植物启动子分析：菜豆根瘤特异性启动子的鉴定与表征

毛状根用于在菜豆中获得带有报告基因构建体的转化根。所获得的转基因根可用于检测报告基因的表达。启动子表达研究对于理解基因的时空表达模式至关重要。

今天我们将演示在菜豆（Phaseolus）根瘤共生条件下，诱导毛状根并研究转基因毛状根中启动子表达模式的方法。Estrada-Navarrete 及其同事此前已在菜豆中建立了由根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）诱导的毛状根体系。本方法将有助于缩短毛状根的诱导时间，从而提高该体系的适用性。

演示实验步骤的将是我同事 Manoj-Kumar Arthikala 以及我实验室的本科学生 Alma Leticia 和 Brenda Mariana。首先，在 Phytozome 的菜豆（Phaseolus vulgaris）基因组数据库中搜索 NIN 基因序列，并选择起始密码子 ATG 上游所需长度的序列。随后根据适当的启动子序列分析结果设计寡核苷酸引物。

新制备的菜豆基因组DNA将作为PCR扩增启动子序列的模板。使用高保真Taq DNA聚合酶、标准PCR组分以及先前设计的寡核苷酸引物配制PCR预混液。将预混液分装至2 mL PCR管中，然后在热循环仪中采用合适的程序进行启动子片段的扩增。

将PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。在紫外透射光下观察在700个碱基对处扩增出的NIN片段。按照标准操作说明，切下该片段，洗脱并克隆至Gateway入门载体pENTR/D-TOPO中。

取2微升反应混合物，于42摄氏度处理感受态E.coli细胞50秒，将转化后的E.coli涂布于含有50毫克/升卡那霉素的LB培养基上。将涂布的细胞在37摄氏度过夜培养。从随机挑选的E.coli菌落中提取质粒，使用M13寡核苷酸进行PCR反应。

1024个碱基对处的片段应表明为阳性克隆。将阳性入门克隆与目的双元载体进行LR反应。取两微升反应混合物转化至大肠杆菌（E.coli）中，并在含100毫克/升链霉素的培养基中于37摄氏度下筛选菌落。

使用NIN特异性寡核苷酸扩增质粒。阳性克隆应在700个碱基对处扩增出条带。对克隆片段进行测序并验证其正确性。

将NIN启动子构建体转入电转化感受态的K599根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）细胞中。再次使用启动子特异性的寡核苷酸验证克隆。对菜豆（Phaseolus vulgaris）种子进行硫磺灭菌处理，并在28摄氏度黑暗条件下，于无菌湿润滤纸上萌发两天。

将150微升含有NIN表达载体和对照载体的根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌液涂布于含链霉素筛选的LB平板上，在28摄氏度下过夜培养。剥除菜豆（Phaseolus）幼苗种皮，用弯曲的200微升枪头从平板上刮取根癌农杆菌细胞。

将菌体重悬于含有1 mL无菌蒸馏水的离心管中。用3 mL注射器收集根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）细胞，并将菜豆幼苗放入预先准备好的试管装置中。用针尖轻轻刺破已萌发种子的下胚轴，同时注入根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）细胞。

需注意避免针头穿透下胚轴。将注射后的幼苗置于28°C的培养室中，保持16小时光照、8小时黑暗的光周期。受伤的下胚轴上应在5至7天内出现可见的愈伤组织。

两周后，将茎在毛根下方两厘米处切断，去除主根，并将植株移栽至含有无菌蛭石的花盆中。同时，每株接种 1 ml 的热带根瘤菌（Rhizobium tropici）以诱导结瘤。接种前需将根瘤菌培养液稀释至 OD 600 为 6。

将植物置于28摄氏度、16小时光照和8小时黑暗光周期的生长室中培养，并用B和D溶液进行灌溉。为研究NIN启动子的时空表达模式，需在不同时间点取样。取出植物时避免损伤根系，并将根部彻底清洗，确保无蛭石残留。

从 NIN 植物和对照植物中随机选取根部，并将样品置于 GUS 检测缓冲液中，在 37°C 黑暗条件下孵育 16 小时，进行 GUS 组织化学染色。在体视显微镜和复式显微镜下观察染色后的根部。此图片显示了根瘤菌诱导的 NIN 启动子在主根中的表达。

在根瘤菌侵染的根毛细胞中也可观察到NIN启动子的表达。此外，GUS表达可在根瘤发育的不同阶段进行记录。在载体对照根中未观察到GUS表达。

观看本视频后，您应能充分理解如何设计启动子载体，并研究菜豆转基因毛状根中启动子的表达模式。该系统还可进一步拓展，用于研究菜豆及其他真双子叶植物在其他共生和病原体互作条件下的启动子表达模式。