Name: 植物启动子分析: 菜豆根瘤特异启动子的鉴定与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学习利用发根农杆菌诱导菜豆毛状根并分析根瘤特异性启动子表达模式的方法。该方案可加速转化进程，为研究植物基因调控和共生固氮提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分得到了墨西哥国立自治大学学术人事总司（DGAPA/PAPIIT-UNAM）（项目编号：M.L. 获资助号 IN219916，M-K.A. 获资助号 IA205117）以及墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT，项目编号：240614，授予 M.L.）的支持。

1. P. Vulgaris NIN 启动子的鉴定、分离与克隆
<ol>
	<li>确定目标基因的启动子序列。目前有多种适用于植物的基因组数据库和分析工具，例如 Phytozome、Ensembl Plants、NCBI。 等等。 一种豆科植物启动子 P. vulgaris 本研究中使用了NIN（PvNIN；Phvul.009G115800）20.</li>
	<li>根据所使用的载体系统，设计用于Gateway或传统限制性内切酶克隆的寡核苷酸图1A). 
	注意：标准（25–35 bp）脱盐引物即可满足要求。建议使用位于启动子与基因之间的反向寡核苷酸序列。</li>
	<li>扩增新鲜分离的 PvNIN 启动子区域（或目的基因的启动子区域） P. vulgaris 使用特异性启动子引物组从基因组DNA进行扩增。采用高保真聚合酶，PCR反应条件如下：95 °C 预变性5 min；30个循环（95 °C 变性30 s，55 °C 退火30 s，72 °C 延伸1 min）；最后72 °C 延伸5 min。</li>
	<li>在7 x 10 cm的凝胶板上用1%琼脂糖凝胶于60 V电压下电泳分离扩增产物，并回收相应条带的扩增子（700 bp， 图1B）并根据制造商说明将其克隆至pENTR/D-TOPO载体中。</li>
	<li>将2 µL反应产物转入感受态细胞 大肠杆菌 根据制造商说明书制备细胞，并将150 µL转化混合物接种于添加50 mg/L卡那霉素（Kan50）的LB（Lysogeny Broth）培养基平板上。将接种后的细胞于37 °C培养过夜。</li>
	<li>挑取3-6个菌落，接种于含卡那霉素50 μg/mL的LB培养基中过夜培养。采用选定的方法提取质粒DNA，并使用载体特异性的M13引物通过PCR分析质粒。PCR反应体系包含：100 ng质粒DNA、0.3 pmol引物、10× PCR缓冲液、0.5 U Taq DNA聚合酶和10 mM dNTPs。</li>
	<li>使用以下PCR扩增条件：95 °C 预变性3 min；30个循环（95 °C 变性30 s，58 °C 退火30 s，72 °C 延伸75 s）；最后72 °C 延伸7 min。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。应确认正确插入的样品在1,024 bp处出现条带，而无插入片段的载体则在324 bp处出现条带。图1C).</li>
	<li>在入门载体（pENTR/D-TOPO-PvNIN）与目的载体pBGWFS7.0之间进行LR反应21 按照制造商说明使用商用酶混合物。</li>
	<li>将2 µL的LR反应产物转化至感受态细胞中 E. coli 使用标准技术按照制造商说明书进行细胞转化，并将150 µL转化混合物涂布于添加了100 mg/L壮观霉素（Spe100）的LB培养基平板上。将涂布的细胞在37 °C下培养过夜。</li>
	<li>挑取约5个菌落，于含Spe100的LB培养基中过夜培养。选用适宜方法提取质粒DNA，并利用启动子特异性引物通过PCR分析质粒。</li>
	<li>使用步骤1.3中的PCR条件。在1%琼脂糖凝胶上检测PCR产物以确认扩增，扩增片段为700 bp。</li>
	<li>测序阳性质粒 pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (图1D使用特异性启动子引物验证插入片段的真实性。</li>
	<li>将质粒转化至 A. rhizogenes 菌株 K599（然而，也可使用其他任何菌株的 A. rhizogenes 可使用）。将2 µL质粒样品加入50 µL电转感受态细胞中，用1 mm比色皿在以下参数下进行电转化：1.8 kV、25 µF、200 Ω。</li>
	<li>在约 500 µL SOC 培养基中重悬细胞，于 28 °C 振荡培养 2 小时。涂布于 LB-Spe100 平板，于 28 °C 培养 2 天。</li>
	<li>按照步骤1.7所述进行菌落筛选，并采用步骤1.3中的PCR反应条件。从阳性克隆中制备甘油菌种，于-80 °C保存。</li>
	<li>使用 A. rhizogenes 携带空pBGWFS7.0载体的培养物作为阴性对照。</li>
</ol>
2. 菜豆的根癌农杆菌（A. rhizogenes）转化毛状根
<ol>
	<li>将约20粒菜豆（P. vulgaris cv. Negro Jamapa）种子在50 mL 96%乙醇中灭菌1分钟，弃去乙醇；然后加入50 mL 20%次氯酸钠溶液（漂白剂），在超净工作台中持续振荡处理10分钟，随后去除漂白剂，并用过量无菌水清洗3次。 
	注意：其他P. vulgaris品种也可用于毛状根诱导。</li>
	<li>将灭菌后的种子置于经Broughton &amp; Dilworth（B&amp;D）溶液22（表1）润湿的无菌滤纸上，在28 °C黑暗条件下萌发2天。</li>
	<li>转化前一天准备以下材料：
	<ol>
		<li>取150 µL携带双元载体的A. rhizogenes菌液（按步骤1.13和1.14制备），划线接种于含链霉素100 mg/L的固体LB培养基平板上，28 °C过夜培养。</li>
		<li>取一支15 mL离心管加入B&amp;D溶液，将螺口盖替换为双层铝箔封口。将此离心管插入含有10 mL B&amp;D溶液的22 cm玻璃管中（图2C），并进行高压灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转化当天，在超净工作台中准备好以下无菌材料：步骤2.2中已萌发的种子、步骤2.3.1的培养平板、步骤2.3.2的试管、无菌双蒸水（10 mL）、移液器及吸头、无菌镊子和3 mL注射器。</li>
	<li>使用弯曲的200 µL吸头从平板上刮取A. rhizogenes菌体至微量离心管中，用1 mL无菌双蒸水重悬。同样方法单独制备空载体对照菌液。
	<ol>
		<li>轻轻混匀使菌体重悬，切勿涡旋振荡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用无菌吸头在步骤2.3.2中试管的铝箔上打一个直径3 mm的小孔。</li>
	<li>用注射器吸取步骤2.5中制备的菌液（启动子组或空载体对照组），用针尖轻微刺破已萌发种子的下胚轴（图2G）。 
	注意：确保针头刺入下胚轴维管组织4–6次，并在不同位置的伤口处注入少量（约5 µL）菌液。</li>
	<li>小心将注射后的幼苗根部插入含B&amp;D溶液的15 mL离心管的3 mm孔中，将整个装置放回22 mL玻璃管内，并密封以保持湿度。</li>
	<li>将试管置于培养室中，28 °C条件下培养，光照周期为16小时光照：8小时黑暗。 
	注意：培养3–4天后，植株生长至22 mL玻璃管口边缘。此时应取下管盖，并用封口膜围绕茎部密封管口，如图2I所示。</li>
	<li>转化后5–7天观察伤口处愈伤组织形成情况，10–12天可见长约2 cm的毛状根。 
	注意：需始终保持塑料管和玻璃管中的B&amp;D溶液充足。</li>
	<li>两周后，剪除毛状根下方约2 cm处的主根，将幼苗移栽至装有无菌蛭石的花盆中。将植株继续培养于生长室（28 °C，16小时光照：8小时黑暗），并定期用B&amp;D溶液浇灌。</li>
</ol>
3. 启动子分析：菜豆根瘤菌根瘤中NIN启动子的表达
<ol>
	<li>为诱导根瘤形成，将与菜豆相容的 Rhizobium tropici 或 Rhizobium etli 接种于 100 mL PY 培养基（含 0.5 g 胰蛋白胨、0.3 g 酵母提取物）中，并添加 700 mM CaCl2 和 20 mg mL−1 萘啶酸。在 30 °C、300 rpm 振荡条件下培养 24 小时。 
	注意：若使用转基因 Rhizobium，可根据需要选用其他特定抗生素。</li>
	<li>在室温下以 2,800 × g 离心 3 分钟收集菌体，用 10 mL 10 mM MgSO4 重悬菌体。用 10 mM MgSO4 稀释调节菌液在 OD600 处的光密度至 0.6。</li>
	<li>每株植物（包括启动子和载体对照）接种 1–2 mL 培养物（来自步骤 3.2），以诱导毛状根上形成根瘤。使用低氮 B&amp;D 溶液（含 2 mM KNO3）浇灌植物，以促进结瘤。</li>
	<li>根据实验需求，在不同时间点采集毛状根。接种后 3–5 天（dpi）采集样品用于观察侵染线。 
	注意：原基期根瘤和幼嫩根瘤可分别在接种后 6–9 天和 10–12 天进行研究；成熟且具有功能的根瘤可在接种后 14–21 天进行研究，衰老根瘤则在 &#62; 28 dpi 时研究。</li>
	<li>对根/根瘤进行报告基因（GUS 或 GFP）活性检测。按照 Jefferson23 描述的方案分析 GUS 活性。在荧光显微镜下观察 GFP 信号，使用蓝色氩离子激光（488 nm）激发 GFP 荧光，并收集 510 至 540 nm 的发射荧光。</li>
</ol>

<ol><li>Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+promoters+and+cis-actingregulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements.</a> Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).</li>
<li>Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+Thirst+for+Genome+Sequencing%2C+Data+Interpretation%2C+and+Database+Usage+in+Genomic+Era%3A+The+Road+towards+Fast-Track+Crop+Plant+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+Research+International%22%5BJournal%5D)">Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement.</a> Genetics Research International. , 684321(2015).</li>
<li>Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplast+isolation%2C+transient+transformation+of+leaf+mesophyll+protoplasts+and+improved+Agrobacterium-mediated+leaf+disc+infiltration+of+Phaseolus+vulgaris%3A+Tools+for+rapid+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis.</a> BMC Biotechnol. 16 (1), 53(2016).</li>
<li>Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+localization+of+a+symbiosis-specific+phosphate+transporter+is+mediated+by+a+transient+reorientation+of+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).</li>
<li>Kryvoruchko, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MtSWEET11%2C+a+Nodule-Specific+Sucrose+Transporter+of+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).</li>
<li>Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+cortical+cell+division+during+root+nodule+development+in+Lotus+japonicus+is+accompanied+by+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response.</a> Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).</li>
<li>Suzaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoreduplication-mediated+initiation+of+symbiotic+organ+development+in+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus.</a> Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).</li>
<li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-affinity+phosphate+transporter+GmPT5+regulates+phosphate+transport+to+nodules+and+nodulation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean.</a> Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).</li>
<li>Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Functional+Analysis+of+a+Novel+Group+of+Legume-specific+WRKY+and+Exo70+Protein+Variants+from+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean.</a> Sci Rep. 6, 32090(2016).</li>
<li>Montiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene+is+required+for+root+infection+by+Rhizobia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia.</a> Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).</li>
<li>Arthikala, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PvRbohB+negatively+regulates+Rhizophagus+irregularis+colonization+in+Phaseolus+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris.</a> Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).</li>
<li>Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RbohB+a+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene%2C+enhances+symbiosome+number%2C+bacteroid+size%2C+and+nitrogen+fixation+in+nodules+and+impairs+mycorrhizal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization.</a> New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).</li>
<li>Barraza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+PvTRE1+enhances+nodule+biomass+and+bacteroid+number+in+the+common+bean%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean.</a> New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).</li>
<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autophagy-related+kinase+is+essential+for+the+symbiotic+relationship+between+Phaseolus+vulgaris+and+both+rhizobia+and+arbuscular+mycorrhizal+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).</li>
<li>Nanjareddy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Legume+TOR+Protein+Kinase+Regulates+Rhizobium+Symbiosis+and+Is+Essential+for+Infection+and+Nodule+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development.</a> Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).</li>
<li>Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+the+Vicia+faba+L.+gene+VfEnod12+encoding+an+early+nodulin+is+active+in+cortical+cells+and+nodule+primordia+of+transgenic+hairy+roots+of+Vicia+hirsuta+as+well+as+in+the+prefixing+zone+II+of+mature+transgenic+V.+hirsuta+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules.</a> Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).</li>
<li>Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+Sesbania+rostrata+leghemoglobin+glb3+gene+5%27-upstream+region+in+transgenic+Lotus+corniculatus+and+Nicotiana+tabacum+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants.</a> Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).</li>
<li>Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+network+governing+nodule+organogenesis+and+infection+in+the+model+legume+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus.</a> Nat Commun. 12, 1-10 (2010).</li>
<li>Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaseolus+vulgaris+RbohB+functions+in+lateral+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development.</a> Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).</li>
<li>Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+expressed+genes+in+mycorrhized+and+nodulated+roots+of+common+bean+are+associated+with+defense%2C+cell+wall+architecture%2C+N+metabolism%2C+and+P+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182328(2017).</li>
<li>Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li>
<li>Broughton, W. J., Dilworth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+leghemoglobin+synthesis+in+snake+beans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Control of leghemoglobin synthesis in snake beans.</a> Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).</li>
<li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1178271/">Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system.</a> Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).</li>
<li>Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+induction+of+soybean+hairy+roots+and+propagation+of+the+soybean+cyst+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode.</a> Planta. 210 (2), 195-204 (2000).</li>
<li>Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Composite+Plants+in+Medicago+truncatula+used+for+Nodulation+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2633(2011).</li>
<li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+expression+of+hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules.</a> Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).</li>
<li>Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/e795">Hairy Root Transformation in Lotus japonicus.</a> Bio-protocol. 3 (12), e795(2013).</li>
<li>Jacobs, T. B., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+CRISPR+Vector+Construction+and+Characterization+of+DNA+Modifications+by+Generation+of+Tomato+Hairy+Roots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots.</a> J. Vis. Exp. (110), e53843(2016).</li>
<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-transformation+of+the+Phaseolus+spp.%3A+a+tool+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics.</a> Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在基因功能分析过程中，基因表达模式的研究对于理解基因的空间和时间调控具有重要作用 体内研究基因表达模式的常用方法是将目标基因的启动子区域克隆至报告基因（如荧光标记基因 GFP、RFP）的上游。 等。) 或 β-葡萄糖醛酸酶。本文中，我们选择根瘤共生（RNS）特异性基因 NIN 的启动子区域，以研究其在时空表达模式中的表现 P. vulgaris 在RNS期间，已通过Gateway方法将选定的启动子序列克隆至GFP::GUS报告基因的上游，插入启动子表达载体中。
我们已描述了共生特异性启动子在毛根系统中的表达 P. vulgaris 毛状根系统已广泛用于难转化作物中基因的功能鉴定，包括RNAi介导的基因敲低、基因的异位组成型表达、启动子活性分析以及蛋白质定位研究。该系统的主要优势在于操作简便、可重复性强、结果可靠，同时不需耗费大量人力。毛状根系统已在其他豆科作物中成功应用，例如 G. max24, M. truncatula<su...

启动子是重要的分子生物学工具，在理解目的基因表达调控中发挥着关键作用。启动子是位于基因序列翻译起始密码子上游的DNA序列，携带基因的核心调控信息；因此，对其准确注释和表征对于理解基因功能至关重要。根据表达模式的不同，植物启动子可分为组成型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子和诱导型启动子1。转录组学技术的进步、计算机建模方法的改进，以及多种植物物种基因组序列数据的日益丰富，促进了启动子序列的大规模预测2。
另一方面，建立快速、高效且可重复的启动子评估工具和遗传转化技术也至关重要。与其他模式植物不同，普通菜豆（P. vulgaris）基因的功能表征主要受限于Phaseolus属植物在稳定遗传转化方面的顽拗性。瞬时转化系统可作为快速进行基因功能研究的替代方法3。在豆科植物共生研究中，豆科宿主植物与根瘤菌之间的相互作用是进行根瘤特异性基因功能分析和启动子研究中最易操作的模型系统之一。迄今为止，已有多个与这些共生过程相关的豆科植物启动子被鉴定，例如Medicago truncatula PT44、SWEET115、Lotus japonicus Cyclops、UBQ6、VAG17、Glycine max PT58、Exo70J9、P. vulgaris RbohB10,11,12、TRE113、PI3K14、TOR15等。cis元件直接影响基因的调控。转录因子ENBP1A可结合到早期结节素基因VfENOD12的cis调控区（−692 bp），从而促进报告基因在蚕豆（Vicia faba）根瘤原基中的表达16。将根瘤特异性启动子豆血红蛋白GLB3的cis调控区（−161至−48 bp）替换为异源截短启动子δ-p35S和δ-pNOS后，导致其根瘤特异性丧失且启动子活性降低17。
先前的研究表明，转录因子 NIN 对于根毛细胞中根瘤菌侵染的启动以及 L. japonicus18 的根瘤器官发生均是必需的。在本研究中，我们描述了一种用于鉴定、分离、克隆和表征菜豆毛状根中根瘤特异性启动子的实验方案。为此，我们选取了 P. vulgaris 中一种根瘤菌共生特异性的 NIN 启动子，并将其克隆至与嵌合报告基因 GUS 增强型::GFP 构成的转录融合载体中。此外，本方案还介绍了一种利用 A. rhizogenes 诱导毛状根实现 P. vulgaris 遗传转化的快速且多功能的系统。该系统在转化后不到两周内即可产生毛状根。最后，我们通过 GUS 染色检测了 NIN 启动子在根瘤菌定植的根瘤中的时空表达模式。
此处描述的方法不仅可能对豆科植物结瘤和菌根共生的研究有用11，还可用于研究根部启动子的表达模式19。此外，该方案易于在非专业实验室中应用。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;qRT-PCR检测引物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN 正向引物</td><td>CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN 反向</td><td>CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13正向引物</td><td>GTA AAA CGA CGG CCA G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 反向引物</td><td>CAG GAA ACA GCT ATG AC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K243520</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II 酶混合物&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791100</td><td></td></tr><tr><td>pBGWFS7.0&amp;nbsp;</td><td>植物系统生物学</td><td>https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA 聚合酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10966018</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 植物迷你试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pfx DNA 聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>11708013</td><td></td></tr><tr><td>认证分子生物学琼脂糖</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1613102</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 化学感受态 E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-250G</td><td></td></tr><tr><td>细菌学琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615-25G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸壮观霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1441</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>细菌学蛋白胨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>萘啶酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7654</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>Veriti 梯度PCR仪</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Sigma</td><td>Sigma 1-14K</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Carestream</td><td>Gel Logic 212 PRO</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ SHKE6000 6000 型振荡培养箱 - 115VAC</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EW-51708-70</td><td></td></tr><tr><td>植物生长培养箱</td><td>MRC</td><td>PGI-550RH</td><td></td></tr><tr><td>水平层流洁净工作台</td><td>Lumistell</td><td>LH-120</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DM4500 B</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>sym 实验室</td><td>90X15</td><td></td></tr><tr><td>手术刀刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>53223</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>22 mL 玻璃试管</td><td>托马斯科学</td><td>45048-16150</td><td></td></tr></tbody></table>

植物启动子分析：菜豆根瘤特异性启动子的鉴定与表征

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

基因编码序列的上游序列被称为启动子序列。研究启动子的表达模式对于理解基因调控以及目标基因的时空表达模式具有重要意义。另一方面，建立快速、高效且可重复的启动子评估工具和遗传转化技术也至关重要。在本研究中，我们分析了根瘤菌共生特异性结瘤起始基因（NIN）启动子在转基因毛状根中的时空表达模式，该启动子来源于菜豆（Phaseolus vulgaris）。利用植物基因组数据库和分析工具，我们鉴定、分离并克隆了P. vulgaris NIN启动子，并将其与嵌合报告基因β-葡萄糖醛酸酶（GUS）GUS增强型::GFP进行转录融合。此外，本实验方案描述了一种利用根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）诱导产生毛状根，实现P. vulgaris快速且多功能遗传转化的系统。该系统在转化后10至12天内可产生长度≥2 cm的毛状根。随后，我们在接种根瘤菌（Rhizobium）后的不同时间点，评估了NIN启动子在毛状根中的时空表达情况。GUS活性结果显示，NIN启动子在结瘤过程中具有活性。综上所述，本实验方案展示了如何在菜豆毛状根中鉴定、分离、克隆并表征植物启动子。此外，该方案适用于非专业实验室，操作简便。

本研究的目的是评估结节特异性P. vulgaris NIN的时空表达模式。为此，选取NIN基因翻译起始密码子上游700 bp的区域，并设计了一组引物，如图1A所示。使用高保真DNA聚合酶扩增NIN启动子片段，经分离纯化（图1B）后，通过Gateway克隆技术将其插入到双元载体pBGWFS7.0中（图1C），构建形成与嵌合报告基因GUS增强型GFP（GUS-enhanced GFP）的转录融合载体（pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP）。pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP载体构建通常可获得数百个独立克隆。利用基因特异性引物进行菌落PCR筛选，可快速鉴定出正确克隆（图2D）。随后使用启动子特异性引物对PCR阳性质粒进行Sanger测序，以验证插入片段的真实性。
<p cl...

启动子表达分析对于深入理解基因调控机制以及目标基因在时空上的表达模式至关重要。本文介绍了一种用于鉴定、分离和克隆植物启动子的实验方案，并进一步描述了在菜豆毛状根中对根瘤特异性启动子的表征方法。

基因编码序列的上游序列被称为启动子序列。研究启动子的表达模式在……中具有重要意义。

毛状根用于在菜豆中获得带有报告基因构建体的转化根。所获得的转基因根可用于检测报告基因的表达。启动子表达研究对于理解基因的时空表达模式至关重要。今天我们将演示在菜豆（Phaseolus）根瘤共生条件下，诱导毛状根并研究转基因毛状根中启动子表达模式的方法。Estrada-Navarrete 及其同事此前已在菜豆中建立了由根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）诱导的毛状根体系。本方法将有助于缩短毛状根诱导所需时间，从而提高该体系的适用性。演示实验步骤的将是我实验室的同事 Manoj-Kumar Arthikala 以及本科学生 Alma Leticia 和 Brenda Mariana。首先，在 Phytozome 的菜豆（Phaseolus vulgaris）基因组数据库中搜索 NIN 基因序列，并选择起始密码子 ATG 上游所需长度的序列。随后根据适当的启动子序列分析结果设计寡核苷酸引物。新制备的菜豆基因组DNA将作为PCR扩增启动子序列的模板。使用高保真Taq DNA聚合酶、标准PCR组分以及先前设计的寡核苷酸，配制PCR预混液。将预混液分装至2 mL PCR管中，然后在热循环仪中采用合适的程序进行启动子片段的扩增。将PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。在紫外透射光下观察扩增出的700个碱基对的NIN片段。根据标准操作说明，切下该片段，洗脱并克隆至Gateway入门载体pENTR/D-TOPO中。取2微升反应混合物转化至感受态E.coli细胞中，在42摄氏度下处理50秒，将转化后的E.coli涂布于含有50毫克/升卡那霉素的LB培养基上。在37摄氏度下过夜培养涂布的细胞。从随机挑选的E.coli菌落中提取质粒，使用M13寡核苷酸进行PCR反应。1024个碱基对处的片段应表明为阳性克隆。将阳性入门克隆与目的双元载体进行LR反应。取两微升反应混合物转化至大肠杆菌（E.coli）中，并在含100毫克/升链霉素、37摄氏度条件下筛选菌落。使用NIN特异性寡核苷酸扩增质粒。阳性克隆应在700个碱基对处扩增出条带。对克隆片段进行测序并验证其正确性。将NIN启动子构建体转入电转化感受态的K599根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）细胞中。再次使用启动子特异性的寡核苷酸验证克隆。对菜豆（Phaseolus vulgaris）种子进行硫磺灭菌，并在28°C黑暗条件下，于无菌湿润滤纸上萌发两天。将150微升含有NIN表达载体和对照载体的根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）细胞涂布于含链霉素筛选的LB平板上，在28摄氏度下过夜培养。剥除菜豆（Phaseolus）幼苗种皮，用弯曲的200微升枪头从平板上刮取根癌农杆菌细胞。用1 mL无菌蒸馏水重悬至离心管中。将发根农杆菌细胞收集至3 mL注射器中，并将菜豆幼苗放入预先准备好的试管装置中。用针尖轻轻刺破萌发种子的下胚轴，同时注入发根农杆菌细胞。注意避免针头穿透下胚轴。将注射后的幼苗置于28摄氏度的培养室中，保持16小时光照和8小时黑暗的光周期。受伤的下胚轴上应在5至7天内出现愈伤组织。两周后，将茎部在毛状根下方两厘米处切断，去除主根，并将植株移栽至含有无菌蛭石的花盆中。同时，每株接种1 ml根瘤菌（Rhizobium tropici）以诱导结瘤。接种前需将根瘤菌培养物稀释至OD600为6。将植株置于28摄氏度、16小时光照和8小时黑暗光周期的生长室中培养，并用B和D溶液进行灌溉。为研究NIN启动子的时空表达模式，需在不同时间点取样。取出植株时避免损伤根系，并将根部彻底清洗，确保无蛭石残留。从 NIN 植物和对照植物中随机选取根部，并将样品置于 GUS 检测缓冲液中，在 37°C 黑暗条件下孵育 16 小时，进行 GUS 组织化学染色。在体视显微镜和复式显微镜下观察染色后的根部。此图片显示了根瘤菌诱导的 NIN 启动子在主根中的表达。在根瘤菌侵染的根毛细胞中也可观察到NIN启动子的表达。此外，GUS表达可在根瘤发育的不同阶段进行记录。在载体对照根中未观察到GUS表达。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计启动子载体，并研究菜豆转基因毛状根中启动子的表达模式。该系统还可进一步拓展，用于研究菜豆及其他真双子叶植物在其他共生和病原体互作条件下的启动子表达模式。

plant-promoter-analysis-identification-characterization-root-nodule

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

植物启动子分析: 菜豆根瘤特异启动子的鉴定与表征

我们展示了如何利用毛状根复合植株在难以转化的物种Medicago...

Medicago truncatula 复合植株的制备及其在结瘤实验中的应用

侧根诱导系统（LRIS）可实现侧根的同步诱导，本文介绍了该系统在拟南芥（Arabidopsis...

可诱导侧根系统 拟南芥 和玉米

我们开发了一种简单高效的方案，用于制备大量大豆原生质体，以研究活细胞中复杂的调控和信号传导机制。...

一种简易的大豆原生质体分离方法及其在瞬时基因表达分析中的应用

本方案旨在研究从内生环境分离的Bacillus...

植物-微生物互作：芽孢杆菌 Bacillus mycoides 对马铃薯根系分泌物的转录响应

一种优化的根箱实验方案，用于观察根系生长及其对局部养分的响应

本文介绍了两种转化马铃薯植株的实验方案。Agrobacterium tumefaciens 转化可获得完整的转基因植株，而 Agrobacterium rhizogenes...

Agrobacterium tumefaciens 和 Agrobacterium rhizogenes 介导的马铃薯转化及通过 GUS 染色检测木栓质合成基因的启动子活性

核糖体亲和纯化（TRAP）技术能够在对器官和组织进行最少处理的情况下，解析发育过程。该方案可从表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的核糖体亚基的靶向细胞中提取高质量RNA。通过qRT-PCR或RNA-seq等下游分析工具，可揭示组织和细胞类型特异性的基因表达谱。...

细胞类型特异性尺度下研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）根发育的核糖体亲和纯化（TRAP）技术转化应用

本方案详细总结了将土传微生物接种至植物根部的策略。以长孢轮枝菌（Verticillium longisporum）和大丽轮枝菌（Verticillium...

接种策略以感染植物根部的土传微生物

本文介绍了一种高效生产转基因大豆毛状根的实验方案。...

大豆毛状根转化用于基因功能分析

在此，我们提供了一种由介导的一步法转化详细实验方案 根癌农杆菌...

一种高效且可重复的复合植株制备方法 根癌农杆菌基于发根农杆菌的毛状根转化

学习利用发根农杆菌诱导菜豆毛状根并分析根瘤特异性启动子表达模式的方法。该方案可加速转化进程，为研究植物基因调控和共生固氮提供可靠工具。

植物启动子分析：菜豆根瘤特异性启动子的鉴定与表征

探索更多视频