骑跨行为后，根据实验目的继续记录10至30分钟。

最后，在完成行为学测试后，断开雌性传感器的连接。将两只仓鼠以及垫料从测试箱中取出，使用70%乙醇清洁测试箱。随后开始回放视频并进行标注，可使用免费的商业下载软件，以慢速播放的方式，精确地将行为编码与安培信号在时间上同步对应。

当雌性开始背部背屈并将其尾巴向上翘起时，在该帧标注“开始隆背”；当雌性终止此姿势时标注“结束隆背”，这种情况通常发生在雌性在测试箱内重新调整位置时。随后，当雌性处于隆背姿势且雄性将其吻部朝向雌性的肛生殖区，可能出现对该区域的嗅闻、舔舐或轻触行为时，标注“开始交配尝试”。

当雄性个体将其吻部从雌性个体肛生殖区附近移开时，标注“Annotate End AI”。接着，当雄性个体靠近雌性并以前肢搭在雌性身上呈骑跨姿势时，无论骑跨尝试的方向如何，均标注“Start Mount”。同样，当骑跨中的雄性通过有效抽动使其阴茎成功插入雌性阴道时，标注“Start Intromission”。

在适用情况下，标注射精行为，该行为可通过雄性后肢的踩踏动作来识别。最后，当雄性移开前两只爪子、从而与雌性完全失去接触时，在同一帧画面中同时标注插入结束和骑跨结束。由于雄性撤出动作常难以清晰观察，为确保交配过程分析的一致性和可靠性，应将这两种行为同时编码。

在文件选项卡下，选择导出功能，并选择TSV选项，将电压测量数据保存为TSV扩展名文件。使用电子表格程序打开每个文件，并另存为XLS/XLSX格式。最后，手动添加注释：在雌性开始出现交配前弓背行为（lordosis）且同时伴随骑跨行为（mount behavior）时，标记弓背行为的起始点；若雌性持续保持弓背姿势并进入新的交配阶段，也需在新交配阶段开始时添加注释。

在交配过程中，雄性动物插入或间歇时，伏隔核内的多巴胺能信号会出现短暂激活。类似模式在其他动物中也观察到，表现为谷氨酸释放的快速瞬变，这种瞬变与交配过程中背侧伏隔核核心区域每次间歇相对应。

掌握该技术后，除去准备性的立体定位手术，整个过程可在一天内完成。在实施该操作时，重要的是确保每个传感器均正常工作。尽管本视频展示的是单探针记录，但该方法可扩展至同步双探针记录。

但这增加了一层不可忽视的复杂性。本视频在光照条件下演示，以便于观察。然而，我们的行为学实验是在黑暗条件下进行的，该参数可根据具体的实验需求进行调整。

采用此方法后，可进一步对脑切片进行组织学分析，以识别并确认传感器的精确放置位置。此外，还可利用编码后的行为学数据，针对任何感兴趣参数进行进一步的数据分析。该技术建立后，为神经科学领域的研究人员探索神经递质释放（包括谷氨酸等非电活性神经递质）开辟了道路，能够在清醒且自由活动的动物体内实现近乎实时的检测。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何校准谷氨酸能探针、植入探针、开展行为学实验以测量神经递质释放随行为不同组分的变化，并对所获数据进行编码以供后续分析。请务必注意，在操作活体动物时，应关注动物的舒适度和整体福利，以确保获得最佳实验结果以及保障动物的