使用层粘连蛋白521基质无整合方法建立人诱导多能干细胞

本方案的总体目标是获得均一的人诱导性多能干细胞。该方法可用于衍生人诱导性多能干细胞，适用于多种用途，包括疾病建模、药物筛选，或为临床前细胞治疗试验提供细胞来源。本方案的优势在于其稳定性好，能够产生均一的细胞，并在用户友好、无异源成分且完全化学成分明确的培养体系中维持培养。

由于人类诱导多能干细胞（iPS细胞）能够重现供体组织的遗传背景，并且有可能分化为任何与疾病相关的细胞类型，因此它们为疾病建模提供了极佳的工具。活检组织解离和克隆挑选是较为复杂的操作步骤。通过观察经验丰富的研究人员进行这些操作，有助于理解实验流程，并更易于重复实施。

今天由来自卡罗林斯卡学院iPS核心设施的两位经验丰富的实验室技术人员Harriet RonnHolm和Kelly Day演示该操作流程。皮肤活检样本可在含1%青霉素-链霉素的PBS中于4摄氏度保存最多48小时，但应在获取后尽快处理。将活检样本转移至35毫米培养皿中。

将皮肤活检组织浸入含有两毫升70%乙醇的35毫米培养皿中，持续30秒。向一个新的35毫米培养皿中加入一毫升含1%青霉素-链霉素的无菌Hank's平衡盐溶液，并将活检组织转移至该培养皿中。随后将活检组织转移至另一个含有1毫升新鲜配制的0.1%dispase溶液的35毫米培养皿中。

使用无菌手术刀片和镊子将皮肤活检组织切成 1 至 2 立方毫米大小的组织块。将含有 Dispase 溶液的活检组织块转移至 15 毫升离心管中，并额外加入 2 毫升 Dispase 溶液。用 1 毫升 Dispase 溶液冲洗 35 毫米培养皿，并将冲洗液转移至 15 毫升离心管中。

将活检组织在4°C条件下孵育过夜。次日早晨，向含有活检组织块的试管中加入4毫升0.1% I型胶原酶，于37°C孵育4小时。在接种细胞前30分钟，用1毫升含0.1%明胶的DPBS溶液包被六孔组织培养板中的一个孔。

室温孵育30分钟。用胶原酶消化4小时后，在室温下以300 × g离心3分钟。吸去上清液，并将沉淀物重悬于2毫升成纤维细胞培养基中。

从先前制备的六孔组织培养板中移除明胶溶液。将细胞悬液（包括任何残留的组织碎片）转移至六孔板中。在37摄氏度、5%二氧化碳及高湿度条件下培养细胞。

当成纤维细胞融合度达到80%时，即可传代至T25细胞培养瓶中。传代次数为第2至第4代的成纤维细胞最适合用于重编程，因为低传代次数的成纤维细胞通常具有更高的重编程效率。用移液器吸去培养瓶中的细胞培养基，并用1 mL DPBS洗涤细胞。

吸除 DPBS，加入 1 毫升 0.5% 胰蛋白酶 EDTA。在 37°C 下孵育 5 分钟，或直至细胞脱落。加入 2 毫升成纤维细胞培养基，重悬细胞，并将细胞悬液转移至 15 毫升离心管中。

在室温下以300 × g离心3分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于2 mL成纤维细胞培养基中。使用血细胞计数板对成纤维细胞进行计数后，将5 × 10⁴个细胞接种至24孔组织培养板的一个孔中。

将细胞在37摄氏度下孵育过夜。次日，由于将操作仙台病毒，请在指定的BSL-2实验室中使用适当的个人防护装备继续操作。吸除细胞培养基，加入250微升仙台病毒溶液。

将培养板在37摄氏度下孵育。在挑取菌落前一天，准备已包被LN-521的24孔组织培养板。向24孔板的每个孔中加入250微升LN-521溶液。

用封口膜密封培养板，于4°C过夜孵育。次日，从24孔板的一个孔中吸除LN-521溶液，并向该孔中加入500 µL E8培养基。在体视显微镜下挑选克隆时，建议佩戴发网和操作口罩。

当菌落直径大于一毫米、边缘清晰且呈均一单层生长时，即可进行挑取。不要挑取边缘模糊以及具有较大、不紧密、异质性细胞团块的菌落。用手术刀将每个菌落以网格状模式切割成较小的片段。

使用 200 微升移液器通过机械方法将细胞层从培养皿上刮下，然后将细胞层转移至预先包被 LN-521 的 24 孔组织培养板的一个孔中。克隆筛选对于本实验方案的成功至关重要。多挑选几个克隆可确保有足够的细胞数量完成贴壁。

让细胞在E8培养基中孵育48小时，期间不更换培养基。当细胞集落直径超过五毫米时，进行酶法传代。吸除细胞培养基，并用250微升DPBS洗涤细胞。

吸除 DPBS，并加入 250 微升解离试剂。在 37 摄氏度下孵育 3 分钟。观察到细胞已开始变圆。

用解离试剂冲洗细胞，使细胞从培养板上脱落。向15毫升离心管中加入500微升E8培养基，并将细胞和解离试剂转移至该离心管中。以300 × g离心3分钟。

从15毫升离心管中吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于500微升E8培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将2.5至5 × 10⁴个细胞接种至另一预先准备的LN-521包被的孔中，孔内含500微升室温E8培养基。加入ROCK抑制剂，使其终浓度为10微摩尔。

将细胞在 37 摄氏度下孵育。采用此方案，人诱导性多能干细胞集落在转导后约第 12 天开始从转导的成纤维细胞中出现。集落通常在转导后约三至四周即可进行挑取。

理想的特征包括扁平致密的细胞团、以均一单层形式生长以及边界清晰。这些明场图像显示了一个早期传代的均一且完全重编程的人诱导多能干细胞系，与一个高度异质性的细胞系进行对比。在第12代人诱导多能干细胞中，由于未检测到仙台病毒载体特异性标志物，证实了仙台病毒载体的丢失，而第3代人诱导多能干细胞中仍可检测到该标志物。

对衍生细胞进行免疫细胞化学染色以检测多能性标志物OCT4、SSEA-4和NANOG，结果显示均为均一阳性。通过逆转录PCR证实了内源性多能性基因的mRNA表达。含有未表达多能性因子的部分重编程细胞的培养物被弃用。

通过拟胚体的形成来评估人iPS细胞的分化潜能。拟胚体分化21天后进行实时PCR检测，结果显示内胚层、中胚层和外胚层特异性标记物的mRNA表达，证实所获得的人iPS细胞具有向三个胚层分化的潜力。一旦掌握该技术，在约16周的时间内实际操作时间约为22小时。

衍生的人类诱导性多能干细胞可分化为成人人体内的任何细胞类型，从而解答与您研究领域相关的各种问题。在观看本视频后，我们希望您能够充分理解如何完成从皮肤活检样本中衍生诱导性多能干细胞所需的各项操作步骤。