合成具有感染性的噬菌体 大肠杆菌-基于细胞的无细胞表达系统

本实验的总体目标是描述如何利用全大肠杆菌无细胞转录翻译系统，从噬菌体基因组合成噬菌体。该方法有助于回答合成生物学领域中的关键问题，例如阐明生命系统中分子自组装的机制。该技术的主要优势在于其平台的多功能性。

许多生物系统可以被完全重现并精细调节以用于实验分析。按照文本方案中的描述，首先准备噬菌斑。使用无菌巴斯德移液管的末端钻取并移除单个噬菌斑。

将噬菌斑吹入稀释的细胞中，然后在37摄氏度下孵育两小时。为检测是否完全感染，取500微升样品加入1.5毫升离心管中，并加入10微升氯仿。

立即高速涡旋混合物，观察溶液是否变澄清，溶液澄清表明噬菌体已感染。待细胞完全感染后，再于37℃孵育两小时。接着，在4℃、8,000 ×g 条件下离心细胞前，加入DNase。

弃去上清液，然后将沉淀重悬于10毫升1× Tris氯化镁溶液中。加入500微升氯仿，高速涡旋振荡以裂解细胞。在4°C下以12,000 × g离心10分钟，澄清溶液。

然后将上清液转移至15毫升锥形管中，并在4°C下保存。通过移液将2.5毫升45%蔗糖溶液加入四个超速离心管中，制备四份5%至45%的蔗糖梯度。在蔗糖层上方加入约2.6毫升5%蔗糖溶液，当液面距离管口约2毫米时停止加样。

使用梯度形成仪器，通过倾斜管旋转混合梯度，86度角下旋转43秒，转速为23 RPM。用1毫升移液器吸取500微升混合的噬菌体悬液，将吸头接触液面，并缓慢将液体 dispensing 至蔗糖梯度顶部，注意避免因快速移液导致混合。在4摄氏度条件下，以70,000 × g离心20分钟。

将钝头套管浸入溶液中，直至管尖对准噬菌体条带最上缘的中心位置。通过拉动注射器活塞，吸出大部分噬菌体条带。随后，将含有悬浮噬菌体的蔗糖溶液分装至三到四个超速离心管中。

用预冷的1×TM缓冲液将离心管加液至距管顶三到四毫米处。用石蜡膜封口后倒置混匀。将离心管放回超速离心机，在4°C条件下以145,000 ×g离心一小时。

迅速倒掉上清液，并将离心管倒置在一次性擦拭纸上沥干。将200至400微升预冷的1×TM缓冲液平均分装至所有沉淀中，于4摄氏度下过夜重悬。无需振荡。

在测定滴度的前一天，将大肠杆菌宿主细胞接种于10毫升LB培养基中，并将培养物置于摇床培养箱中，设置转速为250 RPM、温度为37摄氏度，过夜培养。接下来，用移液器将5.25毫升顶层琼脂、220微升稀释后的噬菌体样品以及50微升宿主细菌细胞加入14毫升的培养管中，配制主混合液。盖紧培养管，高速涡旋振荡。

从37摄氏度的培养箱中取出两块培养皿。然后将2.5毫升的主混合液缓慢加入第一块培养皿的中央。用手轻轻旋转培养皿，使主混合液均匀分布，覆盖整个培养皿表面。

等待20分钟以确保顶层琼脂凝固。将平板在37摄氏度下孵育4至7小时。计数噬菌斑，并确定每个反应样品的噬菌体浓度。

取部分噬菌体储备液，用1XTM缓冲液在新的1.5毫升离心管中稀释至400微升。向该稀释液中加入等体积的Tris饱和酚-氯仿。在实验室摇床上或手动轻轻振荡混合物5分钟。

然后将所得乳状液在台式离心机中以17,000 × g离心5至10分钟。小心移除上层水相至新离心管中，注意不要扰动中间相界面。重复上述步骤两次，共进行三次苯酚抽提。

将水相转移至新离心管中，加入等体积的氯仿。振荡混匀后离心，再将水相DNA样品转移至洁净的离心管中。接着，加入0.4体积的3摩尔乙酸钠和3体积的95%乙醇。

将离心管置于负20摄氏度冰箱中过夜沉淀。在台式离心机中以17,000 × g离心10至15分钟。通过倾倒或移液方式移除并弃去上清液。

然后加入 500 µL 70% 乙醇，轻轻振荡离心管，直至沉淀从管底游离。离心后，小心移除并弃去乙醇，注意不要扰动沉淀。按照前述方法再次加入乙醇并离心后，第二次移除并弃去乙醇，同样注意不要扰动沉淀。

将沉淀在室温下晾干30至60分钟。干燥后，向沉淀中加入50 µL双蒸水，在室温下孵育1小时，或在4 °C下过夜，以重新悬浮。通过测定280 nm处的吸光度来确定DNA浓度。

进行无细胞反应时，将粗提物按终反应体积的33%分装至微量离心管中。按照文本方案中列出的成分配制主混合液，并将各组分的适当体积加入粗提物中。

加入最后一个组分后，通过涡旋振荡使反应体系混匀。然后将主混合液分装至 n 个微量离心管中。接着，向主混合液阵列中加入指定体积的可变组分。

在涡旋振荡前，向每个反应体系中加入水，以达到所需的最终反应体积。然后将微量离心管在29摄氏度下孵育至少八小时或过夜。按照文本方案中所述方法制备用于噬菌体滴度测定的细胞后，对最终的无细胞反应LB溶液进行滴度测定，测定方法如本视频前面所示。

此处展示的是合成φX174噬菌体的无细胞反应的代表性结果。该噬菌斑表明噬菌体反应成功，并在适当稀释倍数下进行了滴定，噬菌斑数量可数，清晰可见。然而，若稀释倍数相对于反应产生的噬菌体产量过低，则即使反应成功，结果也可能显示不佳。

此平板显示了无法计数的噬菌斑数量。图中所示平板由于培养板温度预平衡不足，导致噬菌斑分布不均。在噬菌体滴定过程中，培养基在平板右下区域发生了凝固。

分子拥挤条件对φX174和T7噬菌体的合成具有显著影响。特别是，当PEG浓度从4%（质量/体积）降至2%（质量/体积）时，T7噬菌体的产量下降三个数量级。一旦掌握操作要点，噬菌体纯化和DNA提取可在两天内完成。若无异常情况，无细胞反应仅需数小时即可完成。

观看本视频后，您应充分了解如何培养噬菌体、提取并纯化其DNA，并利用所得产物通过无细胞反应系统重建具有完全感染活性的噬菌体。苯酚操作具有极高危险性，实验过程中应穿戴实验服、护目镜和手套等防护装备。所有涉及苯酚开放容器的操作均须在通风橱内进行。