无源清清除小鼠卵巢血管构筑的三维重建
2017年12月10日
在这里, 我们提出了被动清晰度和3D 重建方法的适应性, 可视化卵巢血管和卵泡毛细血管在完整的小鼠卵巢。
该方案的总体目标是提供小鼠卵巢卵泡中毛细血管分布的完整三维视图并显示它们之间的关系。卵巢是生殖和内分泌学中的重要器官。计算卵泡和体细胞的每个不同发育阶段。
此外，与其他器官不同，卵巢不表现出功能单位的重复分支。局部血管系统可能与神经系统一起，也能够在成年女性的每个月经周期中发生重大变化。在卵巢中应用被动清晰度可以让我们看到卵巢中这些细胞和卵泡之间的整体分布和联系。
这项措施的一个关键是它对卵巢的影响最小，并且解释了各种标志物的清除。通过重建显微图像，我们提供了卵巢图谱。可以清楚地观察到血管、神经元和卵泡的一些细节。
对于图像分析，使用了 Imaris 的一些选项来评估卵巢和结构之间的关系。根据文章说明准备大量溶液并将它们保存在冰上。麻醉小鼠并确保小鼠没有脚趾捏反应。
喷洒乙醇，在右心房切开，然后立即以每分钟 20 毫升的速度用 10 毫升冰冷的 PBS 充入左心室以冲洗血液。然后以相同的速度用冷水凝胶溶液充入动物。收集卵巢和子宫，以保持卵巢形态的完整性。
将分离的卵巢转移到冷的水凝胶溶液中。在立体显微镜下，去除卵巢周围的脂肪组织。为了获得更好的组织固定效果，我们建议切除卵巢滑囊。
将卵巢在水凝胶溶液中保存三天。三天后，将卵巢转移到玻璃管中，并用新鲜的水凝胶溶液填充管中。将封口膜拉伸到管的顶部，然后将另一层封口膜缠绕在管的颈部。
确保封口膜和水凝胶溶液之间没有气泡。将玻璃管放在 37 摄氏度的摇床培养箱上 2 小时，直到凝胶形成。用纸质过滤器小心地去除卵巢周围多余的凝胶。
将卵巢放入 15 毫升试管中，并在试管中加入 10 毫升透明溶液。将试管置于 37 摄氏度的摇床培养箱中至少两个月。前三天每天更换清除液，然后每周更换一次，直到卵巢清除。
所有免疫染色程序均在 37 摄氏度下在摇床上进行。首先，在 PBST 中清洗卵巢 24 小时。第二次，将卵巢在用 PBST 稀释的一抗中孵育两天。
第三，用 PBST 缓冲液洗去一抗。第四，将卵巢与所需的二抗在 PBST 中孵育两天。第五，用 PBST 洗去二抗。
第六，将卵巢转移到折光率匹配溶液中进行 RI 匀浆。检查视觉透明度，当卵巢完全澄清后，可以对其进行成像。首先，准备一个干净的玻璃底盘。
制作一个油灰圆柱体并将其塑造成马蹄形。将外边缘紧紧压在载玻片上，形成密封空间。腻子的高度应比子房高一点。
小心地将卵巢移动到中心并添加安装溶液。将一个盘子推到腻子上，然后用两块腻子固定它。当卵巢准备好成像时，可以选择配备 16 倍镜头的尼康共聚焦显微镜对其进行成像。
对于使用共聚焦显微镜进行成像，首先在 Ni-E 面板中选择镜头。在面板采集中，选择通道数。首先，使用 Eye Port 选项卡和 XY 控制器纵杆通过显微镜目镜检查将组织移动到视场中心。
其次，关闭快门灯后，单击实时选项卡以调整每个通道的激光功率、HV 和偏移。在面板 Z 强度校正调整顶层的采集中，单击加号按钮定义顶部，将镜头向下移动镜头并设置适当的 HV 和激光功率到组织底部，并添加最低层信息，单击到 ND 以将设置与面板和采集同步。而在 acquisition 中，首先设置扫描步骤数。
单击 Z 和大图像的选项卡。其次，转到扫描大图像窗口，根据组织的边界定义视野大小。第三，回到 ND 采集输入扫描场的大小并选择 10% 到 50% 之间的重叠然后单击运行 Z 校正并等待成像过程。
首先使用 imagic 打开原始 NIS 文件。单击图像按钮，选择颜色和显示通道，然后单击文件，选择图像序列并分别将它们保存为 tiff 文件。其次，使用 Imaris 打开其中一个 tiff 文件。
点击 编辑 按钮并选择 添加频道 添加其余部分。名称和颜色可以在显示调整中更改。组织的厚度也应在图像属性中校正。
第三，点击 编辑 按钮并选择 裁剪3D 剪切多余的部分。首先，单击灯丝按钮，然后单击下一步。转到 slice 面板，找到 tracing 容器和距离，然后返回 Surpass，输入 static 并单击 Next。
其次，调整起点和设定点阈值。在相机面板中，选择选择，按 Shift 并单击该点以删除多余的部分。第三，选择最高阈值，然后单击 Next。
不要选择 detect points and go next。一些多余的部分可以在编辑面板中删除。可以通过单击颜色来编辑颜色。
免疫染色 CD31 后研究卵巢脉管系统 3D 结构。3D 结构可以通过其他切片观察，也可以通过体积渲染观察整个。CD 31 是完成成年小鼠滤泡血管系统的染色。
通过细丝重建毛细血管，我们可以显示单个卵泡与其毛细血管之间的关系。卵巢和女人一样，总是活跃的，可以互换的。然而，由于传统组织学分析的局限性，很难描述这些复杂成分之间的关系。
新开发的方法 passive clarity 可能有助于我们克服光学障碍，保持整个组织的完整性，并提供功能线索。
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概述
本研究介绍了一种适用于完整小鼠卵巢的被动CLARITY方法，用于可视化卵巢血管系统和卵泡毛细血管。该协议旨在提供卵巢卵泡内毛细血管分布的全面三维视图。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生殖生物学
- 血管生物学
背景
- 卵巢在生殖和内分泌学中扮演着关键角色。
- 卵泡经历各种发育阶段，每个阶段都有不同的体细胞。
- 与其他器官不同，卵巢不表现出功能单元的反复分支。
- 卵巢内的血管系统在每个月经周期中可能会发生显著变化。
研究目的
- 可视化小鼠卵巢卵泡中毛细血管的整体分布。
- 阐明卵巢内细胞和卵泡之间的关系。
- 增强对卵巢血管化及其对生殖健康影响的理解。
使用的方法
- 应用被动CLARITY技术。
- 卵巢血管系统的三维重建。
- 完整小鼠卵巢中卵泡毛细血管的可视化。
- 计算卵泡和体细胞的不同发育阶段。
主要结果
- 成功可视化卵巢卵泡中的毛细血管网络。
- 详细绘制卵泡之间的血管连接。
- 洞察卵巢血管系统的动态变化。
- 建立卵巢生物学未来研究的框架。
结论
- 被动CLARITY方法有效揭示了卵巢血管结构。
- 这种方法可以推进我们对卵巢功能和健康的理解。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索生殖内分泌学。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing intact ovarian vasculature in 3D enables mechanistic de-risking of reproductive target hypotheses by clarifying structural relationships between follicles and their capillary networks. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible readouts of vascular architecture that can inform target validation and phenotypic screening workflows. The method addresses a key discovery-stage challenge: linking anatomical context to functional ovarian biology without tissue distortion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping follicular capillary length to follicular wall volume, supporting functional target validation.
- Operational Value: Provides a standardized, shrinkage-minimized clearing protocol that preserves tissue integrity for reproducible vascular analysis.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through quantitative correlation data (P<0.01) between capillary extent and follicular development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated 3D vascular maps that serve as disease-relevant systems for assessing compound effects on ovarian microstructure.
- Operational Value: Enables assay standardization via consistent immunostaining (CD31), clearing, and imaging parameters across follicles.
- Scalability: Supports platform reuse through adaptable clearing and reconstruction workflows applicable to other endocrine tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-stage vascular phenotypes to preclinical models by preserving native ovarian architecture for longitudinal study.
- Mechanistic De-risking: Clarifies neurovascular interactions in the ovary, reducing ambiguity in endocrine target pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides structural biomarkers (e.g., capillary length, follicular volume) to inform go/no-go decisions in follicle-modulating programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of vascular contributions to follicle maturation, supporting lead identification through phenotypic vascular profiling, and informing preclinical validation via intact tissue phenotyping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of vascular regulators in follicle development through direct 3D visualization of capillary networks.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared ovarian tissue with quantitative vascular outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides morphometric measurements (capillary length, follicular volume) and correlation statistics to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains histological fidelity from discovery through preclinical stages by avoiding tissue sectioning artifacts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular mapping capability for endocrine and reproductive tissue atlases across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in ovarian vascular biology.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs via passive CLARITY’s minimal tissue perturbation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular-related follicle phenotypes, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on vascular-structural phenotypes in follicle cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel-based tissue clearing, immunostaining, and multiphoton confocal microscopy.
- Depends on specialized instrumentation including shaker incubators, refractive index matching systems, and 3D reconstruction software (e.g., Imaris).
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration, antibody validation, and imaging parameters for reproducible vascular quantification.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to non-ovarian tissues due to differences in density and lipid content.
- Limited by extended clearing timelines (up to two months) and the need for optimized antibody penetration in dense stromal regions.
