Name: 非侵入性 体内生物发光系统检测小鼠宿主肠出血性大肠杆菌的定植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: 了解利用非侵入性体内生物发光成像系统检测小鼠肠道出血性大肠杆菌定植的方法。该技术可在不牺牲动物的情况下实时监测EHEC病原性研究中的细菌定植动态。

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我们感谢中国台湾台南市奇美医学中心医学研究部陈其忠（Chi-Chung Chen）在小鼠感染实验方面的帮助，以及国立成功大学实验动物中心的支持。本研究由台湾科技部（MOST）资助（项目编号：MOST 104-2321-B-006-019、105-2321-B-006-011 和 106-2321-B-006-005）给 CC 的经费支持。

注意：根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的生物安全指南（https://www.cdc.gov/），肠出血性大肠杆菌 O157:H7 属于生物安全二级（BSL-2）病原体。因此，所有涉及 EHEC 的实验操作必须在 BSL-2 实验室中进行。实验过程中需穿戴实验服和手套，并在经认证的生物安全柜（BSC）内操作。实验开始前和结束后，须使用 70% 乙醇对实验台面进行消毒。所有接触（或可能接触）EHEC 的仪器或设备均应使用 70% 乙醇或漂白剂进行消毒。被污染（或可能被污染）的废弃物应密封后仔细进行高压灭菌处理。必要时，应佩戴口罩、护目用具、双层手套或连体防护服。6 周龄的 C57BL/6 雌性小鼠购自国立成功大学（NCKU）实验动物中心，并在该中心饲养。动物实验已获得国立成功大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准（批准编号 104-039）。
1. 生物荧光素酶标记的肠出血性大肠杆菌（EHEC）细菌的制备
<ol>
	<li>混合 50 ng 脱氧核糖核酸（DNA）、各 1 μL 的 10 μM 正向引物和反向引物、2 μL 2.5 mM 脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、2 μL 10x&#160;缓冲液，0.2 μL DNA聚合酶，以及无菌双蒸水（ddH2O) 加至终体积为 20 μL，以扩增抗卡那霉素盒， nptII 基因24DNA模板来自pBSL18024，购自国家生物资源项目（National BioResource Project, NBRP）。PCR 反应条件列于 表1 引物序列可在 表 2.</li>
	<li>按照试剂盒说明书将PCR产物连接至商用克隆载体（参见 材料表).</li>
	<li>切除 nptII 通过克隆载体获取基因片段 NsiI 和 SmaI 并克隆到经相应限制性内切酶消化的 pBBR1MCS4 中 NsiI 和 ScaI 来自 pAKlux29 以构建卡那霉素抗性质粒 pWF27813.</li>
	<li>切除 luxCDABE 操纵子，来自表达荧光素酶的质粒9，pAKlux2，通过 SpeI-HF 和 ScaI 并克隆至 SpeI-HF 和 SmaI 将pWF278进行消化，以生成卡那霉素抗性且表达荧光素酶的质粒pWF27913. 
	注意：质粒提取和切胶回收分别使用商品化的质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒。酶切反应中，将100 ng DNA与1 μL 10x缓冲液混合&#160;缓冲液，每种选定的限制性内切酶各1 μL，以及无菌ddH₂O2加水至终体积为10 μL，37 °C孵育2.5 - 3小时。</li>
	<li>将 pWF279 质粒转化至 E. coli O157:H7 EDL933 感受态细胞通过电穿孔在 2,500 V 条件下处理 4 ms。</li>
	<li>将转化后的细菌细胞在1 mL LB（Luria-Bertani）培养基中于37 °C孵育1小时。</li>
	<li>在含有50 µg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，于37 °C培养16–18小时，接种细菌。</li>
	<li>通过平板的生物发光信号进行检测 体内 成像仪的第二天，从平板上挑取单菌落，接种于3 mL LB培养基中，加入50 µg/mL卡那霉素，37 °C培养16–18 h。</li>
	<li>通过将100%甘油稀释于无菌ddH₂O中制备细菌保存培养基2O 以配制30%甘油溶液。</li>
	<li>冷冻卡那霉素抗性菌株 E. coli 含荧光素酶质粒的 O157:H7 EDL933 菌株作为菌种保存于螺口冻存管中，其中细菌培养物与 30% 甘油溶液按 1:1 比例混合，于 -80 °C 保存。甘油终浓度为 15%。</li>
</ol>
2. 用于口服接种的生物发光EHEC细菌制备
注意：为便于实验准备，大肠杆菌 O157:H7（EHEC）制备及小鼠口服灌胃实验操作的时间流程图见图1。
<ol>
	<li>从-80 °C保存的菌种中挑取含有荧光素酶质粒的E. coli O157:H7 EDL933菌株，划线接种于含50 µg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，在37 °C培养16–18小时。</li>
	<li>从过夜培养的平板上挑取单菌落，接种于3 mL含50 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37 °C、220 rpm条件下振荡培养16–18小时。</li>
	<li>将菌液按1:100比例转接至含卡那霉素（50 µg/mL）的LB液体培养基中，在37 °C、200 rpm条件下继续培养2.5–3小时。（例如，将2 mL过夜培养的菌液加入200 mL含卡那霉素（50 µg/mL）的LB培养基中。）</li>
	<li>继续培养2.5–3小时，测定600 nm波长下的光密度值（OD600），直至OD值达到0.9至1.0之间。此时菌液浓度约为108菌落形成单位（CFU）/mL。</li>
	<li>将重培养的菌液在4 °C条件下以8,000 × g离心30分钟。</li>
	<li>弃去上清液，注意避免扰动菌体沉淀，用100 mL 0.9%无菌生理盐水轻轻振荡洗涤沉淀。</li>
	<li>重复步骤2.5和2.6一次。</li>
	<li>洗涤完成后，再次于4 °C以8,000 × g离心30分钟，轻柔弃去上清液。</li>
	<li>用0.9%无菌生理盐水将菌体沉淀浓缩100倍。例如，若离心前菌液体积为200 mL，则加入2 mL生理盐水重悬菌体沉淀。</li>
	<li>通过10倍系列稀释法涂布浓缩菌液，测定细菌CFU数量（浓缩后应约为109 CFU/100 μL）。25</li>
</ol>
3. 小鼠口服灌胃 EHEC
<ol>
	<li>用链霉素水（5 g/L）处理6周龄雌性C57BL/6小鼠，持续24小时。</li>
	<li>24小时后，更换为普通饮用水，再持续24小时，之后进行灌胃。在给予普通水处理24小时后，小鼠即可进行EHEC口服灌胃。</li>
	<li>通过拉动活塞，用100 μL EHEC菌液填充注射器。确保注射器内无气泡。用手指轻弹注射器以去除气泡。</li>
	<li>轻柔地提起动物，并小心地将其放置于笼顶。</li>
	<li>小心抓住小鼠尾巴，动物会抓紧笼顶并试图移动离开。</li>
	<li>用拇指和食指轻轻抓住动物颈背部的松弛皮肤，以固定小鼠头部，防止其移动。</li>
	<li>将小鼠保持垂直姿势，以便插入灌胃针，并确保小鼠头部固定且处于垂直位置。</li>
	<li>将灌胃针沿小鼠口腔顶部插入，顺势进入食管并朝向胃部推进。</li>
	<li>当灌胃针插入深度达到小鼠体长的一半或三分之二时，注入含有约109 CFU细胞的100 μL EHEC菌液。</li>
</ol>
4. 可视化
<ol>
	<li>灌胃后第1天和第2天检测生物发光信号。</li>
	<li>在检测动物的生物发光信号之前，将动物置于含2.5%异氟烷和1.5 L/min氧气的麻醉 chamber 中进行麻醉。</li>
	<li>等待2 - 5分钟，直至所有小鼠失去意识且不再活动。动物已准备好进行下一步操作。 体内 生物发光的检测</li>
	<li>通过生物发光成像系统检测并成像动物的生物发光信号 体内 成像系统。请参见第5节 &#34;数据采集&#34; 用于软件操作。成像过程中，所有动物均持续接受2.5%异氟烷与1.5 L/min氧气的供应。
	<ol>
		<li>点击文件&#62;活体，并手动对小鼠进行聚焦。</li>
		<li>选择曝光时间和激光强度。</li>
		<li>点击采集&#62;捕获</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于 离体 成像：通过颈椎脱位处死小鼠，取出感染小鼠的整个肠道。将肠道置于9 cm培养皿中，进行成像 体内 成像系统。设置与前者相同 体内 成像时视野设置为A/B。请参见第5节 &#34;数据采集&#34; 详情请见。 
	注意：颈椎脱位操作方法：用一只手抓住小鼠尾巴，将其固定在笼子顶部，使动物能够抓紧笼子。用另一只手的拇指和食指或一支记号笔抵住小鼠头骨基部后颈部位置。在固定头部的同时，用抵住颈部的手或物体迅速向前推动，并用握住尾巴的手向后拉动。 
	仔细检查以确认呼吸停止且无心跳。</li>
</ol>
5. 数据采集
注意：数据采集所用软件列于材料表中。
<ol>
	<li>进行图像采集时，打开软件的采集控制面板（图2).</li>
	<li>选择 &#34;发光的，&#34; &#34;照片， &#34;覆盖&#34;</li>
	<li>设置曝光时间 &#34;自动。&#34; 将Binning设置为 &#34;培养基&#34;</li>
	<li>将光圈值设为：生物发光成像时为 ƒ/1，拍照时为 ƒ/8。光圈值控制 CCD 检测器接收到的光量。</li>
	<li>根据需要采集的图像区域设置视野。选项 &#34;D&#34; 可同时容纳五只6周龄小鼠并进行成像。 &#34;C&#34; 可在同一视野中对三只六周龄的小鼠进行成像。</li>
	<li>一旦小鼠/样品准备好进行成像，点击 &#34;获取&#34; 用于图像采集。</li>
	<li>打开已获取的图像数据。</li>
	<li>打开工具面板（图3).</li>
	<li>选择 ROI 工具。我们建议使用圆形工具（最左侧的工具）来圈定图像上的生物发光区域（图4).</li>
	<li>点击 &#34;测量感兴趣区域&#34; （铅笔图标）用于测量表面生物发光强度（图3）。ROI 测量面板和量化数值将出现（图5).</li>
	<li>使用 ROI 测量面板左上角的“配置测量”来选择所需的数值/信息（图6），否则点击 &#34;导出&#34; 导出此数据表并保存为 .csv 文件（图5).</li>
	<li>使用该列的数值 &#34;总通量（p/s）&#34; 作为.csv文件中生物发光强度的定量结果。</li>
</ol>

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<li>Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M. II, Peterson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+new+derivatives+of+the+broad-host-range+cloning+vector+pBBR1MCS%2C+carrying+different+antibiotic-resistance+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.</a> Gene. 166 (1), 175-176 (1995).</li>
<li>Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Plasmid+Maintenance+in+the+Attenuated+Live+Vector+Vaccine+Strain+Salmonella+typhiCVD+908-htrA%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA.</a> Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).</li>
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<li>Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+%28EHEC%29+infection+and+hemolytic+uremic+syndrome+%28HUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS).</a> BMC Med. 10, (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

已有报道称，携带荧光素酶质粒的肠出血性大肠杆菌（EHEC）已被用于研究其在宿主中的定植位置或体内基因表达in vivo8,11,12。本文所述的小鼠模型也已被用于检测EHEC在小鼠宿主体内的定植时间和位置8。然而，我们提供了经口胃灌注接种EHEC至小鼠的详细操作步骤，以及如何仔细准备用于口服灌胃的生物发光细菌。值得注意的是，在对小鼠进行EHEC口服灌胃（步骤3.7）时，当插入灌胃针头时，小鼠头部的位置至关重要。如果头部位置不垂直，将难以顺利插入针头，并可能造成小鼠损伤。在步骤3.8中，当灌胃针头进入小鼠口腔时，舌头会轻微伸出嘴外。若在将灌胃针头送入食道过程中遇到阻力，应立即停止前进并迅速撤回针头，调整针头位置以确保其进入食道。若遇到阻力，针头可能误入气管，导致细菌被注入肺部而非胃中。
绿色荧光蛋白（GFP）作为生物传感器在生物学实验...

肠出血性大肠杆菌 O157:H7 是一种通过受污染的水或食物引起腹泻1、溶血性综合征（HS）2、溶血性尿毒综合征（HUS）3，甚至急性肾功能衰竭4的病原体。EHEC 是一种致病性肠杆菌，可在人类胃肠道中定植1。当 EHEC 首次黏附于宿主肠上皮细胞时，会通过作为分子注射器的 III 型分泌系统（T3SS）将定植因子注入宿主细胞，从而诱导形成黏附和抹除（A/E）病灶，以增强其黏附（定植）能力5。参与 A/E 病灶形成的基因由肠细胞抹除位点（LEE）致病岛编码5。
生物发光是一种产生光的化学反应，其中荧光素酶催化其底物荧光素生成可见光6。该酶促过程通常需要氧气或三磷酸腺苷（ATP）的存在6。生物发光成像（BLI）使研究人员能够在活体动物中可视化并定量分析宿主与病原体之间的相互作用7。通过追踪发光细菌在活体动物体内迁移并侵入不同组织的过程，BLI可表征细菌感染的整个周期7，从而揭示感染的动态进展。此外，动物体内的细菌载量与生物发光信号相关8；因此，该信号可作为一种简便而直接的指标，用于评估实验动物的病理状况。
此处使用的质粒含有来自发光杆菌 Photorhabdus luminescens 的荧光素酶操纵子 luxCDABE，该操纵子可编码其自身的荧光素酶底物7,9。通过将这种表达荧光素酶的质粒转化到细菌中，可在活体动物中通过观察这些生物发光细菌来监测定植和感染过程。总体而言，生物发光成像（BLI）及生物发光标记细菌使研究人员能够监测细菌数量与位置、在抗生素或治疗干预下的细菌活力，以及在感染或定植过程中的细菌基因表达6,7。已有大量研究报道，多种致病性细菌被改造以表达 luxCDABE 操纵子，用于研究其感染周期和/或在感染状态下的基因表达。这些细菌包括尿路致病性 E. coli10、肠出血性大肠杆菌（EHEC）8,11,12,13、肠致病性 E. coli（EPEC）8、Citrobacter rodentium14,15、Salmonella typhimurium16、Listeria monocytogenes17、Yersinia enterocolitica18,19、以及 Vibrio cholerae20，均已见文献记载。
已开发出多种实验模型以促进对肠出血性大肠杆菌定植的研究 体外 和 体内21,22,23然而，目前缺乏可用于研究EHEC定植的合适动物模型 体内，从而导致细节信息匮乏。为促进对EHEC定植机制的研究 体内建立动物模型，以非侵入性方法在活体动物中观察和定量肠出血性大肠杆菌（EHEC）的定植情况，具有重要价值。
本论文描述了一种利用生物发光表达系统在活体宿主中实时监测肠出血性大肠杆菌（EHEC）定植的小鼠模型。通过胃内接种将带有生物发光标记的EHEC注入小鼠体内，并采用非侵入性方法在小鼠中检测生物发光信号。 体内 成像系统13感染了生物发光标记的EHEC的小鼠在感染后2天，其肠道内显示出显著的生物发光信号，表明这些细菌在感染后2天已定植于宿主肠道内。 离体 影像数据显示，这种定植特异性地发生在小鼠的盲肠和结肠中。利用该小鼠-EHEC模型，可通过活体成像在活体宿主中检测到生物发光的EHEC定植情况 在体 成像系统，用于研究肠道细菌定植的详细机制，这可能促进对肠出血性大肠杆菌（EHEC）诱导的生理和病理变化的进一步理解。

<table><tbody><tr><td>摇床培养箱</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>细菌培养&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>轨道式摇床培养箱</td><td>FIRSTEK</td><td>S300</td><td>细菌培养&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pBSL180</td><td></td><td></td><td>nptII基因来源</td></tr><tr><td>pAKlux2</td><td></td><td></td><td>luxCDABE操纵子来源</td></tr><tr><td>T&amp;A克隆试剂盒</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYC001-20P</td><td>用于TA克隆&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nsi&lt;/em&gt; I</td><td>NEB</td><td>R0127S</td><td>用于质粒克隆&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sca&lt;/em&gt; I</td><td>NEB</td><td>R0122S</td><td>用于质粒克隆&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt; I-HF</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td>用于质粒克隆&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sma&lt;/em&gt; I&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td>用于质粒克隆&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T4连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>用于质粒克隆&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>用于PCR扩增</td></tr><tr><td>10X Ex Taq缓冲液</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>用于PCR扩增</td></tr><tr><td>dNTP混合物&amp;nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>用于PCR扩增</td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>2720 thermal cycler&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;用于PCR扩增</td></tr><tr><td>甘油</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>用于制备细菌保存液</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434-5KG-R</td><td>配制LB培养基用化学试剂，10 g/L</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1612.00</td><td>配制LB培养基用化学试剂，10 g/L</td></tr><tr><td>酵母提取物粉末</td><td>Affymetrix</td><td>23547-1 KG</td><td>配制LB培养基用化学试剂，5 g/L</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1802.00</td><td>配制LB琼脂用化学试剂</td></tr><tr><td>卡那霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>K4000-5G</td><td>抗生素，用于筛选</td></tr><tr><td>链霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6501-100G</td><td>抗生素，用于清除小鼠肠道微生物群</td></tr><tr><td>EDL933感受态细胞</td><td>自制</td><td></td><td>制备方法见补充文件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>MicroPulser</td><td></td><td>用于电穿孔</td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>Gene Pulser/MicroPulser</td><td>1652086</td><td>用于电穿孔</td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti, J-26S XP</td><td>用于细菌离心&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>固定角转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>用于细菌离心&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>固定角转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA10.5</td><td>用于细菌离心&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心瓶</td><td>Beckman Coulter</td><td>REF357003</td><td>用于细菌离心&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心瓶</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>3141-0500</td><td>用于细菌离心&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>eppendorf biophotometer plus&amp;nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>AG 22331 hamburg</td><td>用于测定细菌OD600值</td></tr><tr><td>C57BL/6小鼠&amp;nbsp;</td><td>国立成功大学实验动物中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验服、手套</td><td></td><td></td><td>用于人员防护&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异氟烷&amp;nbsp;</td><td>Panion &amp; BF Biotech Inc.</td><td>G-8669</td><td>用于小鼠麻醉，药用级</td></tr><tr><td>1 ml注射器&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>用于小鼠灌胃</td></tr><tr><td>可重复使用22 G球头饲管针</td><td></td><td>&amp;phi;0.9 mm X L 50 mm</td><td>用于小鼠灌胃</td></tr><tr><td>手术剪&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>用于小鼠实验</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVIS spectrum</td><td>用于生物发光图像采集&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image软件</td><td>Perkin Elmer</td><td>version 4.1</td><td>用于图像数据定量分析</td></tr></tbody></table>

检测小鼠体内肠出血性escherichia coli定植的非侵入性体内生物发光系统

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

肠出血性 E. coli (EHEC) O157:H7 是一种食源性病原体，可引起腹泻、出血性结肠炎（HS）和溶血性尿毒综合征（HUS），并定植于人类肠道。为研究 EHEC 定植的详细机制 体内 建立动物模型以监测和量化肠出血性大肠杆菌（EHEC）的定植至关重要。本文展示了一种小鼠-EHEC定植模型，通过将表达生物发光的质粒转化至EHEC中，从而在活体宿主体内实时监测和量化EHEC的定植情况。接种了生物发光标记EHEC的动物，通过非侵入性检测可观察到小鼠体内强烈的生物发光信号。 体内 成像系统。感染后1天和2天，仍可在感染动物体内检测到生物发光信号，表明肠出血性大肠杆菌（EHEC）在宿主体内定植至少2天。我们还证实，这些发光的EHEC定位于小鼠肠道，特别是盲肠和结肠区域，从 离体 图像。这种小鼠-EHEC定植模型可作为推动当前对EHEC定植机制认知的工具。

我们给予生物发光标记的EHEC（约109 将表达荧光素酶的细菌细胞通过口服灌胃的方式给予6周龄雌性C57BL/6小鼠。在小鼠口服接种EHEC后1小时内，通过活体成像系统检测动物的生物发光信号。 体内 成像系统，如图所示 图7结果显示，经灌胃感染表达生物发光标记的EHEC小鼠体内出现强烈的生物发光信号。我们在感染后第2天检测了信号。如图所示 图8A接种了表达生物发光标记的野生型EHEC EDL933的小鼠，在感染后第2天仍显示出强烈的生物发光信号，表明EHEC已在宿主体内定植。我们还通过胃内感染的方式接种了表达生物发光标记的EDL933ΔrfaD (ΔrfaD) 小鼠（图8A）。该突变体在脂多糖（LPS）合成上存在缺陷，我们先前的研究已表明其可降低在宿主中的定植能力。如图所示 图8A</strong...

一种用于肠出血性大肠杆菌感染的 小鼠模型的详细实验方案 E. coli 使用生物发光标记细菌来研究肠出血性大肠杆菌（EHEC）定植的方法被展示。通过非侵入性方式检测这些生物发光细菌 体内 活体动物成像系统可促进我们对产志贺毒素大肠杆菌定植过程的现有认知。

检测小鼠体内肠出血性Escherichia coli定植的非侵入性体内生物发光系统

肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7 是一种食源性病原体，可引起腹泻、出血性结肠炎（HS）和溶血性尿毒综合征……

本实验的总体目标是利用非侵入性活体成像系统检测小鼠体内肠出血性大肠杆菌（E.coli）的定植情况。该方法有助于解答肠出血性大肠杆菌致病性研究领域中的关键问题，例如细菌定植过程。该技术的主要优势在于，无需处死动物即可在活体动物中检测EHEC的定植情况。首先，将含有荧光素酶质粒的 E.coli O157:H7 EDL933 菌株的 -80 摄氏度保存菌种在添加了 50 微克/毫升卡那霉素的 LB 琼脂平板上划线。在 37 摄氏度下培养细菌 16 至 18 小时。从过夜培养的平板上挑取单个菌落，接种于 3 毫升含有 50 微克/毫升卡那霉素的 LB 培养基中。然后，在37°C、220 rpm条件下培养过夜，时间为16至18小时。次日，取两毫升过夜培养物进行1:100稀释，接种于含卡那霉素的200毫升LB培养基中。在37°C、200 rpm条件下培养2.5至3小时，或直至600纳米处的光密度值达到0.9至1.0之间。接下来，将重新培养的细菌在8000 × g、4 °C条件下离心30分钟。弃去上清液，注意不要扰动沉淀，然后用100 mL 0.9%无菌生理盐水轻轻振荡洗涤细菌。洗涤后，再次离心细菌培养物，并轻轻弃去上清液。然后，使用0.9%无菌生理盐水将沉淀物浓缩100倍。根据文本方案，用链霉素水处理小鼠24小时后，用100 µL EHEC细菌悬液填充注射器。轻轻提起动物，小心将其放置于笼顶。然后，轻轻抓住小鼠的尾巴，使动物能够抓住笼子顶部并试图逃离。用拇指和食指轻轻固定小鼠颈部和背部的松弛皮肤，以防止其头部移动。接着，将小鼠保持在垂直位置，并确保其头部在此位置上保持固定不动。将灌胃针沿动物口腔上颚插入，并向下进入食道，直至胃部。当针头插入小鼠体内约一半至三分之二深度时，注入100 µL含有约10⁹ CFU细胞的EHEC细菌。根据正文方案观察到生物发光细胞后，打开软件的采集控制面板。选择发光、拍照和叠加图像。将曝光时间设为自动，然后将 binning 设为中等。将光圈值设为1以进行发光成像，设为8以进行拍照。光圈值控制CCD检测器接收到的光量。待小鼠样本准备就绪后，点击“采集”以获取图像。打开获取的图像数据，然后打开工具面板。选择感兴趣区域（ROI）工具，例如圆形工具，以在图像上定义生物发光区域。接下来，使用铅笔图标，点击“测量ROI”以测量表面生物发光强度。ROI测量面板及定量数值将显示出来。然后，在ROI测量面板的左上角，使用“配置测量”功能选择所需的数值/信息。否则，可点击“导出”以导出此数据表，并将其保存为csv文件。最后，使用 csv 文件中总通量（p/s）列的数值作为生物发光强度的定量依据。如本图所示，经口灌胃接种生物发光标记的 EHEC 后，小鼠体内观察到强烈的生物发光信号。在本图中，接种了生物发光标记的野生型 EHEC EDL933 的小鼠在感染后两天仍显示出强烈的生物发光信号，表明 EHEC 已在两天内定植宿主。然而，感染了脂多糖存在缺陷的突变型大肠杆菌的小鼠未表现出生物发光，表明这些小鼠体内定植的细菌数量减少或未能定植。为了定位表达生物发光标记的细菌，对处死动物的肠道进行离体成像。感染了生物发光标记EHEC的小鼠器官显示，盲肠和结肠部位有显著的生物发光信号，表明细菌在这些器官中发生了定植。相比之下，感染LPS突变株的小鼠肠道组织中生物发光强度降低，这与活体成像结果一致。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用IVIS系统开展实验，以监测EHEC在小鼠体内的定植情况。

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Immunology and Infection

免疫学与感染

非侵入性 体内生物发光系统检测小鼠宿主肠出血性大肠杆菌的定植

本文描述了在活体动物中进行细菌感染生物发光成像的方法。通过改造病原体使其表达荧光素酶，从而实现对活体动物体内感染的光学整体成像。可利用表达荧光素酶的病原体感染动物模型，并通过生物发光成像实时观察疾病的发展过程。...

利用荧光素酶对小鼠细菌感染进行成像

本文介绍了将携带lux标记的细菌给予小鼠，并随后使用IVIS生物发光成像进行活体分析的方法。...

活体生物发光细菌成像 In Vivo

来源： Valentine, M. E., 等 框内基因缺失突变体的构建 铜绿假单胞菌 并在简单的小鼠感染模型中检测毒力减弱情况。 J. Vis. Exp.

利用生物发光技术追踪小鼠体内细菌感染动态

来源： Kuo, C., 等. 肠出血性大肠杆菌的检测 大肠杆菌 小鼠宿主中非侵入性定植 体内 生物发光系统 视频实验杂志 (2018)本视频演示了如何从冻存菌种制备表达荧光素酶的肠出血性 Escherichia coli...

制备生物发光的肠出血性 Escherichia coli 接种物

来源：de Vries, C. R., et al., 一种迟发接种的慢性Pseudomonas aeruginosa伤口感染模型。J. Vis. Exp. (2020)。本视频展示了一种生物发光成像技术，用于监测活体小鼠模型中细菌感染的进展。携带 luxABCDE...

小鼠细菌感染的生物发光成像

来源：Seman, B. G., et al. 一种革兰氏阴性菌败血症的新生儿成像模型。J. Vis. Exp.

使用包被的生物发光细菌建立新生小鼠感染模型

来源： Valentine, M. E. 等人，框内基因缺失突变体的构建 铜绿假单胞菌 并在简单的感染小鼠模型中检测毒力减弱情况。 J. Vis. Exp.

利用生物发光技术在小鼠模型中对细菌感染进行实时成像

来源：Luyts, N., et al. 利用生物发光成像对小鼠尿路感染及其治疗进行纵向随访。J. Vis. Exp. (2021)。本视频展示了利用生物发光的E.

利用生物发光技术在小鼠模型中可视化尿路感染

多模态成像是研究小动物模型中细菌定植的一种有价值的方法。本方案概述了用生物发光的鼠柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）感染小鼠，并利用融合三维漫射光成像断层扫描与μCT成像技术对细菌定植进行长期监测，从而生成鼠柠檬酸杆菌（C.

4D 多模态成像 鼠伤寒柠檬酸杆菌 小鼠感染

本论文描述了通过膀胱内给予携带lux操纵子的尿路致病菌以在小鼠中诱导尿路感染，并利用生物发光成像对细菌载量进行后续的纵向体内分析。...

利用生物发光成像对小鼠尿路感染及其治疗进行纵向随访

建立小鼠阴道上行感染、早产及新生儿发病模型

了解利用非侵入性体内生物发光成像系统检测小鼠肠道出血性大肠杆菌定植的方法。该技术可在不牺牲动物的情况下实时监测EHEC病原性研究中的细菌定植动态。

检测小鼠体内肠出血性Escherichia coli定植的非侵入性体内生物发光系统

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