Name: 无源清清除小鼠卵巢血管构筑的三维重建 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 了解使用无源CLARITY技术对小鼠卵巢血管构筑进行三维重建的方法。该技术可完整显示卵泡毛细血管分布及其与细胞的关系，为研究生殖生物学和卵巢血管化提供重要工具。

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本研究由博士后科学基金特别资助（编号 2014T70392，项目负责人：YF）、国家自然科学基金（编号 81673766，项目负责人：YF）、新教师启动基金、复旦大学作学基金以及上海市高峰学科发展计划—中西医结合项目（编号 20150407）资助。

所有涉及动物实验的操作均遵循复旦大学上海医学院动物伦理委员会的指导方针（批准编号 20160225-013）。
1. 透明化小鼠卵巢的制备
<ol>
	<li>溶液的配制
	<ol>
		<li>配制含0.1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（1 M，pH 7.6）（PBST）。配制1 L 10倍浓缩PBS储存液：称取87 g NaCl、3.1 g NaH2PO4 · 2H2O 和28.7 g Na2HPO4 ·12H2O，加去离子水（dH2O）定容至1 L，搅拌约2小时。用1 N NaOH调节pH至7.4，室温保存。使用时将10倍浓缩液用dH2O按1:10稀释，再加入Triton X-100至终浓度为0.1%，制成PBST。</li>
		<li>在冰上将4%（wt/vol）多聚甲醛（PFA）溶液、4%（wt/vol）丙烯酰胺、0.05%（wt/vol）双丙烯酰胺和0.25%（wt/vol）VA-044引发剂溶于双蒸水，配制pH 7.5的水凝胶溶液。</li>
		<li>将含4%（wt/vol）十二烷基硫酸钠（SDS）的200 mM硼酸钠缓冲液溶于双蒸水，配制pH 8.5的透明溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>经心脏灌注及卵巢制备
	<ol>
		<li>所有操作过程中，所有溶液均需置于冰上。</li>
		<li>通过腹腔注射戊巴比妥钠溶液（0.35 mg/kg）麻醉成年雌性野生型C57BL/6小鼠。当小鼠对脚趾夹捏无反应时，表明已充分麻醉。</li>
		<li>使用胶带将小鼠四肢伸展固定于平板泡沫板上。</li>
		<li>用剪刀经剑突处切开皮肤、胸壁和骨骼，暴露心脏。</li>
		<li>剪开动物右心房，以10 mL/min流速经左心室灌注20 mL冰浴的1×PBS。</li>
		<li>以10 mL/min流速灌注至少20 mL水凝胶溶液。</li>
		<li>用剪刀沿腹中线切开腹部皮肤，暴露整个腹腔，并移除肠道。同时取出卵巢和子宫，以保持卵巢形态的完整性。</li>
		<li>在显微镜下清除卵巢周围的脂肪组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱气处理
	<ol>
		<li>将卵巢置于10 mL水凝胶溶液中，4 °C固定3天。</li>
		<li>将卵巢转移至5 mL离心管中，加满水凝胶溶液。用封口膜覆盖管口，并在管颈处缠绕封口膜密封。 
		注意：确保封口膜与水凝胶溶液之间无气泡。</li>
		<li>将离心管置于37 °C培养箱中的摇床上，振荡不超过3小时，使水凝胶充分聚合。</li>
		<li>用刮勺取出卵巢，用纸巾小心去除周围多余的凝胶。用1×PBS洗涤卵巢4次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>被动透明化
	<ol>
		<li>将卵巢完全浸入10 mL透明溶液中，在37 °C、80 rpm轻柔振荡，开始透明化过程。</li>
		<li>第一周内每3天更换一次溶液；一周后每周更换一次透明溶液，直至卵巢完全透明。该过程通常需要约2–3周。 
		注意：卵巢可直接进行免疫染色，或在含0.02%叠氮化钠的PBS中4 °C保存数周后再进行免疫染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫染色
<ol>
	<li>在第1天，将卵巢在PBST中于37 °C摇床上洗涤两次。</li>
	<li>在第2–3天，于37 °C摇床上用一抗/PBST溶液（表1）孵育卵巢。本研究中使用的一抗分别为血小板-内皮细胞黏附分子1（CD31）和酪氨酸羟化酶，它们在PBST中的稀释比例分别为1:10和1:50。 
	注意：若使用两种或以上的一抗，需确保其来源于不同动物。</li>
	<li>在第4天，于37 °C摇床上用PBST缓冲液洗去一抗。</li>
	<li>在第5–6天，于37 °C摇床上用PBST中的合适二抗孵育卵巢。本研究中使用的二抗分别为针对酪氨酸羟化酶的Alexa Flour 488和针对CD31的Alexa Flour 594，均以1:50的比例稀释于PBST中。</li>
	<li>在第7天，于37 °C摇床上用PBST缓冲液洗去二抗。</li>
	<li>在第8天，将组织转移至折射率匹配溶液中以实现折射率均一化。将组织置于带网格线的纸上，通过观察是否能看清网格线来检查其透明度。当组织完全透明后，即可进行成像。</li>
	<li>制作一个刚好能包围组织的橡皮泥圆柱体，然后将其塑造成马蹄形，并将外缘紧密压在载玻片上，以形成一个密封空间。橡皮泥的高度应略高于卵巢。</li>
	<li>小心将透明化的卵巢置于橡皮泥中央，并加入折射率匹配溶液。将玻璃底培养皿紧密盖在橡皮泥上，并用橡皮泥固定培养皿。</li>
</ol>
3. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜成像时，在 &#34;Ni-E&#34; 面板中选择具有合适工作距离（此处为 2.0 mm）的物镜（此处为水浸 25X 物镜，1.1-NA，2 mm-WD）。</li>
	<li>在 &#34;Acquisition&#34; 面板中，选择通道数量。此处使用三个通道。
	<ol>
		<li>首先，使用 &#34;eye port&#34; 选项卡和 XY 控制摇杆，通过显微镜目镜观察，将组织移动至视野中心。</li>
		<li>关闭快门光源后，点击 &#34;live&#34; 选项卡，分别调节每个通道的 &#34;laser power&#34;、&#34;HV (Gain)&#34; 和 &#34;offset。较高的激光功率和 HV 可产生更强的信号，而较高的 offset 可降低背景噪声。</li>
		<li>选择合适的 &#34;Scan size&#34; 和 &#34;Count&#34;。使用 1024 x 1024 µm2 的扫描尺寸和 4 到 8 的计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 &#34;Z intensity correction&#34; 面板中设置图像质量以定义组织深度，并将物镜定位至卵巢最顶层（组织中心），调整顶层的采集参数后，点击 &#34;plus&#34; 按钮以定义顶层。
	<ol>
		<li>将物镜向下移动，为组织底部设置适当的 HV 和激光功率，并将最底层信息添加到 Z-intensity correction 表中。点击 &#34;To ND&#34; 以将设置同步至 &#34;ND acquisition&#34; 面板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 &#34;ND acquisition&#34; 面板中，首先设置扫描步数，然后勾选 &#34;Z&#34; 和 &#34;Large Image&#34; 选项。
	<ol>
		<li>进入 &#34;Scan large image&#34; 窗口，借助目镜观察组织形态，根据组织边界定义视野大小。返回 &#34;ND acquisition&#34; 面板，输入扫描区域的大小（&#34;fields&#34;），并选择 10% 至 15% 的重叠率。</li>
		<li>点击 &#34;Run Z correction&#34;，而非 &#34;Run now&#34;，以自动为每一层设置合适的 HV、激光功率和 offset，然后等待图像处理完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 卵泡及其血管系统的三维重建
<ol>
	<li>首先，使用 ImageJ5 打开原始的 NIS 文件。点击 &#34;Image&#34; 按钮，选择 &#34;Color&#34; 和 &#34;Split Channels&#34;。然后点击 &#34;File&#34;，在 &#34;Save as&#34; 中选择 &#34;Image Sequences&#34; 选项，将各通道分别保存为 tiff 文件序列。</li>
	<li>使用 Imaris 打开其中一个 tiff 文件序列。点击 &#34;Edit&#34; 按钮，选择 &#34;Add channels&#34; 以添加其余通道。通道的名称和颜色可在 &#34;Display Adjustment&#34; 选项卡中更改。组织的厚度可能需要在 &#34;Edit&#34; 下拉菜单中的 &#34;Image Properties&#34; 面板中进行校正。</li>
	<li>对最终图像进行 3D 裁剪并去除多余部分时，点击 &#34;Edit&#34; 按钮，选择 &#34;Crop 3D&#34;。可通过拖动边框来调整视野大小。</li>
	<li>要在 Surpass 面板中使用 Filaments 算法重建血管信号，点击 &#34;Filaments&#34; 按钮创建新的 Filament，然后点击下一步。
	<ol>
		<li>为定义血管的最大和最小直径，进入 &#34;Slice&#34; 面板并找到待追踪的血管。在血管最宽处选择两个点后，距离将自动显示在 &#34;Measure&#34; 面板上。</li>
		<li>返回 &#34;Surpass&#34; 面板，输入测得的宽度，然后点击下一步。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整起始点和种子点的阈值。在 &#34;Camera&#34; 面板中选择 &#34;Select&#34;。如果需要删除某些自动生成的球体，按住 Shift 键并点击该点。选择 &#34;Navigate&#34; 并移动鼠标，可旋转结构以确保所有正确点均被保留，然后点击下一步。</li>
	<li>选择最高的局部对比度阈值，然后点击下一步。不要选择 &#34;Detect Spines&#34;，继续完成血管圆柱体的重建。可通过点击 &#34;Color&#34; 选项卡来编辑颜色。重建后的 Filament 的统计学数据可在 &#34;Statistic&#34; 面板中提取。多余部分可在 &#34;Edit&#34; 面板中删除。 
	注：可使用其他算法测量总卵泡或卵泡壁的体积。本研究中，卵母细胞通过两种二抗的自发荧光进行标记。由于数据量较大，数据分析使用了工作站服务器。</li>
</ol>
5. 统计分析
注意：图像分析数据以均值 ± 标准误的形式表示。
<ol>
	<li>使用独立样本 t 检验对卵泡进行比较，并采用 Pearson 相关性检验比较卵泡壁与毛细血管长度的相关系数。以 P &#60;0.05 作为统计学显著性的判定标准。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们采用三维成像技术来评估毛细血管与单个生长卵泡之间的关系。在之前的研究中，我们使用相同的方案9，探讨了大血管系统、卵泡间的相互作用以及卵泡在完整小鼠卵巢中的位置。采用被动CLARITY方法，使我们能够研究微血管和大血管系统、卵泡发生过程，以及黄体与卵泡之间的相互关系，并重建不同发育阶段的卵巢结构。
为了获得完整组织的三维图像数据，透明化处理是首要的重要步骤。目前主要有两种策略——脱水法和基于亲水性试剂的方法，例如被动式CLARITY10。由于脱水法常常导致荧光信号减弱，并产生有毒的有机溶剂废液，因此我们致力于简化被动式CLARITY方法中的若干步骤，以便适用于多种类型的组织样本。
透明化处理过程中的第一个关键步骤是经心灌注。在灌注过程中，心脏泵血对于 PBS 和水凝胶溶液在全身的循环起着重要作用，可有效清除血液，从而降低背景荧光。因此，灌注手术应准确且迅速地进行，以避免在水凝胶完全分布至全身之前动物过早死亡。所有试剂在...

卵泡是卵巢的基本结构和功能单位，其发育与卵巢内的血管系统密切相关。血管为卵泡提供营养物质和激素，因此在卵泡的生长和成熟过程中发挥着重要作用1。
多种技术的结合，包括选择性血管标记物、转基因小鼠模型以及药物开发，增进了我们对卵巢血管网络、血管生成以及血管在卵泡发生过程中功能的认识。卵巢被称为一个活跃的器官，因为在卵泡发生和排卵过程中，它会不断重塑各种组织和血管网络。这种血管在大小和结构上的活跃重塑，对于卵泡的发育和募集等生物学功能至关重要。
传统的卵巢组织切片和血管免疫标记的组织学及组织形态计量学方法仅能提供二维（2D）图像2。随着三维（3D）重建技术的发展，可通过叠加组织切片的二维图像构建三维结构，但该方法仍存在一些局限性——组织切片可能破坏微细结构，部分组织常有缺失，且从切片图像进行三维重建需要大量人力。利用共聚焦显微镜对完整组织进行三维成像可在很大程度上克服上述限制，但这些方法目前仅限于胚胎卵巢血管生成的评估3。采用CLARITY4等完整组织透明化方法可显著增加可视体积，从而解决出生后及成年卵巢中的上述问题，此类方法可在不引起结构变形的情况下实现卵巢的光学透明。对完整卵巢三维结构的成像可为图像分析软件（如本研究中使用的Imaris软件包）提供精确的图像数据库。
成年期卵巢的持续重塑是动态生理系统的一部分，这使得卵巢成为研究血管生成调控机制的理想模型。此外，通过全卵巢组织成像，可以研究卵巢血管在女性生殖系统病理状态（如多囊卵巢综合征或卵巢癌）中的作用。被动型CLARITY技术的发展以及先进图像分析软件的应用，已提供了关于血管与卵泡等卵巢结构之间空间关系的详细信息。

<table><tbody><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Vetec</td><td>v900845</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488（稀释比例 1:50）&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594（稀释比例 1:50）</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>双丙烯酰胺</td><td>Amresco</td><td>172</td><td>http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx</td></tr><tr><td>黑色壁玻璃底培养皿（Willco-Dish）</td><td>Ted Pella</td><td>14032</td><td>http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10004818</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818</td></tr><tr><td>十二水合磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10020318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318</td></tr><tr><td>FocusClear</td><td>Celexplorer</td><td>FC-102</td><td>http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&amp;amp;BRDarea=1</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>http://www.parafilm.com/products</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>国药集团化学试剂</td><td>80096618</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618</td></tr><tr><td>PECAM1/CD31，血小板-内皮细胞黏附分子1（稀释比例 1:10）</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html</td></tr><tr><td>光引发剂 VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10019318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318</td></tr><tr><td>二水合磷酸二氢钠（NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>国药集团化学试剂</td><td>20040718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>国药集团化学试剂</td><td>30166428</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10019718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>国药集团化学试剂</td><td>30188928</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928</td></tr><tr><td>酪氨酸羟化酶（TH，稀释比例 1:50）</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td>http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html</td></tr></tbody></table>

被动clarity透明化小鼠卵巢血管结构的三维重建

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

卵巢是女性生殖系统的主要器官，对女性配子的产生以及内分泌系统的调控至关重要。然而，卵巢复杂的结构关系及其三维（3D）血管架构尚未被充分描述。为了可视化完整卵巢中血管的三维连接与结构，首要的关键步骤是使卵巢在光学上透明。为避免组织收缩，我们采用基于水凝胶固定的被动CLARITY（透明脂质交换-丙烯酰胺杂交刚性成像/免疫染色/原位杂交兼容组织水凝胶）技术对完整卵巢进行透明化处理。随后，结合免疫染色、先进的多光子共聚焦显微镜技术以及三维图像重建，实现对卵巢血管和卵泡毛细血管的可视化观察。通过该方法，我们发现卵泡毛细血管长度与卵泡壁体积之间存在显著的正相关关系（P &#60;0.01）。

我们将被动式CLARITY方法改进为一种快速简便的被动卵巢透明化方法，在保持卵泡和血管结构完整性的同时，最大限度地获得标记血管和卵泡的荧光信号。通过CD31免疫染色（内皮细胞标志物6）确定卵泡血管系统的三维结构。利用Filament算法追踪成年小鼠卵巢中的CD31染色，揭示了卵泡毛细血管与初级和次级卵泡之间的相互关系（图1）。
采用点变换（Spot transformation）和表面算法（Surface algorithms）检测酪氨酸羟化酶免疫染色的卵母细胞以及颗粒细胞层和膜细胞层，并计算卵泡的总体积7,8。由于卵泡排列紧密，部分被裁切的卵泡结构需通过半手动方式识别。在对各个卵泡体积和卵母细胞进行点变换处理后，对卵泡壁各层进行...

本文介绍了一种改良的被动CLARITY与三维重建方法，用于完整小鼠卵巢中卵巢血管系统及卵泡毛细血管的可视化观察。

被动CLARITY透明化小鼠卵巢血管结构的三维重建

卵巢是女性生殖系统的主要器官，对女性配子的生成以及内分泌调控至关重要……

本方案的总体目标是提供小鼠卵巢卵泡中毛细血管分布的完整三维视图，并展示其相互关系。卵巢是生殖和内分泌学中的重要器官。对每种不同发育阶段的卵泡及其体细胞进行计数。此外，与其他器官不同，卵巢的功能单位不表现出重复的分支结构。局部血管系统可能与神经系统一起，在成年女性的每个月经周期中均能发生显著变化。应用卵巢的被动透明化技术，可使我们观察到卵巢中各类细胞与卵泡的整体分布及其相互连接情况。该方法的关键优势在于其对卵巢的影响最小，同时能够清晰显示多种标志物。通过显微图像的重建，我们提供了卵巢的完整图谱，其中血管、神经和卵泡的一些细节均可被清晰观察。 进行图像分析时，使用 Imaris 的某些功能来评估卵巢与各结构之间的关系。根据文章说明配制灌注溶液，并将其置于冰上保存。麻醉小鼠，并确认小鼠无脚趾夹捏反应。喷洒乙醇，于右心房处做一切口，随即以每分钟10 ml的速度用20 ml冰冷的PBS灌注左心室，以彻底清除血液。随后以相同速度用冷羟乙基甲基丙烯酸酯凝胶溶液灌注动物。同时取卵巢及子宫组织，以保持卵巢形态的完整性。将分离的卵巢转移至冰冷的水凝胶溶液中。在体视显微镜下，去除卵巢周围的脂肪组织。为了获得更好的组织固定效果，建议去除卵巢囊膜。将卵巢置于水凝胶溶液中保存三天。三天后，将卵巢转移至玻璃管中，并用新鲜的水凝胶溶液充满管内。用帕拉膜覆盖管口，再用另一层帕拉膜包裹管颈。确保石蜡膜与水凝胶溶液之间无气泡。将玻璃管置于37摄氏度摇床培养箱中孵育两小时，直至凝胶形成。用滤纸小心去除卵巢周围多余的凝胶。将卵巢放入一个15 ml离心管中，并加入10 ml透明溶液至管中。将离心管置于37摄氏度的摇床培养箱中，孵育至少两个月。前3天每天更换透明溶液，之后每周更换一次，直至卵巢组织完全透明。所有免疫染色步骤均在37摄氏度的摇床上进行。首先，用PBST洗涤卵巢24小时。其次，将卵巢在用PBST稀释的一抗溶液中孵育两天。第三，用PBST缓冲液洗去一抗。第四，将卵巢在PBST中与所需的二抗孵育两天。第五，用PBST缓冲液洗去二抗。第六步，将卵巢转移至折射率匹配溶液中以实现折射率均一化。检查其视觉透明度，当卵巢完全透明后即可进行成像。首先，准备一个洁净的玻璃底培养皿。将腻子搓成圆柱形，并弯成马蹄形。将马蹄形外缘紧密按压在载玻片上，形成一个密封空间。腻子的高度应略高于卵巢。将卵巢小心移至中心位置，加入封片液。将培养皿盖在橡皮泥上，并用两块橡皮泥固定。当卵巢准备好成像时，可选用配备16倍物镜的Nikon共聚焦显微镜进行成像。使用共聚焦显微镜成像时，首先在 Ni-E 面板中选择物镜。在采集面板中，选择通道数量。首先使用 Eye Port 选项卡和 XY 控制摇杆，通过显微镜目镜观察，将组织移动至视野中央。其次，在关闭快门光后，点击“Live”选项卡以调节每个通道的激光功率、高压（HV）和偏移量。在“Z Intensity Correction”面板中调整顶层的采集设置，点击加号按钮定义顶层，将物镜向下移动至组织底部，设置适当的高压值和激光功率，然后添加最底层的信息，点击“To ND”以将设置同步至面板并开始采集。在采集过程中，首先设置扫描步数。单击Z轴和大图的标签页。第二步，进入扫描大图窗口，根据组织的边界定义视野大小。第三步，返回ND采集界面，输入扫描视野的尺寸，并选择10%至50%之间的重叠率，然后单击运行Z轴校正，并等待成像过程完成。首先使用imagic打开原始的NIS文件。点击图像按钮，选择颜色和显示通道，然后点击文件，选择图像序列并分别保存为tiff文件。其次，使用Imaris打开其中一个tiff文件。单击编辑按钮，选择添加通道以添加其余部分。名称和颜色可在显示调节中更改。组织的厚度也应在图像属性中进行校正。第三，点击编辑按钮，选择“裁剪3D”以切除多余部分。首先，点击纤维束按钮，然后点击下一步。进入切片面板，找到需要追踪的血管及其距离，然后返回至Surpass界面，输入静态参数，点击下一步。第二，调整起始点和设定点阈值。在相机面板中，选择“选择”功能，按住 Shift 键并点击以去除多余部分。第三，选择最高阈值，然后单击“下一步”。不要选择检测点，直接进入下一步。多余的部可以在编辑面板中删除。通过点击颜色可编辑颜色。通过CD31免疫染色后，研究了卵巢血管系统的三维结构。该三维结构可通过连续切片观察，也可通过整体容积渲染进行观察。已对成年小鼠卵泡血管系统进行CD31染色。通过丝状结构重建毛细血管，我们可以展示各个卵泡与其毛细血管之间的关系。卵巢如同女性一样，始终处于活跃且动态变化的状态。然而，由于传统组织学分析方法的局限性，要描述这些复杂组分之间的相互关系非常困难。新开发的方法——被动透明化技术，可能有助于我们克服光学障碍，保持整个组织的完整性，并提供功能线索。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

无源清清除小鼠卵巢血管构筑的三维重建

本研究介绍了一种可逆组织透明化、免疫染色、三维成像及分析人胎盘绒毛样本中血管网络的实验方案，样本体积约为 1 - 2...

三维重建与分析免疫标记并透明化处理的人类胎盘小叶血管网络

本文介绍了一种无需连续切片即可定量培养后幼鼠卵巢中卵泡数量的实验方案。通过全器官免疫荧光染色结合组织透明化技术，以光学切片取代物理切片。该样品制备与成像方法可保持器官完整性，并有助于对特定细胞进行自动化定量分析。...

培养小鼠卵巢的全组织免疫荧光及卵泡定量

卵巢组织培养可作为卵泡发育、排卵和卵泡闭锁的模型，并揭示动态卵巢过程的调控机制。...

小鼠卵巢组织培养以观察卵巢中的现象

本文介绍、比较并对比了两种用于准确计数固定小鼠卵巢组织卵泡的不同技术。...

成年小鼠卵巢中卵泡的精确计数

本文介绍了一种优化的完整卵巢成像方案，可用于通过整体免疫染色、多光子显微镜以及三维可视化与分析进行定性和定量研究。该方案适用于高通量、可靠且可重复的操作，可用于卵巢功能的毒理学、临床诊断及基因组学检测。...

小鼠卵巢储备发育过程中全卵巢免疫荧光、透明化及多光子显微镜定量三维分析

通过球后注射荧光番茄凝集素后，采用血小板源性生长因子受体β的免疫荧光染色检测视网膜血管中的周细胞。标记后的视网膜经组织透明化处理，并整体封片，以便在共聚焦显微镜下观察围绕视网膜血管的周细胞的三维结构。...

通过免疫染色法对小鼠视网膜血管周细胞进行三维可视化观察

排卵前期卵巢血流的变化对排卵至关重要。多普勒超声已用于人类和大型动物评估卵巢血流动力学和灌注情况。本文介绍了一种在小鼠排卵前期和围排卵期应用多普勒超声评估卵巢血流动力学的实验方案。...

小鼠卵巢血管功能的活体成像与定量多普勒超声检测

Hi-C 方法能够无偏倚地在全基因组范围内鉴定染色质相互作用（1）。Hi-C...

Hi-C：一种研究基因组三维结构的方法

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

我们开发了一个软件平台，利用 Imaris Neuroscience、ImarisXT 和 MATLAB...

一种可量化三维荧光图像中细胞形态变化的分析工具

了解使用无源CLARITY技术对小鼠卵巢血管构筑进行三维重建的方法。该技术可完整显示卵泡毛细血管分布及其与细胞的关系，为研究生殖生物学和卵巢血管化提供重要工具。

被动CLARITY透明化小鼠卵巢血管结构的三维重建

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