基于傅里叶的活体衍射分析 秀丽隐杆线虫

本基于傅里叶的衍射分析方法的总体目标是实时表征秀丽隐杆线虫（C elegans）在三维空间自由运动时的运动行为。该方法可通过描述该物种对不同溶液浓度或运动突变体的响应，回答神经生物学领域中的关键科学问题。本方法为显微物种的傅里叶分析提供了基础参照。

该方法的优势在于，每种微观物种都有其独特的傅里叶谱。尽管该方法可为秀丽隐杆线虫（C elegans）的运动行为提供深入见解，但也可应用于其他微生物。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为在比色皿中、激光束下找到线虫可能具有挑战性。

我们最初在尝试从时间衍射信号本身（一种噪声较大的信号）来了解游泳行为时，产生了本方法的构想。首先，将一台氦氖激光器固定在光学工作台的后左角，并将其连接至电源。在激光器与样品位置之间放置一个中性密度滤光片，使激光束在到达样品前先通过该滤光片。

使用两个前表面铝制转向反射镜，在中性密度滤光片后固定第一面反射镜，构建一个潜望镜系统。然后，在第一面反射镜下方约10厘米处固定第二面反射镜，以留出空间用于引导激光束。将比色皿插入两面反射镜之间，并调整激光束与比色皿的位置，使激光束垂直穿过比色皿。

接下来，将光电二极管固定在第二面反射镜正对面，使其传感器朝向反射镜。然后，将装有水的比色皿放置在支架上。调节支架的高度以及第一和第二面反射镜的角度，使激光束穿过比色皿，并导向光电二极管附近但不直接照射到其表面。

使用杠杆确保支架为比色皿提供一个水平的表面。如果支架不水平，则进行相应调整直至水平。最后，使用提供的USB线将光电二极管连接到数字示波器，并将其连接到计算机。

启动示波器软件，并将采样率设置为至少八赫兹，以充分解析线虫的翻滚周期。使用一根细而扁平的铂金丝挑取工具，将四条成年线虫转移至一个新制的、盛有NGM琼脂的培养皿中。接着，从包装中取出一次性塑料比色皿，注意仅触碰比色皿两侧的防滑纹区域。

然后，使用微量移液器将蒸馏水加入比色皿中，直至比色皿约80%充满蒸馏水。将含有秀丽隐杆线虫（C elegans）的培养皿置于解剖显微镜下。接着，用铂金接种针从培养皿中挑取一条成熟的秀丽隐杆线虫，并将接种针浸入比色皿中。

如有必要，可将接种针划圈移动以使线虫脱离。操作线虫时应轻柔，切勿振荡比色皿。振荡比色皿可能导致线虫失去反应性。

为防止比色皿中产生气泡，先用蒸馏水填充比色皿，直至液面略高于比色皿顶部。然后用水充满瓶盖，并迅速将瓶盖盖在比色皿上。使用镜头纸擦去可能溢出到比色皿外的水滴。

此外，使用镜头纸清除任何残留的微小液滴。打开氦氖激光器，并调节频率设置，使其产生一束红光。然后，打开传感器。

握住比色皿的刻纹侧面，轻轻倾斜，直到线虫大致位于比色皿中心。然后，将比色皿放置在光学系统的支架上，使线虫位于从镜一到镜二传播的激光束中心。接着，将光电二极管置于衍射图样中，使光电二极管的位置与衍射图样的中央主极大不重合。

然后旋转中性密度滤光片，使光电二极管产生明显的电压输出。务必使用中性密度滤光片限制光照强度，以防止光电二极管饱和。平坦的信号线表明已过度饱和或光强不足。

当移动的衍射图样可见后，通过点击软件上的开始按钮，使用光电二极管采集数据，同时控制示波器并监测线虫的运动。持续采集数据，直至线虫移出激光束且衍射图样消失为止。如果比色皿有划痕，应将其与线虫一并丢弃，并重新开始实验。

大约20秒后，单击示波器软件上的停止按钮，结束数据采集过程。将每次试验的数据以逗号分隔值或文本格式保存。每种表型至少采集50组数据，每次试验使用8至10只动物。

此处展示了模拟的线虫连续运动及其对应的衍射图样。模拟得到的衍射图样在定性上与实验图样相似，表明该模拟成功再现了线虫的行为。此外，还可以定量展示滚动型和野生型秀丽隐杆线虫（c elegans）的时间衍射特征。

如图所示，每条线虫的摆动频率和振幅各不相同。通过平均数字傅里叶变换，可根据线虫衍射频率谱的振幅来识别线虫。野生型线虫的频谱以较低频率为主，而滚动运动线虫的频谱则不同。

以下是 w 振荡的一个示例，可将其视为两种相反的海浪运动。相比之下，roller 振荡主要会向一侧形成 c 形式，其形态如下所示。在分析频率时，w 运动更为复杂，显示出比 c 运动更多的次级低频成分。

一旦掌握该技术，若操作得当，采集一个数据集大约只需两分钟。为一系列数据集设置光学系统则大约需要 20 到 30 分钟。在进行该操作时，重要的是要小心处理秀丽隐杆线虫（C elegans），以保持其运动行为的完整性。

通过该实验步骤，我们可以应用其他方法，例如牵引力重构和非线性分析，以更深入地研究秀丽隐杆线虫（C elegans）的运动特性。该技术建立后，为神经生物学领域的研究人员深入研究秀丽隐杆线虫的运动缺陷突变体铺平了道路。观看本视频后，您应能够较好地掌握如何为活体线虫生成衍射图样，以及如何对其进行分析。

请务必注意，使用激光器可能具有极高的危险性，在操作过程中应采取预防措施，例如避免激光束处于眼睛水平位置。