Name: 利用 SuRVoS (超区域体积分割) 工作台进行生物材料的体积分割与分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学习使用SuRVoS工作台对复杂生物体积数据集进行半自动分割，通过超体素创建和模型训练实现精准区域划分。该方法可应用于结构生物学和材料科学领域的三维数据分析。

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我们谨向贝勒医学院的 Rui Wang 和 Wah Chiu 致以感谢，感谢他们提供冷冻电子断层扫描数据集；同时感谢钻石光源的 Andrew Bodey 在 I13 线站机时方面的协助。本研究的部分工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（编号：P41GM103832）的支持。我们感谢钻石光源共同资助了 Imanol Luengo 的博士研究（项目编号：STU0079）。

注意：每个处理步骤的参数通常适用的范围以及此处所示每种数据类型的具体参数见表1。
1. 准备工作区并加载数据
<ol>
	<li>启动 SuRVoS Workbench，点击打开数据集按钮，在弹出的窗口中选择要分割的数据文件。选择数据集的合适方向。接下来，选择或创建一个用于存储工作区及关联文件的文件夹。建议在开始新分割时该文件夹为空。数据加载完成后，工作区将打开，左侧为插件面板，右侧为可视化面板，两个面板之间显示一组工具快捷方式（图 1）。</li>
</ol>
2. 预处理与数据表示
<ol>
	<li>在“选择感兴趣区域”选项卡中，输入感兴趣区域的 z、y 和 x 起始与结束坐标，然后点击“添加”。为选择合适的 y 和 x 坐标，可将鼠标悬停在图像上的某一点。使用可视化窗格顶部的滑块选择 z 坐标。添加区域后，通过勾选右侧复选框确保该区域已被选中。所有后续计算将在所选区域内进行。通常建议先从一个较小但具有代表性的感兴趣区域（ROI）开始，优化参数后，再将这些参数应用于整个待分割区域。</li>
	<li>在“特征通道”选项卡中，使用顶部的下拉菜单选择一个特征/滤波器并将其添加到队列中（有关特征通道的更多信息，请参见讨论部分）。添加特征/滤波器后，通过点击其名称进行选中，然后修改该特征/滤波器特有的选项，并选择用于运行该特征/滤波器的输入数据集。当所有选项设置完成后，点击特征/滤波器名称右侧的复选框以执行计算。
	<ol>
		<li>为优化新数据集的参数，可在计算前依次添加多个滤波器/特征，并为其设置相应参数。具体操作为：逐个添加新的滤波器/特征，设置合适的参数，勾选每个待运行的滤波器/特征左侧的复选框，然后点击窗格顶部的“计算特征”按钮。更多详细信息请参见讨论部分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 生成合适的超区域
<ol>
	<li>在“超级区域”选项卡的“超体素”部分，使用源下拉菜单选择将用于创建超体素的过滤后数据集。然后指定超体素的形状、间距和紧凑度（详见讨论部分及图2）。最后，点击应用按钮以生成超体素。超体素创建完成后，可在可视化窗格中查看，并通过“可视化”选项卡及查看器窗口快捷方式控制其显示/隐藏状态和透明度。</li>
	<li>在“超级区域”选项卡的“兆体素”部分，使用源下拉菜单选择将用于创建兆体素的过滤后数据集。接着，设定兆体素的 lambda、numBins 和 Gamma 参数（详见讨论部分）。兆体素创建完成后，可在可视化窗格中查看，并通过“可视化”选项卡及查看器窗口快捷方式控制其显示/隐藏状态和透明度。</li>
</ol>
4. 注释简介
<ol>
	<li>在“注释”选项卡中，使用“添加层级”按钮来添加一个注释层级。添加层级后，可在该层级中使用“添加标签”按钮为注释添加标签。添加后，可修改标签的名称和颜色，以便于进行注释。</li>
	<li>接下来，为开始注释，请从工具快捷区域选择笔形图标。选择后，可视化窗格顶部将显示一组选项。这些选项用于控制笔触宽度，以及选择使用体素（voxels）、超体素（supervoxels）或大体素（megavoxels）进行注释。
	<ol>
		<li>为模型训练目的，通常应在“注释层级”下拉框中选择“超体素”（supervoxels），并使用中等至较大的笔触宽度。在注释选项卡中，通过勾选标签信息最右侧的复选框来选择要注释的标签。然后，在可视化窗格中单击以注释单个超体素，或单击并拖动以同时注释多个超体素。 
		注意：可在“注释层级”下拉框中选择体素（voxels）或大体素（megavoxels），并以相同方式进行注释。使用大体素时，单次鼠标点击即可分割成千上万个相似的体素。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 利用模型训练进行分割，并以微计算机断层扫描数据集演示。
注意：对于许多数据集而言，首次分割的目的是区分多个较大的区域。例如，将细胞核与细胞质分开，或将细胞与外部的冰层和支持结构分离。对于此类具有清晰边界和较大区域的分割，模型训练非常有用。为演示这一点，将使用牛筋草的X射线相衬断层扫描数据。
<ol>
	<li>加载数据，使用滤波器和特征套件进行预处理，并参考表1中的参数，按照上述章节所述确定合适的超体素（supervoxels）和/或巨体素（megavoxels）。继续使用表1中的参数以及第4节中的说明，对数据集的某些大区域进行粗略标注，如图3所示。 
	注意：此时无需完成整个数据集的分割。</li>
	<li>在“模型训练”选项卡中，将预测层级设置为包含手动训练标注的层级，并在描述符部分将区域设置为“超体素”（Supervoxels）。接着，在“选择源”（Select Sources）下拉菜单中点击并勾选所选的特征和滤波器，以确定用于区分数据不同区域的描述符（参见表1及相关讨论）。</li>
	<li>然后，点击“预测”（predict）按钮。计算完成后，可视化面板将更新，显示所有未标注体素的预测结果，指示它们被预测归属于哪一类标注。通常情况下，每种分类器方法的默认参数已提供良好的起点，用户一般只需在不同分类器之间切换以找到最佳匹配。然而，对于专业或有经验的用户，可访问并修改每种分类器的可选参数。</li>
	<li>在评估不同训练方法的效果并选择其中一种后，可在“优化”（Refinement）部分点击“优化”（Refine）下拉菜单进行进一步优化。在“模型训练”选项卡底部的&#34;更新标注&#34;区域中，确保可视化下拉菜单设置为“预测结果”（Predictions）。使用置信度滑块，将更多或更少的未标注超体素分配给选定的标注标签。</li>
	<li>根据视觉检查选择合适的置信度水平后，使用“置信度工具”底部各标签旁边的“保存”（Save）按钮，将预测结果保存到特定标签中。可视化面板将随之更新以显示更改。每个标签可单独保存；实际上，还可通过在“From”和“To”的 z、y、x 输入框中设定数值，对较小的子区域分别点击每个标签的“保存”按钮来保存标签。</li>
	<li>如存在少量误标注，可按照第4节所述提供额外的训练数据进行修正。在将适当的预测结果添加至标签后，重复模型训练、优化以及添加高置信度预测的过程，直至所有超体素均被标注。该方法有效的原因在于，每次运行模型训练时，可用于训练的已标注超体素数量增加，因此随着迭代次数增加，模型性能将变得更加稳健。</li>
</ol>
6. 使用超区域进行分割，以冷冻电子断层扫描数据集为例演示。
注意：由于超区域分割适用于较小且边界分明的区域，此处的重点是分割该数据集中的细胞器和微管。采用模型训练快速分割血小板与背景中的冰和碳；这些参数不再进一步讨论，但已在表1中列出。
<ol>
	<li>加载数据，使用滤波器和特征套件进行预处理，并参照表1中的参数，按照上述章节所述确定合适的超体素（supervoxels）和/或兆体素（megavoxels）。</li>
	<li>在标注标签页中添加适当的层级和标签，选择一个标签后，在选中超体素（supervoxels）的情况下，使用中等笔宽开始标注。需注意，对于空间上彼此邻近的对象，应选择不同的标签，以避免将其误标为同一对象。</li>
	<li>为进一步优化标注结果，可使用形态学优化方法（膨胀、腐蚀、开运算、闭运算和填充孔洞）。这些选项位于“标注”（Annotations）标签页底部。使用时，先选择待处理的分割标签和优化方法，输入半径值并选择应用方式，然后点击“优化”（refine）。</li>
</ol>
7. 基于内在特征对数据对象进行分类与分析——以冷冻软X射线断层成像数据集为例
注意：通常情况下，分割后的下一步是对数据进行分析。SuRVoS 中的标签拆分工具可根据对象的内在特征（如对象的平均强度、方差、体积或位置）对已分割的对象进行分类。标签统计工具则可用于可视化每个新对象类别之间这些度量指标之间的关系。这些是分割完成后分析复杂三维数据集的强大新工具。
<ol>
	<li>加载数据，使用滤波器和特征套件进行预处理，参照表1中的参数，确定合适的超体素（supervoxels）和/或巨体素（megavoxels），并按照上述章节所述方法进行分割。</li>
	<li>完成分割后，点击可视化面板中的第二个标签页“Label Splitter”（标签拆分器）。此时窗口右侧将新增一个区域——“Rule Creation pane”（规则创建面板）。</li>
	<li>在该区域顶部，选择用于标签拆分的适当层级和标签。然后选择要查询的数据集，并点击“Label”（标注）。所有选中标签中的对象现在将在可视化面板中以蓝色轮廓线标出，作为独立对象显示，同时在规则创建面板中显示这些对象的平均强度图。如需更改图中显示的测量指标，可点击右侧顶部的下拉框进行选择。</li>
	<li>为开始将对象划分为相关类别，请在规则创建面板底部点击“add new label”（添加新标签）。该新标签关联的名称和颜色可按前述方法进行修改。
	<ol>
		<li>点击“Add new rule”（添加新规则），利用下拉菜单和自由输入框定义要应用的规则。点击“Apply”（应用）以在可视化面板和规则创建面板的图表中查看新规则的效果。单个标签可应用多条规则，同一数据集中也可创建多个标签。 
		注意：若需收集所有未标注的对象，请创建一个新标签，不添加任何规则，而是点击“Select Others”（选择其他）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当目标对象已被拆分为新的标签后，在“Annotations”（注释）标签页中创建一个新的空层级。然后在规则创建面板中选择该层级，并点击“Save labels”（保存标签），将新标签保存至该空层级中。</li>
	<li>在可视化面板边缘，点击“Label Statistics”（标签统计）标签页。这将打开一个新的可视化面板，可用于初步分析数据中不同对象类别之间的关系。在顶部选择适当的层级、标签以及要查询的数据集。
	<ol>
		<li>通过勾选对应复选框选择若干感兴趣的测量指标，然后点击“Label”（标注）。系统将为所选的每个指标生成成对比较图。如需更新图表，请勾选或取消勾选相应指标，然后点击“Update plot”（更新图表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 导出数据与分割结果
<ol>
	<li>在“可视化”窗格的“标签统计”选项卡中，分别单击“导出图表”和“导出数据”，以导出图表和原始测量数据。</li>
	<li>在“插件”窗格中单击“导出”选项卡，以导出图像数据和分割结果。首先，单击选择一个数据保存的文件夹。接着，选择输出类型（原始数据、原始标注、分割掩膜或掩膜处理后的数据）和格式（HDF5、MRC 或 TIFF）。最后，使用复选框选择要导出的标注层级，然后单击“导出”。根据需要，可在导出前对数据进行缩放或反相处理。在导出掩膜处理后的数据时，可通过下拉菜单选择将应用掩膜的一个或多个数据集。</li>
</ol>

<ol><li>DiamondLightSource/SuRVoS: Version 1.0. Zenodo. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/247547">https://zenodo.org/record/247547</a> (2017).</li>
<li>SuRVoS Workbench - Super Region Volume Segmentation. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/">https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/</a> (2017).</li>
<li>Frangakis, A. S., Förster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+exploration+of+structural+information+from+cryo-electron+tomograms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Computational exploration of structural information from cryo-electron tomograms.</a> Curr Opin Struct Biol. 14 (3), 325-331 (2004).</li>
<li>Lucić, V., Förster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+studies+by+electron+tomography%3A+from+cells+to+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li>
<li>Lučič, V., Rigort, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography%3A+the+challenge+of+doing+structural+biology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ.</a> J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).</li>
<li>Milani, M., Drobne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+manipulation+and+ultramicroscopy+of+unprepared+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam manipulation and ultramicroscopy of unprepared cells.</a> Scanning. 28 (3), 148-154 (2006).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), (2004).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+segmentation+of+electron+tomograms+for+a+quantitative+description+of+actin+filament+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks.</a> J Struct Biol. 177 (1), 135-144 (2012).</li>
<li>Förster, F., Han, B. -G., Beck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymolb%22%5BJournal%5D)">Visual Proteomics.</a> Meth Enzymolb. 483, 215-243 (2010).</li>
<li>Liu, Y., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+cryo-EM+particle+selection+for+membrane+proteins+in+spherical+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automatic cryo-EM particle selection for membrane proteins in spherical liposomes.</a> J Struct Biol. 185 (3), 295-302 (2014).</li>
<li>Asano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+census+of+26S+proteasomes+in+intact+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A molecular census of 26S proteasomes in intact neurons.</a> Science. 347 (6220), 439-442 (2015).</li>
<li>Garduño, E., Wong-Barnum, M., Volkmann, N., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+of+electron+tomographic+data+sets+using+fuzzy+set+theory+principles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Segmentation of electron tomographic data sets using fuzzy set theory principles.</a> J Struct Biol. 162 (3), 368-379 (2008).</li>
<li>Sommer, C., Straehle, C., Köthe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.394.8442&rep=rep1&type=pdf">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE Int Symp Biomed Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).</li>
<li>Darrow, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Mechanisms+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Suppression+by+the+Synthetic+Chaperonin-like+CCT5+Complex+Explained+by+Cryoelectron+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural Mechanisms of Mutant Huntingtin Aggregation Suppression by the Synthetic Chaperonin-like CCT5 Complex Explained by Cryoelectron Tomography.</a> J Biol Chem. 290 (28), 17451-17461 (2015).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+reveals+ultrastructure+alterations+in+platelets+from+patients+with+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography reveals ultrastructure alterations in platelets from patients with ovarian cancer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (46), 14266-14271 (2015).</li>
<li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRiC%27s+tricks+inhibit+huntingtin+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> eLife. 2, (2013).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+virus+assembly+intermediates+inside+marine+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing virus assembly intermediates inside marine cyanobacteria.</a> Nature. 502 (7473), 707-710 (2013).</li>
<li>Sandberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Image+Segmentation+in+Cellular+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for Image Segmentation in Cellular Tomography.</a> Methods Cell Biol. 79, 769-798 (2007).</li>
<li>Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Segmentation+and+Interpretation+of+Electron+Tomographic+Reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for Segmentation and Interpretation of Electron Tomographic Reconstructions.</a> Methods Enzymol. 483, 31-46 (2010).</li>
<li>Tsai, W. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Voxels+to+Knowledge%3A+A+Practical+Guide+to+the+Segmentation+of+Complex+Electron+Microscopy+3D-Data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li>
<li>FEI. Amira & Avizo 3D: Software for Scientific and Industrial Data. , Available from:
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<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+Visualization+of+Three-Dimensional+Image+Data+Using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Nguyen, H., Ji, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape-driven+three-dimensional+watersnake+segmentation+of+biological+membranes+in+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+trans+med+imaging%22%5BJournal%5D)">Shape-driven three-dimensional watersnake segmentation of biological membranes in electron tomography.</a> IEEE trans med imaging. 27 (5), 616-628 (2008).</li>
<li>Rusu, M., Starosolski, Z., Wahle, M., Rigort, A., Wriggers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tracing+of+filaments+in+3D+electron+tomography+reconstructions+using+Sculptor+and+Situs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated tracing of filaments in 3D electron tomography reconstructions using Sculptor and Situs.</a> J Struct Biol. 178 (2), 121-128 (2012).</li>
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<li>Luengo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SuRVoS%3A+Super-Region+Volume+Segmentation+Workbench%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation Workbench.</a> J Struct Biol. 198 (1), 43-53 (2017).</li>
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<li>Palenstijn, W. J., Batenburg, K. J., Sijbers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+improvements+for+iterative+electron+tomography+reconstruction+using+graphics+processing+units+%28GPUs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Performance improvements for iterative electron tomography reconstruction using graphics processing units (GPUs).</a> J Struct Biol. 176 (2), 250-253 (2011).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-Axis+Tomography%3A+An+Approach+with+Alignment+Methods+That+Preserve+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-Axis Tomography: An Approach with Alignment Methods That Preserve Resolution.</a> J Struct Biol. 120 (3), 343-352 (1997).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

SuRVoS 工作台与其他分割程序的不同之处在于，在开始实际分割之前，优化参数是一个必要且重要的步骤。在一些手动或半手动分割程序中，用户在新建项目后几分钟内即可开始分割。而对于 SuRVoS，由于程序将自动分割大部分体数据，且边界由程序划定，仅需极少的用户输入，因此参数优化对于成功分割至关重要。具体而言，特征通道和超区域构建是需要重点关注的两个方面。
特征通道与模型训练
除了原始数据外，SuRVoS 还允许用户基于现有数据集创建额外的数据集或通道。这些通道可通过一系列计算方法或特征提取器生成。所有数据表示均可并行获取，并可单独显示，以评估特征或滤波器应用的效果。由于这些特性，它们在 SuRVoS 中被称为特征通道。SuRVoS 提供了多种特征通道选项。有关此处所用选项和参数的信息，请参见表 1；如需可用特征通道的完整列表及描述，请访问 https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/ 2。首先，对于噪声较多的数据集，建议使用高斯滤波器或全变分滤波器进行去噪。通常建议以其中一种去噪后的数据集作为数据源，进一步进行特征通道以及超体素/兆体素的计算。一般情况下，全变分去噪后的数据集被用作特征通道及超体素/兆体素计算的源数据。建议首先使用默认参数运行，然后在三维视图中评估结果，最后针对该数据集迭代优化参数。此外，特征通道还可组合成&#34;滤波器集合&#34;，以特异性地分离数据集中的某些特征，随后可将这些集合用作生成超体素和兆体素的数据源。尽管该策略高度依赖于具体数据集，但在某些情况下可能具有显著优势。
特征通道在模型训练中也被用作分类器的训练来源。在选择使用哪些特征通道时，建议选用几个稳健的特征通道（例如，当使用少量标注数据来训练分类器时，可采用来自斑点检测、纹理与结构或鲁棒特征类别的特征。当拥有大量训练数据时，建议总体上使用更多的特征通道，可来自任意类别，只要这些特征能为分类器提供多样化的信息即可例如，将局部特征和高斯特征类别的特征通道添加到上述列表中。
模型训练主要包括三个部分：提供描述数据的输入数据源，利用这些输入训练分类器，以及最终优化输出预测结果。通常，数据中较小的区域需要更多的用户标注才能准确训练分类器，而较大的区域则需要较少的用户标注。可先在不选择优化条件的情况下进行模型训练，以获得最佳预测结果；然后加入优化条件，并根据需要调整 lambda 参数，以修正预测结果中的问题，例如孔洞或锯齿状边缘。
超体素与巨体素
超体素（supervoxel）是多个邻近且相似的体素（voxel）组成的簇38,39。超体素最初是一个标准的三维网格，覆盖在数据之上，随后通过迭代变形以贴合数据中的底层边界，从而更准确地表示数据。超体素的生成与变形由四个用户输入参数控制：数据源、超像素形状、间距和紧凑度。数据源提供在生成超体素过程中被查询的数据输入，任何来源的数据均可使用，包括经过滤波处理的数据源。超像素形状参数决定初始三维网格以及最终超体素的大致期望形状。调整这些参数可在变形前增大或减小超体素的尺寸。间距参数定义各个方向上边界的相对重要性。调整这些参数可突出一个或两个方向上的边界，而牺牲其他方向，这意味着生成的超体素将更倾向于沿指定方向的数据边界进行变形。最后一个参数——紧凑度，控制超体素可变形的程度。较低的紧凑度数值允许超体素发生更大的变形。应优化这些参数，以获得能够准确反映目标数据边界的超体素。注意：当前，超体素形状参数的乘积必须等于或小于1024。
在某些方面，超体素参数可以相互补偿，因此在确定参数时并不存在唯一的&#34;正确答案&#34;。例如，较大的起始网格（e.g. 超像素形状：10 × 10 × 10）与较低的紧凑度数值（例如 20），可能产生与较小的起始网格（e.g. 超像素形状：5 × 5 × 5）和较高的紧凑度数值（e.g. 50）相似的边界贴合度。由于第二种情况下的超体素数量更多且体积更小，因此它们在表示边界时无需发生显著形变。这两组参数均可适用于该数据集的分割。
选择超体素参数时最重要的考虑因素是超体素对数据的表征程度。如图2D所示，单独显示超体素（其下方不叠加原始数据）是评估超体素参数的一种有效方法。以这种方式显示时，数据中形状的边缘和轮廓在超体素中仍应清晰可见。
兆体素（megavoxels）是由多个相邻且相似的超体素（supervoxels）聚合而成的结构38,39。其生成过程同样由四个用户输入参数控制：数据源（data source）、lambda、numbins 和 gamma。与超体素类似，数据源为创建兆体素时所查询的数据输入提供支持。lambda 和 numbins 均会影响兆体素的大小及其对边界的贴合程度。当兆体素增大（lambda 值高，numbins 值低）时，其对边界的贴合能力会下降；反之，当兆体素较小（lambda 值低，numbins 值高）时，边界贴合能力增强。然而，随着兆体素尺寸减小，其在快速分割大量体素方面的实用性也随之降低。可选参数 gamma 用于控制两个超体素合并时平滑因子与合并代价之间的权衡。较小的 gamma 值可增强两个超体素之间的相似性，但总体生成的兆体素数量会减少。
与超体素类似，在选择和优化巨体素参数时，最重要的考虑因素是巨体素对数据的表征程度。可以再次采用如超体素所述的方法，单独显示巨体素以评估参数。然而，由于巨体素通常要大得多且具有三维特性，建议使用标注工具选择单个巨体素，以确保感兴趣区域之间的边界紧密贴合。
注释策略
已描述了两种通用的标注策略：模型训练方法适用于划分数据集中的大范围区域，而超区域分割方法则适用于较小且更具多样性的特征，例如单个细胞器。标注可以采用分层方式组织，从而能够首先标注大范围区域，然后通过父子关系将其细分为更具体的子区域。通过点击标签颜色选择区域右侧的空白处，并从上一级中选择适当的父级标签，即可为当前标签指定其父级标签。在实际应用中，大多数数据集会同时使用模型训练和超区域分割这两种策略，以分割出特定的兴趣区域或特征。
在此模型训练示例中，使用了少量训练输入（以用户手动基于超体素标注的形式），应用于数据中三个等间距的切片上。通过这种方式，SuRVoS 的模型训练部分极大地提高了分割速度，尤其是在处理大型且具有明显差异的区域时，例如鹅肠草子实体中不同区域之间的分界，如图3所示。
在模型训练过程中，如果无法看到预测结果，可能需要进入“可视化”（Visualization）选项卡，确保已启用“预测”（Predictions）图层，并将其设置为适当的透明度。此外，置信度为0时，系统会根据最接近的匹配结果，为每个未标记的超体素分配一个标签；置信度为100时，仅当某一类标签存在比例匹配时才会分配标签。介于0和100之间的置信度则是这两种极端情况之间的权衡。在选择置信度水平时，建议检查若干切片，通过视觉评估确认在将预测结果保存为标签之前不存在错误预测的体素。
使用超区域进行标注的一个有效策略是：利用放大工具放大数据，在单个切片上同时标注几个细胞器，使用一个 &#34;快速，杂乱&#34; 方法优先（图4C）。接着，在Z轴方向上下移动几个切片，并重复此过程。由于超体素是三维的，许多此类缺陷 &#34;杂乱&#34; 通过上层或下层切片中的标注来固定该方法，从而加快分割速度，且边界由超体素提供，而非手动划定。
为了优化标签，已提供标准的分割细化选项。膨胀会使选定的分割标签按给定半径向外扩展，腐蚀则使其向内收缩。开运算和闭运算分别指先腐蚀后膨胀、或先膨胀后腐蚀的操作。填充孔洞功能则专门用于填补分割区域内的空洞。这些操作的执行顺序至关重要。通常，先执行填充孔洞，然后进行开运算，最后进行膨胀，效果较好。每种细化方法均可应用于单个切片（&#34;本切片&#34;）、所有二维切片（&#34;所有切片（2D）&#34;）或三维整体数据（&#34;整个体积（3D）&#34;）。推荐使用“所有切片（2D）”模式。
意义与未来研究方向
高效且准确的分割是处理三维数据集的下一个瓶颈，尤其是在长时间运行过程中常规自动化采集的图像数据达到太字节量级时。SuRVoS Workbench 可将分割速度较手动分割提高5倍。此外，由于边界由超体素（supervoxels）界定，所得分割结果的变异性应有所改善。未来，我们希望探索利用代表性三维感兴趣区域的分割结果作为训练数据，以高置信度将其应用于其余体积，甚至其他独立体积的方法。这一进展将进一步减少分割复杂生物体积所需的人工时间和干预，有助于缓解图像处理与分割的瓶颈问题。这反过来将使得在不同状态下（例如非疾病状态、疾病状态、治疗后状态）的生物数据能够基于可靠的实验数据进行定量比较。

SuRVoS 工作台是一款软件，旨在帮助研究人员从各种样本的体数据中提取科学上相关的信息，而无论其感兴趣的结构、分辨率或成像方式如何1,2。此类体数据通常通过X射线或电子断层扫描系统采集，由于系统复杂，这些设备通常位于大型实验室或集中式设施中。这两种方法以及其他技术所产生的数据集通常体量庞大且信息丰富，使用半自动方法或手动方式进行分割均具有挑战性。特别是接近天然状态的冷冻固定样本数据集，需在低剂量成像条件下获取，导致信噪比较低、对比度较差，尤其是在冷冻电子断层扫描（cryoET）中表现更为明显3,4,5。此外，某些三维数据集中还存在由实验条件困难所引入的伪影，例如由于倾斜角度范围有限而导致的缺失楔形伪影，从而造成信息缺失以及沿电子束方向的拉伸现象3,4,5。即使在信噪比低或缺失楔形伪影不显著的情况下（例如聚焦离子束扫描电镜6或连续块面扫描电镜7），样本本身的复杂性和三维特性，以及庞大的数据量，仍使得数据分析需要借助自动化的数据分割流程以提高效率和准确性。
目前，在分析细胞的生物体积时，有许多方法可自动或半自动地识别特定的细胞结构，例如使用基于模板的搜索来识别肌动蛋白、微管或特定蛋白质复合物，或在特定类型的数据集中识别这些结构例如 高对比度、染色、树脂包埋样品8,9,10,11,12。然而，在这些情况下 先验的 信息或特定的样品制备方案是必需的，这限制了这些分割策略的广泛应用。此外，还有一些工具可在体素水平上进行模型训练，当提供用户输入时，能够学习各种目标结构的形态特征。13然而，在这一层面上，模型的训练与测试过程较为复杂，容易出错且计算成本高昂。鉴于成像条件的挑战性，以及缺乏广泛适用的半自动分割策略，即使在处理复杂的生物材料时，手动分割仍十分常见。14,15,16,17然而，普遍认为手动分割过程不仅耗时，而且容易出错、具有主观性且结果不稳定4,5,18,19,20某些分割程序提供了可简化手动分割过程的工具（即 插值、套索或吹气工具21,22然而，在数据集噪声较大的情况下，这些方法难以成功应用，即使能够成功应用，该过程仍然具有主观性和变异性。
传统上，图像分割以两种截然不同的方式被使用：定性或定量。随着成像技术和分割策略的进步，将分割作为定量工具来回答生物学问题，并作为算法开发的&#34;金标准&#34;的做法已越来越普遍8,12,15,23,24,25。为此，必须进行详细的核查与制衡，以降低整个过程中的变异性与主观性26。然而，这些预防措施进一步增加了分割过程的耗时性。因此，提供一种更快速且变异性更小的分割策略至关重要。
SuRVoS 工作台通过向用户提供一系列机器学习和图像处理工具，帮助用户完成分割过程，同时引导用户完成必要步骤，从而开始解决上述问题。为实现这一目标，SuRVoS 将两项关键技术革新结合在一起。首先，它采用超区域层级结构，根据数据固有属性将相似且邻近的区域进行分组。该层级结构中的每个区域均以更少的元素表示相同体积的数据，同时仍保持对边界的高精度贴合。因此，超区域可将体数据分割的复杂性降低数个数量级，同时在不显著损失信息的前提下准确表征数据27。其次，SuRVoS 提供一种半自动分割策略，该策略仅需极少的手动分割输入即可训练分类器，随后利用该分类器对剩余体数据进行分割28,29。该策略减少了人工分割的工作量，显著降低了用户在分割任务上所需的时间；当结合使用超区域时，还可避免对边界的逐一手动勾画，从而可能降低分割结果的变异性与主观性。
SuRVoS 的另一个关键特性是标签分割工具，用户可利用该工具根据已分割对象的固有属性对其进行分类。在完成对各类感兴趣对象的分割后，可使用此工具依据平均对象强度、方差、大小、位置等参数将对象集合划分为不同的子类。 等等。 这对于分类具有高度复杂性的大量对象非常有用。例如，可将一组细胞器分为线粒体、空泡、脂滴等；或根据大小或形状对一组材料包涵体进行分离。分割完成后，可利用任意数量的分类器将各个标签进一步划分为不同组别，从而降低识别偏差。
SuRVoS 工作台已成功用于分割多种成像技术的数据。本文中，利用植物子实体的同步辐射X射线相位衬度断层扫描（microCT）数据，演示基于模型训练的分割方法；利用人血小板的冷冻电子断层扫描（cryoET）数据，演示基于超体素和巨体素的分割方法；利用哺乳动物细胞系的冷冻软X射线断层扫描（cryoSXT）数据，演示标签分割工具的使用。

<table><tbody><tr><td>计算机</td><td>无</td><td>无</td><td>必须运行 Linux 操作系统，并配备至少 4 GB 显存的 NVidia GPU</td></tr></tbody></table>

利用survos（超级区域体积分割）工作台对生物材料进行体积分割与分析

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

分割是指在成像体积中分离出特定区域或对象，以便对这些感兴趣区域进行进一步研究。在分析复杂的生物系统时，对三维图像数据进行分割是一项耗时且劳动密集型的工作。随着多种成像模态的普及以及自动化数据采集方案的发展，现代实验生物学家面临从数据向知识转化的更大挑战。本文介绍 SuRVoS Workbench 的使用方法，该程序旨在通过提供半自动分割复杂生物体数据的方法来解决上述问题。本文展示了三种不同放大倍数和成像模态的数据集，每种数据集突出了使用 SuRVoS 进行分割的不同策略。利用植物子实体的相衬X射线断层扫描（microCT）数据演示了基于模型训练的分割方法；利用人血小板的冷冻电子断层扫描（cryoET）数据演示了基于超体素（super-voxels）和巨体素（megavoxels）的分割方法；利用哺乳动物细胞系的冷冻软X射线断层扫描（cryoSXT）数据演示了标签分割工具的使用。同时提供了针对每种数据类型的策略与参数设置。SuRVoS 将多种半自动处理流程整合到一个交互式工具中，带来了多项优势。与许多图像处理领域常用的全手动分割方法相比，分割体数据的总时间可减少五倍。当完全手动分割可能需要数周工作时，这一效率提升具有重要意义。此外，通过采用计算识别的边界，并根据对象的计算属性而非逐个案例地拆分复杂对象集合，有效降低了人为主观性的影响。

来自多种成像技术的三维数据分割是分析复杂生物系统的主要瓶颈。本文中，我们以冷冻电子断层扫描、冷冻软X射线断层扫描和相衬X射线断层扫描技术的示例数据集为例，介绍如何利用SuRVoS Workbench在不同长度尺度上对体数据进行半自动分割。

利用SuRVoS（超级区域体积分割）工作台对生物材料进行体积分割与分析

分割是指在成像体积中分离出特定区域或物体的过程，以便对这些区域进行进一步研究。

本实验的总体目标是对具有生物特性的复杂三维体数据进行半自动分割。该方法通过实现对体数据的定性与定量分析，有助于解答结构生物学领域的关键科学问题。该技术的主要优势在于，尽管其可用于深入解析生物数据集，但也同样适用于材料科学等其他研究领域。该软件采用与分割程序不同的工作流程，初次使用SuRVoS时可能会造成一定的困难。因此，可视化演示对于理解这一新工作流程至关重要。本示例展示了利用模型训练对相位对比X射线断层扫描数据集中的大而结构清晰的区域进行分割的过程。开始此操作流程时，启动 SuRVoS 工作台。点击“打开数据集”按钮，在弹出的窗口中选择要进行分割的数据文件。为数据集选择合适的取向。接下来，选择一个用于存储工作区及相关文件的文件夹，然后点击“加载”按钮。在“选择感兴趣区域”选项卡中，输入感兴趣区域的 X、Y 和 Z 起始与结束坐标，然后点击“添加”。添加某个部分后，通过勾选右侧的复选框确保其已被选中。随后，在“功能通道”（Features Channels）选项卡中，使用下拉菜单选择一个功能并将其添加到队列中。根据该功能的具体要求修改相关选项，并选择要运行该功能的输入数据集。单击功能名称右侧的复选框以进行计算。同一数据集可运行多个功能，且已计算出的功能可作为输入数据集用于进一步处理。然后选择“超级区域”选项卡。在“超体素”部分，使用下拉菜单选择将用于生成超体素的已过滤数据集。设置形状、间距和紧凑度参数，然后单击“应用”按钮以生成超体素。为了评估超体素的质量，可单独显示超体素，不叠加原始数据。如果数据中感兴趣的目标特征在单独显示的超体素中仍然可见，则说明超体素较好地反映了原始数据。在“标注”选项卡中，单击“添加层级”按钮以增加一个标注层级。单击新创建层级中的“添加标签”按钮，为注释添加标签。接下来，在工具快捷方式部分，选择笔形图标。可视化窗格顶部将显示一组选项。选择超体素选项，并使用中等宽度的画笔开始为模型训练创建训练数据。点击标签信息最右侧的复选框以选择要标注的标签，然后在可视化窗格中点击并拖动鼠标来标注多个超体素。在“模型训练”选项卡中，将预测层级设置为包含手动训练标注的层级。然后在描述符部分，将区域设置为超体素。点击“选择源”下拉菜单，并勾选所需特征或滤波器的复选框，以选择用于区分数据区域的描述符。单击“预测”按钮。当计算完成后，可视化窗格将更新，显示每个未标记体素所属的注释标签的预测结果。在评估训练方法的效果并选择其中一种后，单击“优化”部分中的“优化”下拉菜单，以应用进一步的优化。在“更新注释”部分的模型训练标签页底部，确保可视化下拉菜单设置为“预测”。接下来，使用置信度滑块将更多或更少的未注释超体素分配给选定的注释标签。在选择合适的置信度水平后，点击置信度工具底部各标签旁的“保存”按钮，将预测结果保存到特定标签中。可视化窗格将更新以反映所做的更改。如有必要，重复进行模型训练，结合进一步优化和高置信度预测，直至几乎不存在或完全没有未标记的超体素。使用超区域对更小且更复杂的区域进行分割的方法，已在冷冻电子断层扫描数据集上得到演示。在注释标签中添加适当的层级和标签后，选择该标签。使用中等宽度的笔触，并在选中超体素的情况下开始注释。一种超区域分割的策略是：先在某一层面快速进行分割，然后向上或向下移动几个层面，在新层面上填补间隙。通过这种方式，用户只需较少的操作即可完成对中间切片的标注。接下来，为了进一步优化标注结果，选择分割标签及一种形态学优化方法，输入半径值，并选择应用优化方法的方式。然后点击“Refine”。数据对象的分类与分析在一套冷冻软X射线断层成像数据集上进行演示。完成数据的完整分割后，点击可视化面板中的第二个标签页，名为 Label Splitter。窗口右侧将新增一个区域，即规则创建窗格。在规则创建窗格的顶部，选择用于标签拆分的层级和标签。接下来，选择要查询的数据集，然后点击“Label”（标签）。在可视化窗格中，所选标签中的每个对象现在将被分别用蓝色轮廓标出。规则创建窗格中现在将显示一个图表，展示这些对象的平均强度。单击右上角的下拉框，以更改当前显示的测量指标。接下来，在规则创建窗格底部点击“添加新标签”，开始将对象划分为相应的类别。点击“添加新规则”，使用下拉菜单和自由输入框定义要应用的规则。点击“应用”以在可视化窗格以及规则创建窗格的图表中查看新规则的效果。在对所有目标对象完成分类后，进入“注释”选项卡。创建一个新的空层级，然后在规则创建选项卡中选择该新层级，并点击“保存标签”。单击可视化窗格边缘的“标签统计”选项卡，打开一个新的可视化窗格，用于理解对象类别之间的关系。在顶部，选择适当的层级、标签和待查询的数据集。然后通过勾选其旁边的复选框，选择若干感兴趣的度量指标。单击标签可为每个选定的指标生成成对比较图。如需添加或移除某个指标，请勾选相应的复选框，然后单击“更新图表”。本研究展示了 SuRVoS 工作台中的两种分割策略和一种分类工具。对于模型训练，需加载一个具有区域界定边界的相对高对比度数据集。对该数据进行滤波和钳制处理，以增强背景、前景和内部结构的可区分性。随后，在滤波后的数据集基础上构建超体素（super voxels）。在评估超体素的质量后，通过人工标注来训练分类器，以预测背景、果实刚毛、种子物质以及周围果肉所对应的区域。采用形态学优化方法填充孔洞，以优化分割结果。对于超区域分割，需加载一个噪声较多且复杂的图像数据集。接下来，对选定的兴趣区域应用适当的滤波器组。在模型训练和分割完成后，每隔5到10个切片进行一次快速的手动标注，以选择描述目标特征的超体素。随后，通过包含多种不同细胞器的数据集演示标签分割过程。首先，使用适当的全变分滤波器来增强细胞器的边界。采用超体素和巨体素对细胞器进行半自动分割，并通过优化来填充孔洞并平滑边缘。利用标签分割器将数据集中的每个细胞器显示为独立对象，然后在数据图中可视化各个对象的多种特征。在此，根据细胞器的固有属性（例如其大小或平均强度）制定了规则，以将它们划分为五个不同的类别。可以使用标签分割工具输出有关数据的定量信息，并开始理解细胞的背景环境。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用 SuRVoS 工作台进行半自动分割。通过使用该方法，可以对多种生物学状态进行比较，以回答相关科学问题，例如关于野生型、疾病状态以及经治疗条件下的差异。一旦掌握，若操作得当，该技术可使分割过程的速度提高约五倍。完成该步骤后，可利用可视化软件对结果进行渲染，用于发表文章或制作动画视频。

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科研

JoVE Journal

Biology

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