Name: 传染性噬菌体大肠杆菌-合成基于无细胞表达系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 了解如何利用全大肠杆菌无细胞转录翻译系统从基因组合成传染性噬菌体。该方法可阐明分子自组装机制，为合成生物学研究提供多功能平台。

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本材料基于美国海军研究办公室资助项目 N00014-13-1-0074（授予 V.N.）、人类前沿科学计划资助项目 RGP0037/2015（授予 V.N.）以及美国-以色列两国科学基金会资助项目 2014400（授予 V.N.）支持的研究工作。

注意：以下扩增步骤和提取方法在很大程度上可适用于多种双链DNA噬菌体，例如，T7噬菌体、肠杆菌噬菌体T4或肠杆菌噬菌体λ（L）。这些方法主要用于基因组无法从商业来源 readily 购得的噬菌体。
1. 噬菌体扩增
注意：单斑、多周期（SPMC）噬菌体生产技术在Chen的研究中已对T4噬菌体进行了详细描述， 等14 以下噬菌体扩增与DNA提取方法是一种适用于多种情况的通用方案 大肠杆菌 双链DNA噬菌体， 例如，T7，T4 或 L。该方案的最终成功在很大程度上取决于所选宿主菌株在超感染条件下的耐受能力。如果宿主细胞在超感染条件下不稳定，或未能实现超感染，且在此关键阶段始终未发生裂解，则建议采用完全裂解方案。该方案包括通过高速离心分离细胞碎片，并在超速离心条件下沉淀噬菌体。以下所有条件和参数仅作为一般性起始参考。针对特定实验室的宿主细胞系，最佳条件可能有所不同；应确定并严格遵循适当的实验条件。
<ol>
	<li>准备接种细胞
	<ol>
		<li>在15 mL培养管中接种10 mL LB（Luria-Bertani）培养基 E. coli 宿主细胞， 例如，B 或 K12。</li>
		<li>置于摇床中，设置转速为250 rpm，温度为37 °C，过夜培养至饱和。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单斑、多周期噬菌体增殖与浓缩
	<ol>
		<li>为制备含有感受态噬菌斑的平板，将多个LB-琼脂平板在37 °C下预热1小时，或过夜。</li>
		<li>制备噬菌体原液的多个稀释度（例如， T7、T4 或 L）加入已知浓度的 LB 培养基中，目标为约 ~102-103 噬菌体/mL</li>
		<li>向每块平板中加入100 µL浓缩的宿主细胞过夜培养物。</li>
		<li>选择适当体积的已制备噬菌体稀释液，使其对应每平板 10–100 个噬菌体的范围。将所需体积的噬菌体稀释液分别加入各平板中（例如，100 µL 的 103 噬菌体/mL；此浓度应产生约100个噬菌斑）。将平板置于37 °C培养，并开始计时（+0 h）。培养4–5 h。</li>
		<li>在250 mL锥形瓶中加入49 mL LB培养基，置于摇床中，设置转速为250 rpm，温度为37 °C。</li>
		<li>在 +2.5 h 时，将过夜培养的饱和菌液 1 mL 加入预热的含有 49 mL LB 培养基的锥形瓶中，使细胞稀释 50 倍。当细胞达到对数生长期（+4–5 h）时，测定 600 nm 处的吸光度（OD600). 使用转换 OD 确定细胞浓度600 1.0 = 8 × 108 细胞/毫升</li>
		<li>稀释至 2 x 107 使用额外的LB培养基将细胞稀释至指定浓度（cell/mL）。从培养箱中取出含有噬菌斑的琼脂平板，立即用无菌巴斯德吸管末端切取单个噬菌斑并移除。将噬菌斑吹入稀释的细胞悬液中，于37 °C继续培养2小时（共6–7小时）。</li>
		<li>通过取500 µL样品至1.5 mL离心管中，加入10 µL氯仿（CHCl₃），检测是否完全感染3），并立即高速涡旋振荡。观察溶液是否变得澄清。待细胞完全感染后，再继续孵育2小时（+8-9小时）。 
		注意：如果细胞已完全被感染，它们将迅速裂解（&#60;2 分钟）并澄清溶液。其他结果也被考虑在内。 讨论 部分 如下所述。细胞将被超级感染，但在该阶段之前不会发生裂解。如果开始出现裂解，必须立即加入DNase并开始离心收集，以防止噬菌体降解。</li>
		<li>加入DNase至终浓度为5 µg/mL，在4 °C、8,000 × g条件下离心收集细胞沉淀。弃去上清液。将沉淀重悬于10 mL 1× TRIS氯化镁（TM）缓冲液（50 mM Tris，pH 7.8，10 mM MgCl₂）中2）缓冲液中加入5 µg/mL DNase。加入500 µL CHCL3 高速涡旋以裂解细胞。在4 °C下以12,000 × g离心10分钟，澄清样品。将上清液倾入15 mL锥形管中，于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 噬菌体的纯化
注意：蔗糖纯化的效率在很大程度上取决于噬菌体的大小。需要根据待分离噬菌体的质量进行考量，并相应调整梯度条件。采用本方法可轻松实现超过 1013 噬菌体/mL 的最终病毒滴度。
<ol>
	<li>在1× TM缓冲液中配制12 mL的5%和45%（w/v）蔗糖溶液。</li>
	<li>用移液器将2.5 mL 45%蔗糖溶液加入4支超速离心管中，制备4组4×5-45%蔗糖梯度。然后缓慢加入约2.6 mL 5%蔗糖溶液，直至液面距管口2 mm处停止。 
	注意：将移液器吸头接触蔗糖溶液表面，并非常缓慢地排出液体。较轻的蔗糖溶液会浮在较重溶液上方，形成清晰的界面。若在背光条件下观察，正确分层的溶液界面宽度约为1 mm。</li>
	<li>使用梯度形成仪以23 rpm转速在86°倾斜条件下旋转混匀梯度，持续43秒。若不立即使用，用石蜡膜覆盖后于4 °C保存。</li>
	<li>用1 mL移液器从每根已制备的蔗糖梯度顶部移除500 µL，并将离心管平衡至±0.002 g以内。</li>
	<li>合并所有试管中的噬菌体悬液（步骤1.2.9）。使用1 mL移液器，将500 µL悬液缓慢加入蔗糖梯度顶部，操作时将移液器吸头接触液面，并极其缓慢地释放液体，注意避免因快速移液导致混合。在4 °C下以70,000 x g离心20分钟。 
	注意：将制备好的梯度液平衡至 ±0.002 g 范围内。较小的噬菌体可能需要长达1小时。</li>
	<li>使用无菌注射器和钝头套管切下噬菌体条带。 
	注意：从侧面观察时，噬菌体条带比周围区域更厚且呈乳白色，高度约为5 mm，位于离心管中点位置。
	<ol>
		<li>将钝头套管浸入溶液中，直至管尖对准噬菌体条带最上缘的中心位置。通过拉动注射器活塞，吸出大部分噬菌体条带。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有悬浮噬菌体的蔗糖溶液分装至3-4个超速离心管中，每管体积不超过1.5 mL。用预冷的1× TM缓冲液加至距离管口约3-4 mm处。覆盖石蜡膜后轻轻翻转混匀。将离心管放回超速离心机，在4 °C、145,000 × g条件下离心1小时以沉淀噬菌体。较小的噬菌体可能需要长达2小时的离心时间。</li>
	<li>迅速倒出上清液，并将离心管倒置在一次性擦拭纸上沥干。用无菌棉签擦拭管内壁，去除残留的上清液。</li>
	<li>将200–400 µL预冷的1x TM缓冲液加入所有沉淀中，4 °C下重悬过夜；无需振荡。 
	注意：如果沉淀不干净， 例如， 膜碎片、DNA 等等。，合并后在微量离心机中于17,000 x g条件下进行额外离心。</li>
	<li>滴度测定前一天，准备一管培养物 E. coli 将宿主细胞接种于10 mL LB培养基中，在摇床培养箱中37 °C、250 rpm条件下过夜培养。在对噬菌体原液进行滴度测定前，将适量的培养平板置于37 °C孵育至少1小时。 
	注意：需要孵育的平板数量取决于噬菌体原液所要涂布的稀释度数目：每一种独特的噬菌体原液稀释度需要两个培养平板例如，四种不同稀释度的噬菌体原液需要八个培养皿。</li>
	<li>准备100 mL顶层琼脂，将2.5 g LB培养基和0.6 g细菌琼脂加入100 mL瓶中。用去离子水定容至100 mL，溶解固体成分后进行高压灭菌。灭菌完成后，缓慢倒置瓶体6–8次，使琼脂在溶液中均匀分散。将瓶子置于45 °C水浴中15–20 min，以平衡温度.</li>
	<li>用LB溶液对噬菌体储备液进行系列稀释。
	<ol>
		<li>将990 µL LB加入10 µL噬菌体储备液中，进行100倍稀释。涡旋振荡以混匀。对于10倍稀释，将100 µL噬菌体储备液加入900 µL LB中。涡旋振荡以混匀。</li>
		<li>根据需要重复上述梯度稀释步骤，直至获得可计数数量的噬斑（10-100个噬斑）。 
		注意：为此，需将噬菌体原液稀释的倍数比预期噬菌体产量（以每毫升反应液中的噬菌体数计）低2至3个数量级。例如，若某种噬菌体原液含有1011 每毫升感染性噬菌体，将噬菌体原液在10倍稀释后涂布于平板8倍或109倍比稀释</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备噬菌体滴度测定区域，组装14 mL培养管（培养管数量等于待涂布的噬菌体原液稀释样本数）。将步骤2.12中稀释的噬菌体原液样本和步骤2.10中的宿主菌细胞置于冰上。</li>
	<li>通过移液将5.25 mL顶层琼脂（步骤2.11）、220 µL稀释后的噬菌体样品（步骤2.12）和50 µL宿主细菌细胞（步骤2.10）加入一支14 mL培养管中，配制主混合液。盖紧培养管，高速涡旋振荡。
	<ol>
		<li>将剩余的噬菌体溶液在 4 °C 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从37 °C培养箱中取出两个培养板（步骤2.10）。将2.5 mL主混合液缓慢加入第一块培养板中央（避免产生气泡）。用手轻轻旋转培养板，使主混合液均匀分布，覆盖整个培养板表面。对第二块培养板重复上述操作。静置20 min，确保顶层琼脂凝固。将培养板置于37 °C培养4–7 h。</li>
	<li>计数噬菌斑并确定每个反应样品的噬菌体浓度。 
	注意：噬斑将表现为宿主细胞不透明层上1-2毫米的透明圆圈。参见 图1 用于代表性结果。成功的噬菌体生产将获得终浓度为1012-1013 噬菌体/mL</li>
</ol>
3. 双链基因组DNA提取
注意：必须优化稀释、振荡和离心步骤，以在苯酚相与水相之间形成一层致密、坚实的蛋白质界面层。这将获得纯度最高的基因组，且不含蛋白质污染物。初始稀释倍数取决于最终噬菌体滴度。极高滴度的噬菌体原液（≥1013 噬菌体/mL）在提取前可能需要稀释10-20倍，而低滴度原液（~1010-1011 噬菌体/mL）可能仅需稀释2倍或无需稀释。如果后续步骤中难以形成坚实的蛋白质层，或由于DNA浓度过高导致水相悬浮液过于黏稠而难以操作，则建议在继续提取前对噬菌体原液进行更高倍数的稀释。在任何处理基因组的操作步骤中，吸取水相时务必使用宽口吸头。许多噬菌体基因组较大，容易因移液剪切力而断裂。此外，应明确避免任何涡旋操作，因为这会严重剪切基因组。
<ol>
	<li>取步骤2.9中的部分噬菌体储备液，用1x TM缓冲液稀释至400 µL，置于新的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>向稀释液中加入等体积的Tris:苯酚:氯仿混合液。在实验室摇床上或手动轻轻振荡混合物5分钟。将形成的乳状液在台式离心机中以17,000 × g离心5–10分钟。 
	注意：在下层苯酚相表面可见一层明显的白色蛋白质层。</li>
	<li>小心转移上层水相至新离心管中，注意不要扰动两相之间的界面。</li>
	<li>重复步骤3.2–3.3两次，共进行3次苯酚抽提。将水相转移至新的离心管中，加入等体积的CHCl3。振荡并离心（同步骤3.2）。将水相DNA样品转移至洁净离心管中。</li>
	<li>估计纯化后DNA的体积。加入0.4倍体积的3 M醋酸钠（CH3COONa）和3倍体积的95%乙醇（EtOH）。置于-20 °C冰箱中过夜沉淀。在台式离心机中以17,000 × g离心10–15分钟。 
	注意：DNA会立即脱水，在管中形成可见的悬浮团块。理想的沉淀应为白色且紧密贴附于管底。</li>
	<li>通过倾倒或移液方式弃去上清液。加入500 µL 70%乙醇，轻轻振荡离心管，直至沉淀从管底松动并漂浮。在17,000 × g下离心5分钟。小心移除并弃去乙醇，注意不要扰动沉淀。</li>
	<li>重复步骤3.6。将沉淀在室温下晾干30–60分钟。向沉淀中加入50 µL去离子水（ddH2O），在室温下孵育1小时或4 °C过夜，以充分重悬。通过280 nm处的吸光度测定DNA浓度。 
	注意：采用此方法获得的DNA浓度通常为0.5–5 µg/µL。除以基因组总分子量，可计算出最终的基因组浓度。</li>
</ol>
4. 无细胞噬菌体反应与噬菌体滴度实验
<ol>
	<li>准备25 g LB培养基和15 g细菌琼脂固体，倒入1 L瓶中，加入去离子水至1 L，高压灭菌。</li>
	<li>灭菌后，缓慢倒置瓶身6至8次，注意避免产生气泡。倒置操作可使琼脂固体在1 L溶液中均匀分布。分装到培养皿前，将瓶子置于58 °C水浴中20分钟。</li>
	<li>当LB-琼脂溶液温度平衡后，在培养皿旁点燃火焰以对开放培养皿附近的环境进行灭菌。分装过程中将1 L试剂瓶保持在水浴中，以防止琼脂凝固。向每个100 mm × 15 mm培养皿中加入25 mL溶液。1 L溶液可制备40个培养皿。</li>
	<li>将一个培养皿放置一旁，在室温下静置至少1小时使其凝固，该培养皿用于宿主细胞的接种。其余39个培养皿在室温下静置2天使其凝固，随后于4 °C保存或立即用于滴度测定。</li>
	<li>通过划线法接种相应的细菌菌株来培养宿主细胞（例如， 将保存在 -80 °C 的 T7 宿主菌 B 接种至 LB 琼脂培养平板上。在开放火焰旁划线以避免环境污染物。于 37 °C 培养过夜。该宿主细胞无抗生素抗性，因此必须在无菌环境中操作。</li>
	<li>无细胞反应 
	注意：无细胞的 TXTL 反应体系由 33% 粗提物组成 E. coli 提取物（蛋白质含量为8.9–9.9 mg/mL），其余67%为反应缓冲液和噬菌体基因组。粗提物的制备方法同前文所述。15,16最终反应条件为：8.9–9.9 mg/mL 蛋白质（来自粗提物），3–6 mM Mg-谷氨酸盐，40–100 mM K-谷氨酸盐，2–4% PEG 8000，每种氨基酸 3–4 mM，按前述方法配制17，以及先前所述的能量混合溶液15，包含 0.33–3.33 mM DTT、50 mM HEPES、1.5 mM ATP 和 GTP、0.9 mM CTP 和 UTP、0.2 mg/mL tRNA、0.26 mM CoA、0.33 mM NAD、0.75 mM cAMP、0.068 mM 亚叶酸、1 mM 亚精胺和 30 mM 3-磷酸甘油酸。DNA 型噬菌体所需的基因组浓度为 0.5–10 nM，RNA 型噬菌体则需要 50–150 nM 的浓度范围。最终反应浓度因所合成的特定噬菌体而异，但均落在上述范围内。为确保反应体系充分供氧，最终反应体积应控制在 10–20 µL 之间。反应方案存在细微差异，具体取决于基因组分子的形式。例如，线性基因组分子需要在反应中额外添加组分，以抑制粗提物中存在的 recBCD 酶对线性 DNA 片段的降解。
	<ol>
		<li>完成 &#34;反应细节&#34; 部分在 表1 （PhageTXTL_JOVE），输入反应总数和反应的最终体积。</li>
		<li>通过确定反应中的恒定组分和可变组分来设计实验。输入主混合液的体积分数百分比，即恒定反应组分总体积与最终反应体积和样本数量乘积的比值。在表格中输入反应试剂的储备浓度和终浓度 &#34;主混合反应配方&#34; 在 PhageTXTL_JOVE 中设置实验组。输入待测试的可变试剂的储备浓度和终浓度。 
		注意：反应组分的体积将根据总反应体系的体积以及每个单独反应的终体积自动计算。</li>
		<li>移除所需数量的试管（数量见下文指示） &#34;用于解冻的试管&#34; 从 -20 °C 或 -80 °C 取出 PhageTXTL_JOVE.xlsx 文件中所述的粗制细胞提取物、能量缓冲液混合物和氨基酸混合物，并置于冰上解冻。 
		注意：解冻后，如有必要，可将相同组分的多个等分试样混合。</li>
		<li>将指定体积的粗提物（占最终反应体系体积的33%）分装至微量离心管中。</li>
		<li>按照说明制备主混合液 表1. 在所有组分中进行匀浆处理 &#34;主混合反应配方&#34; 通过涡旋混合。将每种组分的适当体积加入粗提物中。</li>
		<li>若操作的噬菌体具有线性DNA基因组（例如， T7），向反应中加入1 µM的λ噬菌体gam蛋白11涡旋混匀溶液，将反应体系置于冰上5分钟。这一步可抑制粗提物中内源性的recBCD复合物对线性DNA片段的消化。</li>
		<li>按照添加最后一个组分后 表1，通过涡旋振荡混匀反应液。将主混合液分装至 n 微量离心管 
		注意：每个分装体积等于混合液所占百分比与反应终体积的乘积。例如，当混合液所占百分比为90%，反应终体积为12 µL时，每个分装体积为10.8 µL。</li>
		<li>将指定体积的可变组分加入主混合阵列中（参见 表1。加水至各反应体系以达到所需的最终反应体积。通过涡旋振荡使各反应体系混匀。将微量离心管在29 °C孵育至少8小时或过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>宿主细胞预培养 
	注意：将过夜预培养物按50:1稀释，以确保滴定实验所用的宿主细胞处于对数中期，从而提高感染效率。随后将处于对数中期的细胞浓缩10倍，并置于冰上保存。
	<ol>
		<li>使用无菌移液器吸头，将3-5个健康的宿主细胞菌落接种至含有5 mL LB培养基的培养管中。操作时应在火焰旁进行，以避免污染。</li>
		<li>将培养管置于37 °C、250 rpm的摇床培养箱中孵育16小时或过夜。次日，细胞可达到饱和生长期。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>宿主细胞培养及噬菌体滴度测定样品制备
	<ol>
		<li>将50 mL LB培养基加入500 mL锥形瓶中，并用铝箔覆盖。在37 °C下预热20分钟。</li>
		<li>将1 mL宿主细胞过夜预培养物移入预热的LB培养基中，在37 °C、250 rpm振荡条件下培养3–4小时。</li>
		<li>将50 mL宿主细胞培养物在5,000 x g离心10分钟。弃去LB培养基。</li>
		<li>用预冷（4 °C）的5 mL LB重悬沉淀，并置于冰上保存。</li>
		<li>在开始滴定实验前一小时，将培养板置于37 °C孵育。 
		注意：每种独特的噬菌体反应（及相应的稀释倍数）将使用两个平板。此外，另培养4个平板作为实验对照（参见 图1 作为代表性阳性和阴性对照。</li>
		<li>制备100 mL顶层琼脂（步骤2.11）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照第2.12节所述，用LB溶液对无细胞反应体系进行系列稀释。</li>
	<li>噬菌体滴度 
	注意：在培养皿于37℃孵育至少1小时，且顶层琼脂从高压灭菌器取出后已在45℃水浴中保温15–20分钟的情况下，方可开始铺板。
	<ol>
		<li>按照第2节步骤2.14–2.16所述，对最终的无细胞反应-LB溶液进行滴定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明存在以下竞争性财务利益：Noireaux 实验室接受 MYcroarray 提供的研究资金，MYcroarray 是 MYtxtl 无细胞蛋白表达试剂盒的分销商。

参照 Chen 的技术方法， 等14 对于SPMC而言，确定重感染的适当条件是一个关键步骤。最直接影响宿主菌株抵抗重感染能力的参数通常是感染噬菌体的初始浓度。在用极少量噬菌体进行初次感染前，宿主细胞必须处于对数生长期。最终，噬菌体也将进入对数增长期，目标是使噬菌体数量迅速超过细胞数量，从而在每个宿主细胞内形成多个噬菌体拷贝。这会迫使细胞进入一种准稳定状态，使其不发生裂解。如果未能达到此状态，细胞将发生连续、融合性裂解，并释放其病毒载量。若使用上述初始病毒浓度无法实现重感染，应在下一次尝试前将初始感染复数降低十倍。若宿主细胞在收获前已发生裂解且未实现重感染，应立即进行单独的纯化步骤。加入DNase I至终浓度5 µg/mL，并加入500 µL CHCl₃3 以完成全部细胞裂解。继续涡旋振荡额外5分钟，随后在10,000 × g离心以去除细胞碎片。倾出上清液，并在75,000 × g离心1–2小时以沉淀噬菌体，然后在4 °C下用1 mL总体积的1× TM缓冲液重悬过夜，避免振荡。当使用少量细胞检测超感染时，可通过加入氯仿后细胞裂解的速度来判断细胞接近裂解...

在过去十年中，无细胞表达技术已被改造并应用于与合成生物学和定量生物学相关的新兴多学科研究领域中的新用途。最初用于在不依赖活体生物的情况下表达蛋白质，如今已开发出适用于基础科学和应用科学的新一代无细胞转录翻译（TXTL）系统1,2，极大地拓展了该技术的应用范围。新一代TXTL平台被设计得更加用户友好、高效（在批处理模式下蛋白质合成量可达2 mg/mL3）、在转录水平上更具多功能性4，并且具有模块化特性，可轻松整合新的天然或合成功能，从而扩展现有生物系统的功能5,6。特别是，无细胞TXTL系统已成为快速构建遗传程序（如调控元件或小型基因线路7,8,9）的有力工具，可将“设计-构建-测试”周期缩短至数天。值得注意的是，新一代TXTL系统还能够处理大型DNA程序，例如完整合成噬菌体10,11，其性能足以支持由基因组DNA编码的活性生命实体的重建。
与传统方法相比，TXTL系统具有诸多技术优势 体外 构建性的生化测定。无细胞的转录翻译系统（TXTL）在一个简化且开放的环境中将基因表达过程与最终产物相连接，这与活细胞中复杂的细胞质环境不同。TXTL利用DNA重建生化系统。 体外，借助现代DNA组装技术，该方法不仅成本低廉、速度快，而且无需繁琐的蛋白质纯化步骤。无细胞表达系统可直接获取生化反应中的大部分组分，从而能够更深入地解析分子间的相互作用12在无细胞转录翻译（TXTL）反应中，可以随意改变生化与生物物理条件，而这一点在活细胞中几乎无法实现。鉴于这些优势及近年来的技术改进，TXTL技术正日益成为合成生物学与定量生物学领域的一种重要替代平台。随着使用TXTL的研究群体迅速扩大，TXTL正逐步成为生物工程中的标准技术，因此，理解如何使用此类平台至关重要，这有助于建立与TXTL反应操作及结果解读相关的规范实践。
本文介绍了如何利用全 E. coli TXTL 系统，在单管反应中从基因组合成噬菌体11，例如 MS2（RNA，3.4 kb）、ΦΧ174（ssDNA，5.4 kb）和 T7（dsDNA，40 kb）。我们展示了噬菌体合成量如何随反应中某些生化条件（镁和钾浓度）的变化而改变。通过一系列 PEG 8000 浓度模拟的分子拥挤效应对噬菌体合成具有显著影响，可使产量变化达多个数量级。在单个试管反应中实现如此复杂的生化系统，同时重现转录、翻译和自组装过程，不仅有助于回答与生物学和生物物理学10（如基因调控、自组装）相关的基本科学问题，也为开发应用提供了可能，例如重新利用噬菌体功能构建新型纳米结构13。除 TXTL 的实际操作方法外，我们还提供了噬菌体扩增、基因组提取与纯化，以及通过噬斑测定法进行噬菌体定量的技术方案。本论文所介绍的方法适用于使用基于 E. coli 提取物的无细胞系统的科研人员，特别是对噬菌体感兴趣的研究者。
本工作中所展示的实验方案可总结如下：1）噬菌体扩增（第1天：准备接种细胞，第2天：单个噬菌斑、多轮噬菌体增殖及浓缩，第3天：噬菌体纯化），2）双链基因组DNA提取（苯酚/氯仿提取法），以及3）无细胞噬菌体反应与滴度实验（第1天：铺宿主细胞及制备琼脂平板，第2天：无细胞反应及宿主细胞预培养，第3天：宿主细胞培养及噬菌体滴度测定）。

<table><tbody><tr><td>超速离心管</td><td>贝克曼库尔特</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>锥形管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>梯度生成器</td><td>BioComp 梯度生成器</td><td>参见 Anal Biochem. 1985年7月；148(1):254-9。</td><td></td></tr><tr><td>注射器与钝头针头</td><td>Monoject</td><td>8881513918 和 888202017</td><td></td></tr><tr><td>宽口移液器吸头</td><td>菲舍尔品牌</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>噬菌斑计数器</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>菌落计数器型号 C-110</td><td></td></tr><tr><td>培养管</td><td>菲舍尔布兰德</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>无细胞系统</td><td>Mycroarray Inc</td><td>Mytxtl</td><td></td></tr><tr><td>BioComp 梯度仪主控器</td><td>BioComp 仪器</td><td>Model 105ME</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂平板配方</td><td></td><td></td><td>25 g/L LB培养基（LB Broth, Miller - Fisher BioReagents 产品编号 BP1426）和15 g/L Bacto-Agar 固体培养基（Brenton, Dickenson and Company - 产品编号 214010）。</td></tr></tbody></table>

合成具有感染性的噬菌体 大肠杆菌-基于细胞的无细胞表达系统

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

新一代经过工程化改造、具有更高通用性和模块化的无细胞转录-翻译（TXTL）系统，为在试管反应中开展基础与应用科学研究提供了新能力。在过去十年中，无细胞TXTL已成为定量生物学和合成生物学相关多种新兴跨学科研究领域的强大技术。新型TXTL平台特别适用于通过执行合成或天然基因线路来构建和研究生化系统。体外 TXTL已被证明可便捷地快速构建调控元件和生物网络原型，并重现生命系统中存在的分子自组装机制。本文中，我们描述了如何利用全Escherichia coli无细胞TXTL系统，在单管反应中从基因组完全合成感染性噬菌体，例如MS2（RNA）、ΦΧ174（单链DNA）和T7（双链DNA）。通过噬斑实验对三种大肠杆菌噬菌体的合成量进行定量。我们展示了合成噬菌体的产量如何依赖于反应的生化条件。通过精确控制PEG 8000浓度模拟的分子拥挤效应，可使合成噬菌体的数量级发生显著变化。我们还介绍了如何扩增噬菌体及其基因组的纯化方法。本研究中提供的系列实验方案与结果，将对从事无细胞合成生物学与生物工程的跨学科研究人员具有重要意义。

我们展示了四个代表性结果。在图1中，我们提供了一组阴性对照，以确保无细胞的TXTL系统和噬菌体DNA储备液未被活的E. coli细胞污染。我们通过将不含基因组DNA的未孵育和已孵育反应液分别涂板，验证无细胞TXTL系统中不存在完整的E. coli细胞污染（图1A和图1B）。如果无细胞TXTL系统被E. coli细胞污染，则平板上将观察到菌落生长。此外，我们通过将含有噬菌体基因组的未孵育和已孵育反应液进行涂板，进一步验证噬菌体的合成为无细胞反应本身所产生，而非由任何可能的污染细胞所致（图1C和图1D</stro...

新一代无细胞转录-翻译平台已被设计用于构建生化系统 体外 通过基因回路的执行。在本文中，我们描述了如何利用全基因组合成方法，从其基因组合成噬菌体，如MS2、ΦΧ174和T7 E. coli 无细胞的TXTL系统

新一代经过改造、具有更高通用性和模块化的无细胞转录-翻译（TXTL）系统，提供了全新的……

本实验的总体目标是描述如何利用全大肠杆菌无细胞转录翻译系统，从噬菌体基因组合成噬菌体。该方法有助于回答合成生物学领域中的关键问题，例如阐明生命系统中分子自组装的机制。该技术的主要优势在于其平台的多功能性。许多生物系统可以被完整重现并精细调节以用于实验分析。按照文本方案中的描述，首先准备噬菌斑。使用无菌巴斯德移液管的末端钻取并移除单个噬菌斑。将噬菌斑吹入稀释的细胞中，然后在37摄氏度下孵育两小时。为检测是否完全感染，取500微升样品加入1.5毫升离心管中，并加入10微升氯仿。立即高速涡旋混合物，观察溶液是否变澄清，溶液澄清表明噬菌体已感染。待细胞完全感染后，再于37℃孵育两小时。接着，在4℃、8,000 × g 条件下离心细胞前，加入DNase。弃去上清液，将沉淀重悬于10毫升1×Tris氯化镁溶液中。加入500微升氯仿，高速涡旋振荡以裂解细胞。在4摄氏度下以12,000 × g离心10分钟，澄清溶液。然后将上清液转移至15毫升锥形管中，并在4°C下保存。通过移液将2.5毫升45%蔗糖溶液加入四个超速离心管中，制备四份5%至45%的蔗糖梯度。在蔗糖层上方加入约2.6毫升5%蔗糖溶液，当液面距离管口约2毫米时停止加样。使用梯度形成仪器，以86度角和23 RPM的转速倾斜旋转试管43秒，混合梯度。用1毫升移液器吸取500微升混合的噬菌体悬液，将吸头接触液面，并非常缓慢地将液体排加到蔗糖梯度的顶部，注意避免因快速移液而造成混合。在4摄氏度下以70,000 × g离心20分钟。将钝头套管浸入溶液中，直至管尖对准噬菌体条带最上缘的中心位置。通过拉动注射器活塞，吸出大部分噬菌体条带。随后，将含有悬浮噬菌体的蔗糖溶液分装至三到四个超速离心管中。用预冷的1×TM缓冲液将离心管加液至距管口3到4毫米处。用石蜡膜封口后倒置混匀。将离心管放回超速离心机，在4°C条件下以145,000 × g离心1小时。迅速倒出上清液，并将离心管倒置在一次性擦拭纸上沥干。将200至400微升预冷的1×TM缓冲液均分至所有沉淀中，于4摄氏度下过夜重悬。无需振荡。在进行滴度测定的前一天，将大肠杆菌宿主细胞接种于10毫升LB培养基中，并将培养物置于摇床培养箱中，设置转速为250 RPM、温度为37°C，过夜培养。接下来，用移液器将5.25毫升顶层琼脂、220微升稀释后的噬菌体样品以及50微升宿主细菌细胞加入14毫升的培养管中，配制主混合液。盖紧培养管，高速涡旋振荡。从37摄氏度的培养箱中取出两块培养皿。然后将2.5毫升的主混合液缓慢加入第一块培养皿的中央。用手轻轻旋转培养皿，使主混合液均匀分布，覆盖整个培养皿表面。等待20分钟以确保顶层琼脂凝固。将平板在37摄氏度下孵育4至7小时。计数噬菌斑，并确定每个反应样品的噬菌体浓度。取部分噬菌体储备液，用1XTM缓冲液在新的1.5毫升离心管中稀释至400微升。向该稀释液中加入等体积的Tris酚-氯仿。在实验室摇床上或手动轻轻振荡混合物5分钟。然后将所得乳状液在台式离心机中以17,000 × g离心5至10分钟。小心移取上层水相至新离心管中，注意不要扰动中间相界面。重复上述步骤两次，共进行三次苯酚抽提。将水相转移至新的离心管中，并加入等体积的氯仿。振荡混匀后离心，再将水相DNA样品转移至洁净的离心管中。接着，加入0.4体积的3摩尔乙酸钠溶液和3体积的95%乙醇。将离心管置于-20摄氏度冰箱中过夜沉淀。在台式离心机中以17,000 × g离心10至15分钟。通过倾倒或移液方式移除并弃去上清液。然后加入 500 µL 70% 乙醇，轻轻振荡离心管，直至沉淀从管底游离。离心后，小心移除并弃去乙醇，注意不要扰动沉淀。按照前述方法再次加入乙醇并离心后，第二次移除并弃去乙醇，同样注意不要扰动沉淀。将沉淀在室温下晾干30至60分钟。干燥后，向沉淀中加入50 µL双蒸水，在室温下孵育1小时，或在4 °C下过夜，以重新悬浮。通过在280 nm处的吸光度测量确定DNA浓度。为了进行无细胞反应，将粗提物按终反应体积的33%分装至微量离心管中。按照文本方案中列出的成分配制主混合液，并将各组分的适当体积加入粗提物中。添加最后一个组分后，通过涡旋振荡使反应体系充分混匀。然后将主混合液分装至 n 个微量离心管中。接着，向主混合液阵列中加入指定体积的可变组分。在涡旋振荡前，向每个反应体系中加入水，以达到所需的最终反应体积。然后将微量离心管在29摄氏度下孵育至少八小时或过夜。按照文本方案中所述方法制备细胞用于噬菌体滴度测定后，参照本视频前面演示的方法，对最终的无细胞反应LB溶液进行滴度测定。此处展示的是合成φX174噬菌体的无细胞反应的代表性结果。该噬菌斑表明噬菌体反应成功，并在适当稀释倍数下进行滴定，噬菌斑数量可数，结果清晰可见。然而，若稀释倍数过低，无法匹配反应产生的噬菌体产量，则即使反应成功，结果也可能显示不佳。此平板显示了无法计数的噬菌斑数量。图中所示平板由于培养板温度预平衡不足，导致噬菌斑分布不均。在噬菌体滴定过程中，培养基在平板右下区域发生了凝固。分子拥挤条件对φX174和T7噬菌体的合成具有显著影响。特别是，当PEG浓度从4%（质量/体积）降至2%（质量/体积）时，T7噬菌体的产量下降三个数量级。一旦掌握操作要点，若操作得当，噬菌体纯化与DNA提取可在两天内完成。若无异常情况，无细胞反应仅需数小时即可完成。观看本视频后，您应充分了解如何培养噬菌体、提取并纯化其DNA，并利用所得产物通过无细胞反应系统重建具有完全感染性的噬菌体。苯酚的操作具有极高危险性，进行该实验步骤时应穿戴实验服、护目镜和手套等防护装备。所有涉及敞口苯酚容器的操作均须在通风橱内进行。

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